2段階PCRと次世代16S rRNA遺伝子シーケンシングを用いての微生物叢解析

マイクロバイオームのプロファイリングは、健康と病気におけるマイクロバイオームの役割を定義するための第一歩です。ここでは、16SR RNAおよびメタゲノムシーケンシングおよびマイクロバイオームデータ解析を行い、便質のサンプル調製ライブラリーから高品質の細菌DNAを単離するための簡単な手順を説明する。このプロトコルは、マイクロバイオーム分野に新しい研究者だけでなく、彼らの研究室でマイクロバイオームパイプラインを確立する上でマイクロバイオーム分野で働く研究者を支援します。このプロトコルは、動物およびヒトの被験者の鼻、経口、または皮膚サンプルなどの他の生物標本からのマイクロバイオームのプロファイリングのために拡張することができる。ビードピッキングは、すべての下流ステップが高品質のDNAに依存するので、最も重要なステップです。保存プレートの適切なシールは、不完全なシールが増幅された製品の圧迫につながる可能性があるため、低品質のシーケンシングデータをもたらす可能性があるため重要です。まず、70%エタノールで仕切り箱を殺菌します。マウスを滅菌した仕切り箱に入れ、最大1時間正常に排便できるようにします。無菌鉗子を使用して、空の事前ラベル付けされた1.5ミリリットルマイクロ遠心分離管に便ペレットを収集します。チューブをしっかりと閉じます。各マウスからフェースを採取した後、70%エタノールで鉗子を殺菌し、続いて殺菌用の拭き取りを行う。200ミリグラムの送気用ペレットを1.5ミリリットルのマイクロ遠心分離チューブに、0.1ミリリットルのガラスビーズで計量し、ビーズチューブをビードビートホモジナイザーに入れ、室温で45秒間、毎秒4.5メートルの速度でサンプルを均質化します。キットメーカーの指示に従ってDNAを抽出し、1.5ミリリットルマイクロ遠心分離チューブにDNAを溶出します。DNAを単離した後、1マイクロリットルのDNAをフルオメーターにロードして単離したDNAを定量化する。96ウェルPCRプレートに16SリボソームRNA遺伝子増幅PCR1を、25マイクロリットルの反応量を用いた。マルチチャネルピペットを使用して、40ナノグラムのDNA、13.5マイクロリットルの2X高忠実度ポリメラーゼ酵素ミックスを加え、バッファーを含み、さらに前方および逆プライマーにDMPを加えます。PCR プレートを 4 つのエッジすべてに沿って上から下に適切にシールします。そして20時に1000倍Gで遠心分離機