超音波誘発薬物放出のための蛍光標識マイクロバブルの特性評価のためのマルチタイムスケール顕微鏡法
June 12th, 2021
提示されたプロトコルは、超音波誘発薬物送達用途のために設計された蛍光標識マイクロバブルの応答を特徴付けるために使用することができ、その活性化メカニズムとその生物効果を含む。本論文では、関連する長さとタイムスケールを捉えるために実施されるイン ビトロ および インビボ 顕微鏡技術の範囲をカバーする。
このプロトコルは、活性化メカニズムとバイオエフェクトを含む超音波誘発薬物送達アプリケーション用に設計された蛍光標識マイクロバブルの応答を特徴付けるために使用することができます。重要なのは、異なる空間スケールと異なる時間スケールの両方で、気泡で超音波引き起こされる薬物送達のマルチスケールの問題を解明することを可能にするイメージング技術の組み合わせにあります。ブライトフィールド顕微鏡による単一の気泡イメージングの場合、19ゲージの通気針を配置し、19ゲージ針を装備した1ミリリットルのシリンジを使用して、ガラスバイアルから小さなチューブに微小気泡懸濁液を少量取り出し、次のステップでピペットを簡単にします。
ピペットを使用して、濾過されたリン酸緩衝生理食塩水中のマイクロバブル溶液を希釈する。10ミリリットルのシリンジを使用して、ホルダーが気泡を作成せずにいっぱいになるまでサンプルホルダーの1つの出口にサンプルを注入し、必要に応じてサンプルの多くを注入します。サンプルホルダーの両弁を閉じ、サンプルホルダーを顕微鏡の光軸に垂直に配置します。
サンプル分析の前に、任意波形発生器に所望の超音波駆動周波数と音響圧力を設定し、サンプルホルダーの一角の視野から始めて、XYZステージを使用して、顕微鏡の視野内の単一のマイクロバブルを見つけるためにホルダーを移動させ、次に、水浴に接続された光ファイバーをストロボライトに取り付けて記録を開始します。超音波設定ごとに必要な回数だけイメージングを繰り返し、サンプルホルダーを少なくとも2ミリメートル移動して、各分析に対して未超音波マイクロバブルを含む視野に移動します。マイクロバブルの蛍光顕微鏡イメージングでは、示されているようにリン酸緩衝生理食塩水中のマイクロバブル溶液を希釈した後、任意の波形発生器に所望の超音波駆動周波数と音響圧力を設定し、マイクロバブルからのナノ粒子の蛍光励起のためのパルス遅延発生器のレーザーのトリガー遅延を設定し、XYZステージを使用してサンプルホルダーを移動してマイクロバブルの単一バブルを特定し、その後、それらを単一のバブルに持ち込む 目的を選択し、記録をトリガーします。
超音波設定を変更し、サンプルホルダーを新しい視野に移動することにより、必要に応じてイメージングを繰り返します。生体内顕微鏡によるイメージングの場合、まず、XY位置決め段階で加熱された動物ホルダーを、ウェーブガイドと目的との間に配置し、波導路にカップリングゲルを追加します。麻酔付き腫瘍軸マウスの尾静脈に尾静脈カテーテルを挿入し、加熱されたホルダーに窓チャンバーを取り付けたマウスを置きます。
カバースリップに水滴を加えます。腫瘍組織血管系を可視化するために、1ミリリットル当たり30マイクログラムの4ミリグラムを、2メガダルトンデキストランを尾静脈カテーテルに静脈内に注入し、XY翻訳段階を使用して、適切な血管を有する視野が見つかるまでマウスを移動させる。実験のパラメータに応じてフレームレート、視野、記録の長さを調整し、船舶のベースライン画像を記録します。
ベースライン画像が取得されたら、任意波形発生器に超音波駆動周波数、パルス長、音響圧振幅を設定し、50マイクロバブルサンプルを尾静脈に静脈内注入します。次に、実証したように血管系を画像化します。共焦点蛍光顕微鏡によるマイクロバブルの分析は、マイクロバブルシェルの不均一な粒子分布を明らかにする。
マイクロバブルの全体的な構造は、走査型電子顕微鏡法によってさらに可視化することができる。ブライトフィールド顕微鏡による心間動態と非共振マイクロバブルの現象学的挙動の分析は、時間の経過に伴うマイクロバブル半径の相対的な変化の評価を可能にする。ここでは、蛍光標識されたナノ粒子の典型的な正常な送達の画像配列が示されている。
マイクロバブルシェルに埋め込まれたナノ粒子は、レーザー光が気泡に到達したときに蛍光を観測することができる。しかし、この不成功の送達で観察されるように、蛍光ナノ粒子はマイクロバブルの殻上で点灯し、超音波暴露中にそのまま残る。生体内多光子イメージングは、超音波暴露中のナノ粒子の空間的および時間的な空洞化を決定するために使用することができ、超音波媒介ナノ粒子送達の基礎となるメカニズムを理解し、最適化するのに有益であり得る。
すべての長さと時間スケールでの光および音響経路の完全なアライメントによって、超音波誘発薬物送達に関する包括的な洞察が提供される。私たちのマルチスケール実験によって提供される答えは、今臨床実践に翻訳されます。この結果は、がん治療を含む様々な治療用途に貴重な洞察を提供する。
概要
この記事では、超音波で引き起こされる薬物送達に使用される蛍光標識マイクロバブルの反応を特徴づけるためのプロトコルを紹介します。さまざまな空間的および時間的スケールにわたる活性化メカニズムと生物学的影響を分析するためのさまざまな顕微鏡技術について詳しく説明しています。
主要な研究構成要素
科学の分野
- 超音波で引き起こされる薬物送達
- 顕微鏡技術
- 蛍光イメージング
背景
- マイクロバブルは超音波を通じて薬物送達を強化できます。
- その挙動を理解することは治療応用の最適化に重要です。
- 異なるイメージング技術はマイクロバブルのダイナミクスについての洞察を提供します。
- 空間的および時間的分析の組み合わせは包括的な研究に不可欠です。
研究の目的
- マイクロバブルの活性化メカニズムを特徴づける。
- 薬物送達に対する超音波の生物学的影響を評価する。
- 詳細な分析のためにマルチスケールイメージング技術を利用する。
使用された方法
- 単一バブルイメージングのためのブライトフィールド顕微鏡。
- ナノ粒子の挙動を観察するための蛍光顕微鏡。
- 腫瘍血管系を視覚化するためのイントラバイタル顕微鏡。
- 粒子分布分析のための共焦点蛍光顕微鏡。
主要な結果
- マイクロバブルの殻の不均一な分布が観察されました。
- ナノ粒子の超音波下での成功した送達が実証されました。
- イントラバイタルイメージングはナノ粒子の血管外漏出の空間的および時間的ダイナミクスを明らかにしました。
- 得られた洞察はがん治療における臨床応用に情報を提供できます。
結論
- 超音波で引き起こされる薬物送達メカニズムの包括的な理解が達成されました。
- 結果は治療応用に貴重な洞察を提供します。
- 将来の研究では結果を臨床実践に反映させます。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Understanding ultrasound-triggered drug delivery requires multi-scale characterization of microbubble behavior to de-risk therapeutic mechanisms. This protocol enables predictive confidence in nanoparticle release dynamics across spatial and temporal scales, supporting go/no-go decisions in early discovery. The approach addresses a critical inflection point in portfolio advancement by linking mechanistic insights to translational outcomes in cancer therapy applications.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogate therapeutic hypotheses by visualizing nanoparticle distribution within microbubble shells to clarify payload localization mechanisms.
