Name: 単一細胞レベルでのキャビテーション気泡（複数可） - 細胞相互作用し、得られた生体効果を調査するための表面パターニングとマイクロ流体システム (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-10T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 14 s
Description: 学ぶキャビテーション気泡の生体効果をマイクロ流体システムと表面パターニングを用いて単一細胞レベルで調査する方法。細胞膜の一過性透過や細胞内カルシウム応答の測定技術を習得できます。

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デューク大学のクリーンルーム施設SMIFの使用に感謝したいと思います。また、ジェット速度の測定に協力してくださったHao Qiang氏にも感謝します。著者らは、この研究で使用された島津製作所HPV-Xカメラを提供してくれたHadland ImagingのTodd Rumbaugh氏に感謝します。この研究は、助成金5R03EB017886-02および4R37DK052985-20を通じてNIHによって部分的に資金提供されました。

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著者らは開示するものは何もない。

単一細胞分析は、生細胞イメージングとの組み合わせで、非常にこのような表現型の発達、免疫応答23のような個々の細胞でしばしば動的変数プロセスの我々の理解を高めています。皿またはフラスコ中で通常の細胞培養とは対照的に、マイクロ流体システムは、リアルタイムで、ダウン単一細胞レベルに、微小環境の正確な制御を可能にします。したがって、マイクロ流体技術の進歩及び技術は、主に、単一細胞分析のスループットおよび再現性を改善しています。ソフトリソグラフィ及び表面パターンを統合することにより、マイクロ流体システムは、さらに、時空間的に可変の刺激の複雑なパターンへの単一の細胞の応答の詳細な分析を容易にするように設計することができます。例えば、一過性の化学的または機械的な手がかりが正常にそれらの生物学的または機械的な応答が自動的に記録しながら、単一の細胞に送達し、2を分析されています4。この一般的な傾向にもかかわらず、細胞レベルでのキャビテーションによって誘発される生体効果を分析するマイクロ流体の適用は非常に限られていました。最も顕著なのは、それだけマイクロピラー11に捕捉された懸濁液中の個々の...

