単一細胞レベルでのキャビテーション気泡（複数可） - 細胞相互作用し、得られた生体効果を調査するための表面パターニングとマイクロ流体システム
2017年1月10日
マイクロ流体チップを作製し、タンデムバブル生成用の金ドットと、その近くのシングルセルパターニング用のフィブロネクチン被覆島を生成しました。得られた流れ場は、粒子画像速度測定によって特徴付けられ、細胞膜ポレーション、膜変形、細胞内カルシウム応答など、さまざまな生体効果の研究に使用されました。
この実験手順の全体的な目標は、表面パターニングを使用してマイクロ流体閉じ込めにおけるキャビテーション誘発バイオエフェクトを調査し、タンデムバブルの生成と個々の標的細胞の位置と形状を正確に制御することです。このマイクロ流体システムは、このトランジットキャビテーションの気泡と細胞の実験を可能にし、治療および音響の出版と音響操作に関連しています。この技術の主な利点は、表面パターニングからの精度を向上させることです。
これにより、個々の細胞の生体効果を研究することができ、信頼性の高いバブル間相互作用による高いストリーム負荷が得られます。チップステップでの表面パターニングと細胞調製は、さまざまな技術やチップが関与して複雑であるため、手順の視覚的なデモンストレーションは非常に重要です。クリーンルーム内ですべての微細加工手順を、クリーンルームスーツを着用して行ってください。
各金ドットの領域は、気泡発生のためにレーザーエネルギーを吸収するのに十分な大きさでありながら、個々の細胞が付着するのを防ぐのに十分な大きさになるように、25〜30平方ミクロン以内に設計します。テキストプロトコルに従って化学フード内のスライドガラスを清掃し、スピンコーティングフードに進みます。スピンコーダーをプログラムして、2 秒間で 1000 RPM まで加速し、その速度を 5 秒間維持した後、3 秒間で 3000 RPM まで上昇し、その速度を 30 秒間維持します。
次に、スライドガラスを真空でスピンコーダーに固定します。次に、スライドをP20で覆い、スピンサイクルを開始します。次に、同じサイクルでNFRネガ型フォトレジストを塗布します。
次に、スライドを95°Cのホットプレートで60秒間焼きます。室温まで冷却したら、フォトリソグラフィーを行います。クロームマスクをマスクアライナーに取り付け、パターン側がスライドに向かって下を向いていることを確認します。
次に、フォトリソグラフィーレシピを9秒間のUV露光でハード露光モードに設定し、ガラス基板をマスクに合わせます。UV露光後、スライドを95°Cで1分間焼き、前回と同様に冷まします。スライド上にパターンを現像するには、現像液に60秒間入れてから、スライドを蒸留水で洗浄し、窒素ガスで乾燥させます。
顕微鏡検査でパターンを確認した後、スライドを120°Cで5分間焼き、室温まで冷まします。次に、反応性イオンエッチングマシンでプラズマを使用してスライドを500 tor、100 Wで90秒間洗浄します。Eビーム蒸発器を使用して、サンプルをプレートホルダーにテープで固定します。
5ナノメートルのチタン層を堆積させ、続いて15ナノメートルの金層を堆積するようにマシンをプログラムします。その位置が完了したら、機械を換気します。次に、スライドをフォトレジスト除去剤溶媒のビーカーに一晩浸して、NFRレジストの上に座っている金を取り除きます。
翌日、スライドをアセトンで洗い、続いてIPAで洗い、窒素で乾かします。スライドを脱イオン水ですすぎ、窒素で再度乾燥させます。次に、スライドを摂氏115度で5分間加熱します。
次に、酸素プラズマアッシャーを使用して、金色のドットパターンスライドを100ワットで90秒間クリーニングします。各フィブロネクチンをコードする島の面積を700〜900平方ミクロン以内に設定して、複数の細胞が島に凝集する可能性を最小限に抑えながら、正方形の領域に十分なhela細胞が広がるようにします。製造は金のパターンのそれとよく似ています。
S18ポジ型フォトレジストを使用して、前と同様にスライドをスピンコードし、115°Cでコーディングをベイクします。次に、フォトリソグラフィーを行い、マスク上のマークを基板上のマークに合わせます。中央部のパターンを確認して正しい角度を確認し、金色のドットからHパターンまでのスタンドオフ距離を調整します。
ポストベイクなしで UV 露光を 9 秒間実行します。次の違いは、開発ステップにかかる時間がわずか 45 秒であることです。反応性イオンエッチングは、パリメータを500 tor 100 W、90秒に設定します。
次に、パラフィンフィルムにPLLGペグパッシベーション溶液を一滴塗布し、スライドのパターン側に溶液を挟み込みます。気泡を閉じ込めないでください。45分後、スライドをフィルムから取り出します。
スライドを脱イオン水ですすぎ、窒素で乾燥させます。次に、スライドをフォトレジスト除去剤1165に連続して浸します。次に、DI水で50%1165。
次に、DI水だけです。各浴中に、超音波浴で溶液を90秒間攪拌します。次に、スライドをホットプレートで乾かし、デシケーターで密封して摂氏4度で保管します。