- Operational Value: Enable biological de-risking through direct observation of shell integrity and payload retention under controlled ultrasound exposure.
- Predictive Value: Support target validation by correlating ultrasound parameters with nanoparticle release efficiency for mechanistic de-risking.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Prepare validated microbubble-nanoparticle systems for standardized ultrasound response testing using fluorescence and bright-field microscopy.
- Quantitative Outputs: Generate measurable radial dynamics and fluorescence intensity readouts to enable compound or formulation screening.
- Platform Scalability: Establish reproducible imaging workflows across 10 million fps bright-field and 500,000 fps fluorescence modalities for high-content analysis.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Model tumor vasculature response using intravital microscopy in dorsal skinfold window chambers to study extravasation over several minutes.
- Translational Continuity: Bridge in vitro release mechanisms to in vivo nanoparticle distribution in vasculature and perivascular space.
- Risk-Adjusted Advancement: Inform preclinical go/no-go decisions by quantifying nanoparticle extravasation kinetics as a biomarker of delivery efficiency.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates into the discovery continuum from early target validation through lead identification to preclinical assessment by providing multi-scale imaging data that informs mechanistic understanding and formulation optimization.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of ultrasound-triggered release by visualizing nanoparticle localization and shell dynamics at single-bubble resolution.
- Screening: Enables assay readiness through standardized preparation and imaging of microbubble suspensions under defined ultrasound parameters.
- Analytics: Delivers quantitative measurements of radial change over time and fluorescence emission profiles to compare formulation conditions.
- Translational Research: Connects in vitro shell disruption observations to in vivo vascular extravasation events via intravital multi-photon imaging.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable imaging platform applicable across microbubble formulations and ultrasound settings for portfolio-wide de-risking.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Provides predictive confidence in drug release mechanisms through direct visualization of nanoparticle distribution and shell response.
- Operational Value: Ensures standardization and reproducibility across microscopy modalities for cross-functional team alignment.
- Strategic Value: Reduces late-stage biological risk by enabling early mechanistic de-risking of ultrasound-triggered delivery systems.
- Portfolio Impact: Facilitates risk-adjusted prioritization of formulations based on quantifiable release kinetics and extravasation efficiency.
Implementation Considerations
- Requires expertise in ultrasound physics, microscopy operation, and nanoparticle formulation handling.
- Depends on access to high-speed bright-field (10M fps) and fluorescence (500k fps) imaging systems coupled to arbitrary waveform generators.
- Necessitates standardization of sample preparation, dilution in PBS, and holder positioning to prevent artifacts across imaging sessions.
- Involves adaptation considerations for different microbubble shell compositions, nanoparticle types, and ultrasound frequencies.
- Involves practical limitations including microbubble stability during handling and the need for precise optical-acoustical alignment at all scales.