細胞異質は、遺伝子、タンパク質、および代謝物の確率論的表現から生じる、大きな細胞集団内に存在し、細胞の適応と進化の1を可能にするために、生物学において基本的な原理として機能することを認識が高まっています。したがって、個々の細胞との相互作用の機能を理解するために集団ベースのバルク測定を使用することは、しばしば不正確で信頼できません。単一細胞分析のための新しい技術を開発することは、したがって、生物学的および薬理学的研究に高い関心のある、より良い幹細胞生物学および癌療法2-4の主要なシグナル伝達経路およびプロセスを理解するために、例えば、使用することができます。近年では、マイクロ流体プラットフォームの出現は大幅に位置付け、処理、および個々の細胞からの応答の観測は、新規の分析戦略5を用いて行われてきた単一細胞分析を、容易にしました。 キャビテーションは、高強度で癌の治療を含む生物医学的用途の多様な範囲の中で重要な役割は、衝撃波砕石術（SWL）7、薬物または遺伝子送達によって、腎臓結石の非侵襲的なフラグメンテーションを超音波（HIFU）6を集中果たしていますソノポレーション8、および流体力学的バブルキャビテーション9,10によって、細胞または組織の最近報告された破壊によって。それにもかかわらず、キャビテーション気泡（複数可）の動的プロセスは、生体組織および細胞との相互作用が十分に理解されていません。これは、超音波、衝撃波、およびローカル油圧によって生成されるキャビテーションの開始とバブル動力学におけるランダム性に起因しています。さらに、特に、単一細胞レベルで、生体細胞の本質的に複雑かつ高速応答を解決するための技術を可能にするが不足しています。 これらの課題のために、それは驚くべきことではないので、非常に少数の研究は、蜂を持っていることnが十分に制御された実験条件下で気泡 - 細胞相互作用を調査するために報告されています。例えば、膜懸濁液11に捕捉された個々の細胞の穿孔およびヒト赤血球のインパルス大きな変形12は、マイクロ流体チャネル内のレーザで生成単一の気泡を用いて実証されています。後者の技術は、しかし、唯一のための核13の存在により、真核細胞中で非常に小さな変形を生成することができます。また、懸濁液中の細胞を治療する場合、下流生体効果を監視することは困難です。他の研究では、単一の接着細胞における膜の穿孔および/または細胞内カルシウム応答を産生するための細胞に結合したマイクロバブル（または超音波造影剤）の超音波励起は8に報告されています。単一接着細胞の膜の穿孔は、レーザーで生成タンデムを用いて製造することができる光吸収トリパンブルー溶液14を含有する薄い液体層中に気泡、またはマイクロチャンバー15内に光学吸収性基板を介して照射するマイクロ秒のレーザーパルスによって生成された振動する気泡によって。比較すると、後者は、細胞に対して毒性であるため、光学的に吸収性基材は、レーザ光吸収トリパンブルー溶液を超える利点を有します。さらに重要なのは、レーザー発生した気泡は、音響的に励起された泡よりも気泡サイズと位置の点でより制御可能です。それにもかかわらず、すべてのこれらの以前の研究で、細胞の形状、向き、及び接着条件は、実質的に細胞応答および機械的応力16によって生成される生体効果に影響を与える可能性がある、制御しませんでした。 以前の研究で、これらの欠点を克服するために、我々は最近、気泡発生、細胞パターニング、バブルバブル - 細胞相互作用、およびリアルタイム微細TECHNのユニークな組み合わせを使用して構築されたマイクロ流体チップにおける細胞応答のバイオアッセイのための実験系を開発しましたiques。フィールドに他の人から私たちの実験システムを区別三つの主な機能は次のとおりです：1）ガラス基板上にミクロンサイズの金ドットのパターニングは、気泡発生17用のローカライズされたレーザ吸収を可能にするために、 2）個々の細胞の位置および形状の両方を制御するために、同一基板上の細胞接着のための細胞外マトリックス（ECM）のミクロンサイズの島のパターン。 3）準2次元空間に3次元の気泡の気泡 - 細胞相互作用ドメインの大きさの圧縮は、全てで捕捉、流れ場、細胞変形、及び生体効果を噴射、バブルバブル相互作用の面内の可視化を容易にします1合理化された撮像シーケンス（ 図1D）。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/55106/55106fig1.jpg" /> 図1：マイクロ流体チップと異なるアッセイの概略図。 a）は、チャンネルの組み立てられたマイクロ流体チップは、青色のインクが充填します<html>可視化のため。 b）はパターン化された細胞と金ドットとマイクロ流体チップの内側の領域は、（近接する2金のドット間の距離）は40μmです。作業単位の多数の対がチャネル内に配置することができます。金ドットのペアおよび細胞パターニング領域に付着したHeLa細胞からなる単一の作業単位のc）のクローズアップ画像。デバイス動作のd）の概略。単一の細胞はに付着し、フィブロネクチンでコーティングされた「H」字型の島に広がります。逆位相振動でキャビテーション気泡（タンデムバブル）の組は、近くの標的細胞に向かって移動し、高速かつ局所的なジェットの生成につながる（ 図4aを参照）、金ドットのパルスレーザ光を照射することによって生成されます。セルは、変形高分子取り込みのためporated、および/またはタンデムバブルに対する細胞のスタンドオフ距離（S d）が依存し、カルシウム応答を用いて刺激することができます。F = &quot;http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55106/55106fig1large.jpg&quot;ターゲット= &quot;_空白&quot;&gt;この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。 このプラットフォームは、さらに、キャビテーション誘発性の生体効果のために細胞表面に付着した蛍光アッセイおよび官能化ビーズと組み合わせることができます。具体的には、このプラットフォームは、単一細胞レベルで信頼性の高い定量化アッセイのための道を開きます。これまで、我々は、タンデムバブル誘導細胞膜変形、細胞のポレーション及び細胞内取り込み、生存率、アポトーシス、および細胞内カルシウム応答の分析のための装置を使用しています。以下のプロトコルでは、我々はチップ製造の過程と、上記の各種の生体効果を分析するための手順を説明します。また、チップの動作も記載されています。

