単一細胞レベルでのキャビテーション気泡（複数可） - 細胞相互作用し、得られた生体効果を調査するための表面パターニングとマイクロ流体システム
January 10th, 2017
マイクロ流体チップを作製し、タンデムバブル生成用の金ドットと、その近くのシングルセルパターニング用のフィブロネクチン被覆島を生成しました。得られた流れ場は、粒子画像速度測定によって特徴付けられ、細胞膜ポレーション、膜変形、細胞内カルシウム応答など、さまざまな生体効果の研究に使用されました。
この実験手順の全体的な目標は、表面パターニングを使用してマイクロ流体閉じ込めにおけるキャビテーション誘発バイオエフェクトを調査し、タンデムバブルの生成と個々の標的細胞の位置と形状を正確に制御することです。このマイクロ流体システムは、このトランジットキャビテーションの気泡と細胞の実験を可能にし、治療および音響の出版と音響操作に関連しています。この技術の主な利点は、表面パターニングからの精度を向上させることです。
これにより、個々の細胞の生体効果を研究することができ、信頼性の高いバブル間相互作用による高いストリーム負荷が得られます。チップステップでの表面パターニングと細胞調製は、さまざまな技術やチップが関与して複雑であるため、手順の視覚的なデモンストレーションは非常に重要です。クリーンルーム内ですべての微細加工手順を、クリーンルームスーツを着用して行ってください。
各金ドットの領域は、気泡発生のためにレーザーエネルギーを吸収するのに十分な大きさでありながら、個々の細胞が付着するのを防ぐのに十分な大きさになるように、25〜30平方ミクロン以内に設計します。テキストプロトコルに従って化学フード内のスライドガラスを清掃し、スピンコーティングフードに進みます。スピンコーダーをプログラムして、2 秒間で 1000 RPM まで加速し、その速度を 5 秒間維持した後、3 秒間で 3000 RPM まで上昇し、その速度を 30 秒間維持します。
次に、スライドガラスを真空でスピンコーダーに固定します。次に、スライドをP20で覆い、スピンサイクルを開始します。次に、同じサイクルでNFRネガ型フォトレジストを塗布します。
次に、スライドを95°Cのホットプレートで60秒間焼きます。室温まで冷却したら、フォトリソグラフィーを行います。クロームマスクをマスクアライナーに取り付け、パターン側がスライドに向かって下を向いていることを確認します。
次に、フォトリソグラフィーレシピを9秒間のUV露光でハード露光モードに設定し、ガラス基板をマスクに合わせます。UV露光後、スライドを95°Cで1分間焼き、前回と同様に冷まします。スライド上にパターンを現像するには、現像液に60秒間入れてから、スライドを蒸留水で洗浄し、窒素ガスで乾燥させます。
顕微鏡検査でパターンを確認した後、スライドを120°Cで5分間焼き、室温まで冷まします。次に、反応性イオンエッチングマシンでプラズマを使用してスライドを500 tor、100 Wで90秒間洗浄します。Eビーム蒸発器を使用して、サンプルをプレートホルダーにテープで固定します。
5ナノメートルのチタン層を堆積させ、続いて15ナノメートルの金層を堆積するようにマシンをプログラムします。その位置が完了したら、機械を換気します。次に、スライドをフォトレジスト除去剤溶媒のビーカーに一晩浸して、NFRレジストの上に座っている金を取り除きます。
翌日、スライドをアセトンで洗い、続いてIPAで洗い、窒素で乾かします。スライドを脱イオン水ですすぎ、窒素で再度乾燥させます。次に、スライドを摂氏115度で5分間加熱します。
次に、酸素プラズマアッシャーを使用して、金色のドットパターンスライドを100ワットで90秒間クリーニングします。各フィブロネクチンをコードする島の面積を700〜900平方ミクロン以内に設定して、複数の細胞が島に凝集する可能性を最小限に抑えながら、正方形の領域に十分なhela細胞が広がるようにします。製造は金のパターンのそれとよく似ています。
S18ポジ型フォトレジストを使用して、前と同様にスライドをスピンコードし、115°Cでコーディングをベイクします。次に、フォトリソグラフィーを行い、マスク上のマークを基板上のマークに合わせます。中央部のパターンを確認して正しい角度を確認し、金色のドットからHパターンまでのスタンドオフ距離を調整します。
ポストベイクなしで UV 露光を 9 秒間実行します。次の違いは、開発ステップにかかる時間がわずか 45 秒であることです。反応性イオンエッチングは、パリメータを500 tor 100 W、90秒に設定します。
次に、パラフィンフィルムにPLLGペグパッシベーション溶液を一滴塗布し、スライドのパターン側に溶液を挟み込みます。気泡を閉じ込めないでください。45分後、スライドをフィルムから取り出します。
スライドを脱イオン水ですすぎ、窒素で乾燥させます。次に、スライドをフォトレジスト除去剤1165に連続して浸します。次に、DI水で50%1165。
次に、DI水だけです。各浴中に、超音波浴で溶液を90秒間攪拌します。次に、スライドをホットプレートで乾かし、デシケーターで密封して摂氏4度で保管します。
テキストプロトコルで説明されているように、スライドをマイクロチャネルチップに組み立てます。反応性イオンエッチングを使用して周辺領域からPLLGペグを取り外す前に、ガラス基板のパターン化された領域を小さなPDMSスラブでシールドするように細心の注意を払ってください。RIEマシンからパターン化されたガラスを取り出し、小さなPDMSスラブを取り外します。
マイクロチャネルPDMSを低用量の酸素プラズマで処理した後、ステレオスコープ下でパターン化されたガラス基板に位置合わせします。マイクロチャネルPDMSとパターン化されたガラス基板をコンフォーマルコンタクトにします。次に、チップの使用に進みます。
まず、PBSをマイクロチャネルに1分間1マイクロリットル/分流してチップをプライミングします。次に、チップにフィブロネクチン溶液を同じ流速で45分間注入します。待っている間に、1ミリリットルあたり500万個の細胞で細胞を準備します。
この手順には、健康な状態と高いコンフルエンシーが重要です。その後、チップを流れる溶液をPBSに交換し、流量を毎分10マイクロリットルに増やします。PBSを5分間流します。
次に、調製した細胞をシリンジでチップに注入します。チューブから1滴が流れ出したら、注入を停止し、出口をクランプします。次に、チップをインキュベーターに30分間置きます。