テキストプロトコルで説明されているように、スライドをマイクロチャネルチップに組み立てます。反応性イオンエッチングを使用して周辺領域からPLLGペグを取り外す前に、ガラス基板のパターン化された領域を小さなPDMSスラブでシールドするように細心の注意を払ってください。RIEマシンからパターン化されたガラスを取り出し、小さなPDMSスラブを取り外します。
マイクロチャネルPDMSを低用量の酸素プラズマで処理した後、ステレオスコープ下でパターン化されたガラス基板に位置合わせします。マイクロチャネルPDMSとパターン化されたガラス基板をコンフォーマルコンタクトにします。次に、チップの使用に進みます。
まず、PBSをマイクロチャネルに1分間1マイクロリットル/分流してチップをプライミングします。次に、チップにフィブロネクチン溶液を同じ流速で45分間注入します。待っている間に、1ミリリットルあたり500万個の細胞で細胞を準備します。
この手順には、健康な状態と高いコンフルエンシーが重要です。その後、チップを流れる溶液をPBSに交換し、流量を毎分10マイクロリットルに増やします。PBSを5分間流します。
次に、調製した細胞をシリンジでチップに注入します。チューブから1滴が流れ出したら、注入を停止し、出口をクランプします。次に、チップをインキュベーターに30分間置きます。
その後、出口を解放し、チップを細胞培養培地で毎分10マイクロリットルで5分間フラッシュします。5分後、流量を毎分0.75マイクロリットルに落とし、チップとポンプをインキュベーターに2時間移します。2時間後、金ドットパターンに向けられたタイミング制御上の2つのパルスNDIレーザーと結果をキャプチャする準備ができている高速カメラを備えた倒立顕微鏡でチップを観察するタンデムバブル生成に進みます。
50ミクロンのバブルの場合、2つのレーザー間の遅延を2.5マイクロ秒に設定し、出力を10マイクロジュールに設定します。次に、高速カメラの記録をレーザーと同期させ、200ナノ秒の露光で毎秒200万フレームで記録を作成します。このように、バブルの膨張、崩壊、バブル-バブル相互作用、ジェット形成のダイナミクスが記録されます。
上記の手法を用いて、タンデムバブルとジェット形成との過渡的な相互作用、結果として生じる流れ場の可視化、ジェット速度の計算など、バブル-バブル相互作用およびさまざまなキャビテーション誘発バイオエフェクトをシングルセルレベルで研究しました。タンデムバブルの周りの指向性ジェット流は、毎秒約10メートル、幅約10ミクロンであるため、近くの標的細胞に衝動的で局所的な純粋なストレスとストレス勾配を生成することができます。タンデムバブルによる細胞膜の変形も研究されました。
膜の変形と回復は、細胞膜の前縁に付着した機能化ビーズの変位によって強調されます。隣接するビーズのトライアドの座標から、局所領域ひずみが計算されました。このスケマティックは、セル サーフェス上のさまざまな位置での最大面積変化を示しています。
前縁は主に引き伸ばされていますが、細胞の後縁または外側は圧縮されており、タンデムバブルによって誘発された噴射流によって生じる不均一性と細胞変形を示しています。セル前縁での面積ひずみの時間的変動は、いくつかの急速な振動とそれに続く約100マイクロ秒の大規模で持続的なストレッチ、およびその後の数ミリ秒の時間スケールでの緩やかな回復で構成されます。このビデオを見れば、制御可能なバブル-バブル相互作用を行い、表面パターニングから形状と位置が制御された単一細胞の生体効果を研究する方法について十分に理解できるはずです。
この手順に続いて、細胞骨格の菲薄化や夫婦のイメージングなどの他の対策をさらに実行して、タンデムバブル治療の細胞細胞骨格の再構成を研究することができます。開発後、この技術は、亜精密超音波の分野の研究者が単一細胞レベルでのキャプテーション誘発生物学的効果を調査するための道を開くでしょう。この手順を試みる際には、細胞のパターニングを成功させるために、良好な細胞の密度と状態を維持することを覚えておくことが重要です。
クリーンルームの化学薬品やレーザーの取り扱いは非常に危険である可能性があるため、この手順を実行するときは、手袋やレーザーゴーグルの着用などの予防措置を常に講じる必要があることを忘れないでください。
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概要
本研究では、表面パターニングを用いて気泡の発生と細胞の配置を精密に制御し、マイクロ流体閉じ込め環境におけるキャビテーション誘起の生物学的影響を調査します。このマイクロ流体チップにより、細胞膜のポレーションや細胞内カルシウム応答などの生物学的影響の検討が可能になります。
研究の主要構成要素
科学分野
- マイクロフルイディクス
- 細胞生物学
- キャビテーションの生物学的影響
背景
- マイクロ流体システムにより、気泡と細胞を用いた制御された実験が可能になります。
- 表面パターニングによって、細胞の配置と気泡生成の精度が向上します。
- 治療への応用に際しては、バイオエフェクト（生物学的影響）の理解が極めて重要です。