<table><tbody><tr><td>試薬/材料</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>75 mm x 38 mm プレーン顕微鏡スライド</td><td>Corning</td><td>2947-75X38</td><td></td></tr><tr><td>Acetone</td><td>Sigma Aldrich, Co.</td><td>320110</td><td>ACS試薬、&ge;</td></tr><tr><td>イソプロピルアルコール</td>99.5% <td>シグマ・アルドリッチ(株)</td><td>W292907</td><td>&ge;99.7%、FCC、FG</td></tr><tr><td>硫酸</td><td>シグマアルドリッチ株式会社</td><td>320501</td><td>ACS試薬、95.0-98.0%</td></tr><tr><td>過酸化水素</td><td>Sigma Aldrich, Co.</td><td>216763</td><td>30 wt.% in H2O</td></tr><tr><td>プライマー P-20</td><td>Microchem</td><td>MCC Primer 80/20</td><td></td></tr><tr><td>NFR フォトレジスト</td><td>JSR</td><td>NFR016D2</td><td></td></tr><tr><td>Photomask</td><td>Photoplotstore</td><td>N/A</td><td>4x4 ダイレクトライトマスク</td></tr><tr><td>MF-319 現像液 Shipley</td><td>(Rohm and Haas)</td><td>Microposit MF-319</td><td></td></tr><tr><td>1165 Photoresist Remover</td><td>Dow Chemical, Co.</td><td>DEM-10018073</td><td>1-メチル-2-ピロリジノン基づく</td></tr><tr><td>S1813フォトレジスト</td><td>Shipley(ロームアンドハース)</td><td>S1813</td><td></td></tr><tr><td>PLL-g-PEG</td><td>SuSoS</td><td>PLL(20)-g[3.5]-PEG(2)</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>15630080</td><td></td></tr><tr><td>パラフィンフィルム</td><td>HACH</td><td>251764</td><td></td></tr><tr><td>SU-2025フォトレジスト</td><td>Microchem</td><td>SU-2025</td><td></td></tr><tr><td>PDMS</td><td>ダウ コーニング</td><td>184 SIL ELAST KIT 0.5KG</td><td></td></tr><tr><td>マイクロボア チューブ</td><td>サンゴバン PPL Corp.</td><td>S-54-HL</td><td></td></tr><tr><td>メタルピン</td><td>ニューイングランドスモールチューブ</td><td>NE-1300-01</td><td>カットチューブ(ストレート)、0.025インチ外径 x 0.017インチID x 0.50インチLong</td></tr><tr><td>HeLa細胞</td><td>Duke Cell Culture Facility</td><td>(307-CCL-2) HeLa, p.148</td><td></td></tr><tr><td>DPBS (1x) buffer</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>14190144</td><td></td></tr><tr><td>DMEM culture medium</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11995065</td><td></td></tr><tr><td>Fibronectin Bovine Protein, Plasma</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>33010018</td><td></td></tr><tr><td>0.25% Trypsin-EDTA (1x)</td><td>ThermoFisherサイエンティフィ</td><td>ック25200056</td><td></td></tr><tr><td>ヨウ化プロピジウム</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>P21493</td><td></td></tr><tr><td>カルボン酸マイクロスフェア1.00&nbsp;&mu;m</td><td>Polysciences, Inc</td><td>08226-15</td><td></td></tr><tr><td>カルボン酸マイクロスフェア 2.00&nbsp;&mu;m</td><td>Polysciences, Inc</td><td>18327-10</td><td></td></tr><tr><td>EDC (1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>22980</td><td></td></tr><tr><td>Sulfo-NHS</td><td>Sulfo-NHS (N-hydroxysulfosuccinimide)</td><td>24510</td><td></td></tr><tr><td>Peptite-2000</td><td>Advanced BioMatrix</td><td>5020-5MG</td><td></td></tr><tr><td>FITC Annexin V</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A13199</td><td></td></tr><tr><td>ふら-2、AM</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>F1221</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma Aldrich, Co.