その後、出口を解放し、チップを細胞培養培地で毎分10マイクロリットルで5分間フラッシュします。5分後、流量を毎分0.75マイクロリットルに落とし、チップとポンプをインキュベーターに2時間移します。2時間後、金ドットパターンに向けられたタイミング制御上の2つのパルスNDIレーザーと結果をキャプチャする準備ができている高速カメラを備えた倒立顕微鏡でチップを観察するタンデムバブル生成に進みます。
50ミクロンのバブルの場合、2つのレーザー間の遅延を2.5マイクロ秒に設定し、出力を10マイクロジュールに設定します。次に、高速カメラの記録をレーザーと同期させ、200ナノ秒の露光で毎秒200万フレームで記録を作成します。このように、バブルの膨張、崩壊、バブル-バブル相互作用、ジェット形成のダイナミクスが記録されます。
上記の手法を用いて、タンデムバブルとジェット形成との過渡的な相互作用、結果として生じる流れ場の可視化、ジェット速度の計算など、バブル-バブル相互作用およびさまざまなキャビテーション誘発バイオエフェクトをシングルセルレベルで研究しました。タンデムバブルの周りの指向性ジェット流は、毎秒約10メートル、幅約10ミクロンであるため、近くの標的細胞に衝動的で局所的な純粋なストレスとストレス勾配を生成することができます。タンデムバブルによる細胞膜の変形も研究されました。
膜の変形と回復は、細胞膜の前縁に付着した機能化ビーズの変位によって強調されます。隣接するビーズのトライアドの座標から、局所領域ひずみが計算されました。このスケマティックは、セル サーフェス上のさまざまな位置での最大面積変化を示しています。
前縁は主に引き伸ばされていますが、細胞の後縁または外側は圧縮されており、タンデムバブルによって誘発された噴射流によって生じる不均一性と細胞変形を示しています。セル前縁での面積ひずみの時間的変動は、いくつかの急速な振動とそれに続く約100マイクロ秒の大規模で持続的なストレッチ、およびその後の数ミリ秒の時間スケールでの緩やかな回復で構成されます。このビデオを見れば、制御可能なバブル-バブル相互作用を行い、表面パターニングから形状と位置が制御された単一細胞の生体効果を研究する方法について十分に理解できるはずです。
この手順に続いて、細胞骨格の菲薄化や夫婦のイメージングなどの他の対策をさらに実行して、タンデムバブル治療の細胞細胞骨格の再構成を研究することができます。開発後、この技術は、亜精密超音波の分野の研究者が単一細胞レベルでのキャプテーション誘発生物学的効果を調査するための道を開くでしょう。この手順を試みる際には、細胞のパターニングを成功させるために、良好な細胞の密度と状態を維持することを覚えておくことが重要です。
クリーンルームの化学薬品やレーザーの取り扱いは非常に危険である可能性があるため、この手順を実行するときは、手袋やレーザーゴーグルの着用などの予防措置を常に講じる必要があることを忘れないでください。
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概要
この研究は、マイクロ流体学的制約下でのキャビテーション誘発バイオ効果を調査し、バブル生成と細胞配置の精密制御のために表面パターニングを活用しています。マイクロ流体チップにより、細胞膜のポレーションや細胞内カルシウム応答などのバイオ効果の検討が可能になります。
主要な研究要素
科学の領域
- マイクロ流体学
- 細胞生物学
- キャビテーションのバイオ効果
背景
- マイクロ流体システムは、バブルと細胞の制御された実験を可能にします。
- 表面パターニングにより、細胞配置とバブル生成の精度が向上します。
- バイオ効果の理解は治療応用に不可欠です。
- 視覚的な実演は複雑な手順を理解するのに役立ちます。
研究目的
- 個々の細胞に対するキャビテーションバブルのバイオ効果を探求すること。
- 実験の精密制御に表面パターニングを活用すること。
- バブルの相互作用が細胞挙動に与える影響を評価すること。
使用した方法
- バブル生成のためのマイクロ流体チップの製作。
- 粒子画像測速法を用いた流れ場の特徴付け。
- 細胞膜のポレーションと変形の調査。
- 細胞内カルシウム応答の測定。
主要な結果
- タンデムバブルとパターン化された細胞島の成功的な生成。
- 流れ場の特徴付けにより、バブルダイナミクスに関する洞察が得られました。
- 観察されたバイオ効果には膜のポレーションとカルシウム応答が含まれていました。
- 表面パターニングにより実験の精度が大幅に向上しました。
結論
- マイクロ流体システムはキャビテーションのバイオ効果を研究するのに効果的です。
- 表面パターニングは細胞相互作用の制御に有用な技術です。
- この研究結果はキャビテーションの治療応用理解に貢献します。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Precise microfluidic systems with surface patterning enable controlled investigation of cavitation-induced bioeffects at the single-cell level, supporting mechanistic de-risking in early discovery. This platform allows for reproducible interrogation of cell membrane responses and intracellular signaling under defined shear stress conditions. Such capabilities enhance predictive confidence for therapeutic hypothesis testing and portfolio triage in biopharma R&D.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables mechanistic interrogation of cell membrane poration and deformation under controlled jetting flow.
- Supports functional target validation by quantifying localized bioeffects at single-cell resolution.
