超音波誘発薬物放出のための蛍光標識マイクロバブルの特性評価のためのマルチタイムスケール顕微鏡法

このプロトコルは、活性化メカニズムとバイオエフェクトを含む超音波誘発薬物送達アプリケーション用に設計された蛍光標識マイクロバブルの応答を特徴付けるために使用することができます。重要なのは、異なる空間スケールと異なる時間スケールの両方で、気泡で超音波引き起こされる薬物送達のマルチスケールの問題を解明することを可能にするイメージング技術の組み合わせにあります。ブライトフィールド顕微鏡による単一の気泡イメージングの場合、19ゲージの通気針を配置し、19ゲージ針を装備した1ミリリットルのシリンジを使用して、ガラスバイアルから小さなチューブに微小気泡懸濁液を少量取り出し、次のステップでピペットを簡単にします。

ピペットを使用して、濾過されたリン酸緩衝生理食塩水中のマイクロバブル溶液を希釈する。10ミリリットルのシリンジを使用して、ホルダーが気泡を作成せずにいっぱいになるまでサンプルホルダーの1つの出口にサンプルを注入し、必要に応じてサンプルの多くを注入します。サンプルホルダーの両弁を閉じ、サンプルホルダーを顕微鏡の光軸に垂直に配置します。

サンプル分析の前に、任意波形発生器に所望の超音波駆動周波数と音響圧力を設定し、サンプルホルダーの一角の視野から始めて、XYZステージを使用して、顕微鏡の視野内の単一のマイクロバブルを見つけるためにホルダーを移動させ、次に、水浴に接続された光ファイバーをストロボライトに取り付けて記録を開始します。超音波設定ごとに必要な回数だけイメージングを繰り返し、サンプルホルダーを少なくとも2ミリメートル移動して、各分析に対して未超音波マイクロバブルを含む視野に移動します。マイクロバブルの蛍光顕微鏡イメージングでは、示されているようにリン酸緩衝生理食塩水中のマイクロバブル溶液を希釈した後、任意の波形発生器に所望の超音波駆動周波数と音響圧力を設定し、マイクロバブルからのナノ粒子の蛍光励起のためのパルス遅延発生器のレーザーのトリガー遅延を設定し、XYZステージを使用してサンプルホルダーを移動してマイクロバブルの単一バブルを特定し、その後、それらを単一のバブルに持ち込む 目的を選択し、記録をトリガーします。

超音波設定を変更し、サンプルホルダーを新しい視野に移動することにより、必要に応じてイメージングを繰り返します。生体内顕微鏡によるイメージングの場合、まず、XY位置決め段階で加熱された動物ホルダーを、ウェーブガイドと目的との間に配置し、波導路にカップリングゲルを追加します。麻酔付き腫瘍軸マウスの尾静脈に尾静脈カテーテルを挿入し、加熱されたホルダーに窓チャンバーを取り付けたマウスを置きます。

カバースリップに水滴を加えます。腫瘍組織血管系を可視化するために、1ミリリットル当たり30マイクログラムの4ミリグラムを、2メガダルトンデキストランを尾静脈カテーテルに静脈内に注入し、XY翻訳段階を使用して、適切な血管を有する視野が見つかるまでマウスを移動させる。実験のパラメータに応じてフレームレート、視野、記録の長さを調整し、船舶のベースライン画像を記録します。

ベースライン画像が取得されたら、任意波形発生器に超音波駆動周波数、パルス長、音響圧振幅を設定し、50マイクロバブルサンプルを尾静脈に静脈内注入します。次に、実証したように血管系を画像化します。共焦点蛍光顕微鏡によるマイクロバブルの分析は、マイクロバブルシェルの不均一な粒子分布を明らかにする。

マイクロバブルの全体的な構造は、走査型電子顕微鏡法によってさらに可視化することができる。ブライトフィールド顕微鏡による心間動態と非共振マイクロバブルの現象学的挙動の分析は、時間の経過に伴うマイクロバブル半径の相対的な変化の評価を可能にする。ここでは、蛍光標識されたナノ粒子の典型的な正常な送達の画像配列が示されている。

マイクロバブルシェルに埋め込まれたナノ粒子は、レーザー光が気泡に到達したときに蛍光を観測することができる。しかし、この不成功の送達で観察されるように、蛍光ナノ粒子はマイクロバブルの殻上で点灯し、超音波暴露中にそのまま残る。生体内多光子イメージングは、超音波暴露中のナノ粒子の空間的および時間的な空洞化を決定するために使用することができ、超音波媒介ナノ粒子送達の基礎となるメカニズムを理解し、最適化するのに有益であり得る。

すべての長さと時間スケールでの光および音響経路の完全なアライメントによって、超音波誘発薬物送達に関する包括的な洞察が提供される。私たちのマルチスケール実験によって提供される答えは、今臨床実践に翻訳されます。この結果は、がん治療を含む様々な治療用途に貴重な洞察を提供する。