</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>F-127</td><td>invitrogen</td><td>P6866</td><td>0.2 &micro;mろ過(水溶液10%)</td></tr><tr><td>還元血清培地&nbsp;</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>11058021</td><td></td></tr><tr><td>名前</td><td>会社</td><td>カタログ番号</td><td>コメント</td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plasmasher</td><td>Emitech</td><td>K-1050X</td><td>O2/Arプラズマアッシングフォトレジスト・その他有機材料</td></tr><tr><td>マスクアライナー</td><td>SUSS MicroTec&nbsp;</td><td>Karl Suss MA6/BA6</td><td></td></tr><tr><td>Eビーム蒸発器</td><td>CHA Industries</td><td>CHA Industries Solution E-Beam</td><td></td></tr><tr><td>RIE</td><td>Trion Technology&nbsp;</td><td>トリオンテクノロジー ファントムII</td><td>(酸化物/窒化物/ポリマー)</td></tr><tr><td>エッチング ステレオスコープ</td><td>AmScope</td><td>アメリカンスコープ SM-4TZ-FRL</td><td>実体顕微鏡</td></tr><tr><td>シリンジポンプ</td><td>Chemyx Inc</td><td>NanoJet</td><td></td></tr><tr><td>細胞培養インキュベーター</td><td>NuAire</td><td>AutoFlow NU-8500 ウォータージャケット CO2 インキュベーター</td><td></td></tr><tr><td>生物学的安全キャビネット</td><td>NuAire</td><td>NU-425-400</td><td></td></tr><tr><td>ウォーターバス</td><td>VWR</td><td>1122s</td><td></td></tr><tr><td>遠心分離機</td><td>IEC</td><td>セントラCL2</td><td></td></tr><tr><td>顕微鏡</td><td>ツァイス</td><td>アクシオオブザーバーZ1</td><td></td></tr><tr><td>Nd:YAGレーザー&nbsp;(レーザー1)</td><td>ニューウェーブリサーチ</td><td>テンペスト</td><td></td></tr><tr><td>Nd:YAGレーザー&nbsp;(レーザー2)</td><td>New Wave Research</td><td>Orion</td><td></td></tr><tr><td>遅延発生器</td><td>Berkeley Nucleonics&nbsp;</td><td>BNC 565-8c</td><td></td></tr><tr><td>フラッシュランプ</td><td>Dyna-Lite</td><td>ML1000 ファイバー結合フラッシュチューブ</td><td></td></tr><tr><td>高速カメラ</td><td>DRS Hadland</td><td>&nbsp;Imacon 200</td><td></td></tr><tr><td>ハイスピード&nbsp; カメラ</td><td>島津</td>製作所 <td>HPV-X</td><td></td></tr><tr><td>ハイスピードカメラ</td><td>Vision Research</td><td>Phantom V7.3</td><td></td></tr><tr><td>PIV ソフトウェア</td><td>LaVision</td><td>DaVis 7.2</td><td></td></tr><tr><td>カメラ</td><td>Zeiss</td><td>AxioCam MRc 5</td><td></td></tr><tr><td>ソフトウェア</td><td>Zeiss</td><td>AxioVision</td><td></td></tr><tr><td>PTI システム</td><td>堀場製作</td><td>所 S/N:1705 RAM-X</td><td></td></tr><tr><td>EasyRatioソフトウェア</td><td>堀場製作所</td><td>Easy Ratio Pro 2</td><td>version 2.3.125.86</td></tr><tr><td>63回; 客観的</td><td>Zeiss</td><td>LD Plan Neofluar</td><td></td></tr></tbody></table>