- Facilitates predictive confidence in pathway modulation by measuring intracellular calcium responses.
- Provides a platform for biological de-risking through precise manipulation of cell-bubble interactions.
Screening & Assay Development
- Prepares validated microfluidic systems for downstream single-cell analysis workflows.
- Standardizes assay conditions by controlling cell placement and bubble generation via surface patterning.
- Enables reproducible quantitative outputs such as membrane strain and macromolecule uptake.
- Supports reliable evaluation of compound or intervention effects on cell bioresponses.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant mechanistic studies by modeling localized shear stress and cellular response.
- Provides continuity from discovery to preclinical validation through quantitative single-cell bioeffect measurement.
- Enables risk-adjusted advancement decisions by clarifying cellular response heterogeneity.
- Supports predictive de-risking for translational biomarker development when relevant.
Pipeline & Workflow Integration
This microfluidic system integrates into the discovery continuum from early mechanistic studies to preclinical model validation, supporting both hypothesis testing and quantitative analytics.
- Discovery Biology: Facilitates hypothesis testing of cavitation-induced effects and pathway clarification at the single-cell level.
- Screening: Provides assay readiness and reproducibility through standardized patterning and bubble generation.
- Analytics: Delivers quantitative measurements of membrane deformation, macromolecule uptake, and calcium signaling.
- Translational Research: Bridges discovery and preclinical research by modeling localized cellular bioeffects relevant to therapeutic interventions.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable microfluidic platform adaptable to various cell types and mechanistic studies.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Enhances standardization, reproducibility, and scalability of single-cell bioeffect assays.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by clarifying cellular response thresholds.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of discovery-stage assets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microfabrication, surface patterning, and high-speed imaging.
- Needs access to clean room facilities, pulsed lasers, and advanced microscopy infrastructure.
- Demands rigorous cross-team standardization for reproducible cell patterning and bubble generation.
- Adaptable to different cell types and experimental conditions with protocol optimization.
- Practical limitations include the complexity of fabrication and the need for precise alignment and timing control.