- 視覚的なデモンストレーションは、複雑な手順の理解に役立ちます。
研究目的
- 個々の細胞に対するキャビテーションバブルの生物学的影響を探索する。
- 表面パターニングを利用して、実験における精密な制御を行う。
- バブルの相互作用が細胞の挙動に及ぼす影響を評価する。
使用した手法
- 気泡生成用マイクロ流体チップの作製。
- 粒子画像流速測定法（PIV）を用いた流れ場の特性評価。
- 細胞膜の穿孔および変形の解析。
- 細胞内カルシウム応答の測定。
主要な結果
- タンデム気泡およびパターン化された細胞アイランドの生成に成功した。
- 流場を特性評価することで、気泡ダイナミクスに関する知見が得られた。
- 観察された生物学的影響には、膜穿孔およびカルシウム応答が含まれていた。
- 表面パターニングにより、実験精度が大幅に向上した。
結論
- マイクロ流体システムは、キャビテーションの生物学的影響を研究するのに有効である。
- 表面パターニングは、細胞間相互作用を制御するための有用な手法である。
- 得られた知見は、キャビテーションの治療への応用の理解に寄与する。
よくある質問
産業上の重要性
表面パターニングを施した精密なマイクロ流体システムにより、単一細胞レベルでのキャビテーション誘発バイオエフェクトの制御された調査が可能となり、初期探索におけるメカニズム的なリスク低減を支援します。このプラットフォームでは、定義されたせん断応力条件下での細胞膜応答および細胞内シグナリングの再現性のある検証が行えます。このような機能は、バイオファーマの研究開発における治療仮説の検証やポートフォリオの優先順位付けに対する予測の信頼性を高めます。
バイオ医薬品研究開発における戦略的応用
初期創薬およびターゲットバリデーション
- 制御されたジェット流下における細胞膜の穿孔および変形に関するメカニズムの解析を可能にします。
- 単一細胞レベルの解像度で局所的なバイオエフェクトを定量化することにより、機能的ターゲットの検証をサポートします。
- 細胞内カルシウム応答を測定することで、経路調節における予測の信頼性を向上させます。
- 細胞と気泡の相互作用を精密に制御することで、生物学的なリスク低減のためのプラットフォームを提供します。
スクリーニングおよびアッセイ開発
- 下流の単一細胞解析ワークフロー向けに、検証済みのマイクロ流路システムを調製します。
- 表面パターニングにより細胞の配置と気泡の発生を制御し、アッセイ条件を標準化します。
- 膜歪みや高分子の取り込みなど、再現性のある定量的な出力を可能にします。
- 細胞のバイオレスポンスに対する化合物や介入の影響を、信頼性高く評価することをサポートします。
トランスレーショナル・前臨床研究
- 局所的なせん断応力と細胞応答をモデル化することで、疾患に関連するメカニズム研究と整合させます。
- 定量的シングルセルバイオエフェクト測定を通じて、創薬から前臨床検証までの連続性を提供します。
- 細胞応答の不均一性を明確にすることで、リスクを調整した開発推進の意思決定を可能にします。
- 必要に応じて、トランスレーショナルバイオマーカー開発における予測的なリスク低減をサポートします。
パイプラインおよびワークフローの統合
このマイクロフルイディクスシステムは、初期のメカニズム研究から前臨床モデルの検証に至る発見のコンティニュアムに統合されており、仮説検証と定量的分析の両方をサポートします。
- 探索生物学： キャビテーション誘起効果の仮説検証および単一細胞レベルでの経路解明を促進します。
- スクリーニング： 標準化されたパターニングと気泡生成により、アッセイの即応性と再現性を提供します。
- 分析： 膜変形、高分子取り込み、およびカルシウムシグナリングの定量的な測定を実現します。
- トランスレーショナルリサーチ： 治療介入に関連する局所的な細胞バイオエフェクトをモデル化することで、探索研究と前臨床研究を橋渡しします。
- エンタープライズ再利用： さまざまな細胞種やメカニズム研究に適応可能な、再利用可能なマイクロ流体プラットフォームを提供します。
運用および企業への影響
- 科学的価値：ターゲットバリデーションにおける予測の信頼性を高め、メカニズム上の曖昧さを低減させる。
- 運用的価値：シングルセルバイオエフェクトアッセイの標準化、再現性、およびスケーラビリティを向上させる。
- 戦略的価値：細胞応答の閾値を明確にすることで、Go/No-Go判断および資本効率を改善する。
- ポートフォリオへの影響：リスク調整後の優先順位付けおよび探索段階にあるアセットの推進を支援する。
実施上の考慮事項
- 微細加工、表面パターニング、および高速イメージングに関する専門知識が必要です。
- クリーンルーム施設、パルスレーザー、および高度な顕微鏡インフラへのアクセスが必要です。
- 再現性のある細胞パターニングおよび気泡生成のためには、チーム間での厳格な標準化が求められます。
- プロトコルの最適化により、異なる細胞種や実験条件に適応させることが可能です。
- 実用上の制限として、作製の複雑さ、および精密なアライメントとタイミング制御の必要性が挙げられます。