単一細胞レベルでのキャビテーション気泡（複数可） - 細胞相互作用し、得られた生体効果を調査するための表面パターニングとマイクロ流体システム

A Microfluidic System with Surface Patterning for Investigating Cavitation Bubble(s)&#8211;Cell Interaction and the Resultant Bioeffects at the Single-cell Level

本稿では、まず、正確にタンデム気泡と明確に定義された位置及び形状に近いパターニング個々の細胞の発生を制御する同一のガラス基板上の金のドットとフィブロネクチンで被覆された領域と、マイクロ流体チップの製造手順を説明します。我々は、数マイクロ秒の時間遅延を有する金のドットの組を照射する2つのパルスレーザを使用して、タンデム気泡の発生を示します。我々は、高速撮像により気泡バブル相互作用とジェットの形成を視覚化し、粒子画像速度測定（PIV）を用いて得られた流れ場を特徴付けます。最後に、我々は、巨大分子の取り込み、添付のインテグリン結合ビーズの変位によって決まる局所的な膜の変形、及びレシオメトリックイメージングからの細胞内カルシウム応答を有する細胞膜の穿孔を含む、単一細胞分析のために、この技術のいくつかのアプリケーションを提示します。我々の結果は、高速かつ指向吐出流量がプロであることを示し近接して増殖させた細胞の表面上に高度に局在化せん断応力を課すことができるタンデムバブル相互作用によって生さ。また、別の生体効果タンデム気泡セルからスタンドオフ距離を調整することにより、吐出流の強さを変化させることにより誘導することができます。

この作業に記載のマイクロ流体プラットフォームは、バブルバブルの相互作用を調査すると、単一細胞レベルでのキャビテーションによって誘発される生体効果の多様を分析するために使用することができます。ここで、我々は我々の実験システムで実行することができる実験研究とバイオアッセイの多様性を実証するためにいくつかの例を提示します。まずジェット形成、得られた流れ場の可視化、およびジェット速度（ 図5a）の計算と並行気泡の一時的な相互作用を例示します。私たちは、タンデムバブルによって誘発される局所的な細胞膜の変形（ 図5b）、PI取り込み（ 図5c）とのピンポイントの膜ポレーション、および細胞内カルシウム応答（ 図5d）の後、現在の例ではなります。このような細胞の生存及びアポトーシスアッセイなどの他の例は、文献22に見出すことができます。 <p class="jove_content" fo:keep-together.withiNページ= &qu...

マイクロ流体チップを作製し、タンデムバブル生成用の金ドットと、その近くのシングルセルパターニング用のフィブロネクチン被覆島を生成しました。得られた流れ場は、粒子画像速度測定によって特徴付けられ、細胞膜ポレーション、膜変形、細胞内カルシウム応答など、さまざまな生体効果の研究に使用されました。

In this manuscript, we first describe the fabrication protocol of a microfluidic chip, with gold dots and fibronectin-coated regions on the same glass ...

この実験手順の目的は、表面パターニングを用いてタンデム気泡の生成および個々の標的細胞の位置と形状を精密に制御し、マイクロ流体閉じ込め環境におけるキャビテーション誘起のバイオエフェクトを調査することです。このマイクロ流体システムにより、治療目的の音響アプリケーションや音響操作に関連する、遷移するキャビテーション気泡と細胞の実験が可能になります。本手法の主な利点は、表面パターニングによる精度の向上にあります。これにより、個々の細胞の生物学的影響を研究することが可能となり、信頼性の高い気泡間相互作用によって高ストリーム負荷を実現できます。チップ内での表面パターニングおよび細胞調製のステップには、さまざまな手法やコツを要する複雑な工程が含まれるため、手順の視覚的な実演が不可欠です。すべてのマイクロファブリケーションの手順は、クリーンルームウェアを着用し、クリーンルーム内で行ってください。各金ドットの面積を25〜30平方ミクロンに設計します。これにより、気泡発生に必要なレーザーエネルギーを吸収するのに十分な大きさでありながら、個々の細胞が付着するのを防ぐのに十分な小ささを確保します。テキストプロトコルに従って化学フード内でガラススライドを洗浄し、その後スピンコーティングフードへ移動します。スピンコーダーを、2秒かけて1000 RPMまで加速させ、その速度を5秒間維持し、次に3秒かけて3000 RPMまで加速させ、その速度を30秒間維持するように設定します。次に、バキュームを使用してガラススライドをスピンコーターに固定します。その後、スライドにP20を塗布し、スピンサイクルを開始します。続いて、同じサイクルを用いてNFRネガレジストを塗布します。次に、ホットプレートを用いてスライドを 95 °C で 60 秒間加熱します。室温まで冷却した後、フォトリソグラフィーを行います。クロムマスクをマスクアライナーに装着し、パターン面がスライド側を下向いていることを確認してください。次に、フォトリソグラフィーのレシピをハード露光モードに設定し、UV露光時間を9秒に設定して、ガラス基板をマスクに合わせてアライメントします。UV露光後、スライドを95 °Cで1分間ベークし、前述と同様に冷却させます。スライド上のパターンを現像するために、現像液に60秒間浸し、その後、スライドを蒸留水で洗浄し、窒素ガスで乾燥させます。顕微鏡検査によりパターンを確認した後、スライドを120 °Cで5分間加熱し、室温まで冷却します。次に、反応性イオンエッチング装置を用いて、500 tor、100 Wの条件で90秒間、プラズマによるスライドの洗浄を行います。電子ビーム蒸着機を使用し、サンプルをプレートホルダーにテープで固定します。装置をプログラムし、5 nanometerのチタニウム層を堆積させた後、15 nanometerの金層を堆積させます。その工程が完了したら、装置内を排気します。次に、スライドをフォトレジスト除去溶剤を入れたビーカーに一晩浸し、NFRレジスト上の金を 제거します。翌日、スライドをアセトンで洗浄し、続いてIPAで洗浄した後、窒素で乾燥させます。スライドをDI waterですすぎ、再び窒素で乾燥させます。次に、スライドを115 °Cで5分間加熱します。次に、100 Wの酸素プラズマアシャーを用いて、金ドットパターンスライドを90秒間洗浄します。HeLa細胞が正方形領域に十分に伸展しつつ、1つのアイランド上に複数の細胞が凝集する可能性を最小限に抑えるため、フィブロネクチンでコードされた各アイランドの面積を700から900 square micronsに設定します。作製手順は金パターンの作製方法とほぼ同様です。以前と同様に、S18ポジ型フォトレジストを用いてスライドにスピンコートを行い、115 °Cでベークします。次に、マスク上のマークと基板上のマークを合わせながらフォトリソグラフィーを行います。中央部分のパターンを確認して角度が正しいことを検証し、金ドットからHパターンまでのスタンドオフ距離を調整してください。ポストベイクなしで、UV露光を9秒間行います。次の相違点は、現像ステップが45秒間のみであることです。反応性イオンエッチングについては、パラメータを500 tor、100 watts、90秒に設定します。次に、PLLG peg パッシベーション溶液を1滴パラフィンフィルムの上に滴下し、スライドのパターン面に溶液を挟み込みます。気泡が入らないように注意してください。45分後、フィルムからスライドを取り出します。スライドをDI waterで洗浄し、窒素で乾燥させます。次に、スライドをphotoresist remover 1165に浸漬し、続いてDI waterで希釈した50% 1165に浸漬します。その後、DI waterのみで洗浄します。各洗浄において、超音波バスを用いて溶液を90秒間攪拌してください。次に、ホットプレート上でスライドを乾燥させ、デシケーターで密封し、4 degrees celsiusで保存します。テキストプロトコルに記載されている通りに、スライドをマイクロチャネルチップに組み立てます。反応性イオンエッチングを用いて周辺領域からPLLGペグを除去する前に、小さなPDMSスラブでガラス基板のパターン形成領域を確実に遮蔽するように注意してください。RIE装置からパターン形成済みのガラスを取り出し、小さなPDMSスラブを取り除きます。低用量の酸素プラズマでマイクロチャネルPDMSを処理した後、実体顕微鏡下でパターン形成済みガラス基板に合わせて配置します。マイクロチャネルPDMSとパターン形成済みガラス基板を密着させます。これで、チップを使用する準備が整いました。まず、PBSをマイクロチャネルに1 µL/minの流速で30分間流し、チップをプライミングします。次に、同じ流速でフィブロネクチン溶液を45分間注入します。待機している間に、細胞を5 × 10⁶ cells/mLの濃度で調製します。この手順では、細胞の健康状態と高いコンフルエンシーが極めて重要です。その後、チップ内を流れる溶液をPBSに置換し、流速を10 µL/minに上げます。PBSを5分間流してください。次に、準備した細胞をシリンジでチップ内に注入します。1滴がチューブから流出したところで注入を停止し、出口をクランプします。その後、チップをインキュベーターに入れ、30分間静置します。その後、出口を解放し、細胞培養培地を10 µL/minで5分間流してチップ内を洗浄します。5分後、流量を0.75 µL/minまで下げ、チップとポンプをインキュベーターに移して2時間静置します。2時間後、金ドットパターンに向けたタイミング制御付きの2本のパルスNDIレーザーを用い、倒立顕微鏡下でチップを観察しながらタンデム気泡生成を行い、高速カメラでその結果を撮影します。50 µmの気泡については、2本のレーザー間の遅延時間を2.5 µsに設定し、出力を10 µJに設定します。次に、高速カメラの記録をレーザーと同期させ、露光時間を200 nsとして200万 fpsで記録します。これにより、気泡の膨張、崩壊、気泡同士の相互作用、およびジェット形成のダイナミクスが記録されます。記述した手法を用いて、単一細胞レベルでの気泡同士の相互作用およびさまざまなキャビテーション誘起バイオエフェクトを解析しました。具体的には、タンデム気泡の過渡的な相互作用によるジェット形成、その結果生じる流場の可視化、およびジェット速度の算出などを行いました。タンデム気泡周囲の方向性を持つジェット流の速度は約10 m/s、幅は約10 µmであり、これにより近接する標的細胞に対して、衝撃的かつ局所的なせん断応力および応力勾配を発生させることが可能です。また、タンデム気泡によって誘起される細胞膜の変形についても検討しました。細胞膜の前縁に付着させた機能化ビーズの変位によって、膜の変形と回復を強調して示します。隣接する3つのビーズの座標から、局所的な面積ひずみを算出しました。この概略図は、細胞表面の異なる部位における最大面積変化を示しています。前縁は主に伸展し、一方で細胞の後縁または側面は圧縮されており、これはタンデム気泡によるジェット流によって生じた不均一性と細胞変形を示しています。細胞前縁における面積ひずみの時間的変化は、数回の急速な振動に続き、約100 microsecondsの間、大きく持続的な伸展が起こり、その後、数millisecondsの時間スケールで緩やかに回復するという構成になっています。このビデオを視聴することで、表面パターニングによって制御された形状と位置にある単一細胞の生物学的影響を研究するために、制御可能な気泡間相互作用を発生させる方法を十分に理解できるはずです。この手順に続き、細胞骨格の菲薄化や接合イメージングなどの他の手法をさらに実施することで、タンデムバブル処理による細胞骨格の再編成を研究することができます。この技術の開発により、サブプレティック超音波分野の研究者が、単一細胞レベルでキャプテーションに起因する生物学的影響を探索する道が開かれます。この手順を試みる際は、細胞パターニングを成功させるために、良好な細胞コンフルエンシーと状態を維持することが重要であることに留意してください。クリーンルームで使用する化学薬品やレーザーによる作業は非常に危険である可能性があるため、本手順の実施中は、手袋やレーザー保護メガネの着用などの予防措置を必ず講じてください。

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

バイオエンジニアリング（生体工学）

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出典: Kurz, D. L., 他 多孔質培地におけるバイオクロッキングを研究するためのマイクロ流体プラットフォーム。 J. Vis. Exp.

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