ファージディスプレイを使用してE3リガーゼ用ユビキチンバリアント変性変性器を開発する
August 27th, 2021
ユビキチン化は翻訳後修飾の重要なタンパク質であり、その中で多くのヒト疾患に関与している調節不全である。このプロトコルは、ファージディスプレイを使用して、ユビキチン化の特異性、効率、パターンを制御するE3リガスの活性を結合および調節できる新しいユビキチン変異体を分離する方法を詳述する。
ファージディスプレイは、臨床的に重要な酵素の結合特性を調べるだけでなく、それらの酵素および対応する疾患のモジュレーターを開発するのに役立ちます。ファージディスプレイは、幅広い標的タンパク質の新規結合剤を開発するために使用することができ、また他の従来の表示方法よりも容易に実行できます。この手順には多くの繰り返しアクションが含まれるため、重要なのは自動操縦ではなく、全体に集中し続ける方法です。
種子培養の200マイクロリットルで2YTテトラサイクリンスープの30ミリリットルを接種することから始めます。細菌が中対数相になるまで200 RPM軌道揺れで37°Cで約3時間インキュベートします。プレートからシンクにコーティング溶液を捨てます。
ペーパータオルでやさしく乾かします。その後、各コーティングウェルにPBバッファーの200マイクロリットルを追加します。PBバッファーをプレートから捨て、ペーパータオルで乾かします。
プレートのコーティングウェルに別の200マイクロリットルのPBバッファーを追加します。300 RPM軌道揺れで室温で1時間インキュベートします。氷の上でファージライブラリを解凍し、PBSでライブラリの多様性を100倍に希釈します。
ポリエチレングリコール塩化ナトリウム溶液を希釈したライブラリの体積の5分の1に加え、氷上で30分間インキュベートします。次に、摂氏4度で30分間Gの11,000倍の溶液を遠心分離する。上清を捨て、さらに2分間遠心分離機を捨てて残りの上清を引き下げ、ファージペレットを濃縮します。
分析される標的タンパク質当たりPBTバッファーの1ミリリットルでファージペレットを穏やかに再懸濁し、通常は合計で4個。コントロールプレートでよくコーティングされた各ファージライブラリに100マイクロリットルのファージライブラリを追加します。300 RPM軌道揺れで室温で1時間インキュベートします。
PBバッファーをターゲットプレートからシンクに捨て、ペーパータオルでプレートを乾かします。制御プレート内のファージライブラリーの全100マイクロリットルを、対象プレートの各被覆ウェルに移します。300 RPM軌道揺れで室温で1時間インキュベートします。
次に、ファージライブラリをプレートから取り出し、コーティングしたウェルをPTバッファーで4回洗浄します。プレートを反転し、ペーパータオルをタップして、バッファーの最後の滴を取り除きます。100マイクロリットルの0.1モル塩酸をコーティングした各々に加えてファージを溶かします。
300 RPM軌道揺れでプレートを室温で5分間インキュベートします。その後、12.5マイクロリットルのpH11モルトリス塩酸塩をそれぞれ十分にコーティングしてpHを中和します。溶出したファージを8つの井戸すべてから1つの1.5ミリリットルマイクロ遠心分離チューブに移します。
ピペットは、溶液を均質にし、井戸からすべての液体を吸引するために、転送中に上下します。溶出したファージに10%BSAを加え、最終的な濃度を1%摂氏4度でマイクロ遠心分離管に保存します。これはラウンド1出力です。
寒天プレートから単離された大腸菌コロニーを用いて2YTテトラサイクリン種子培養の5ミリリットルを接種することにより、次の選択の段階のためのファージ入力を培養するための種子培養を準備します。200 RPM軌道揺れで摂氏37度で一晩インキュベートします。適切な量のPBSで2本と3本のチューブを丸めて標的タンパク質を希釈します。
ラウンド2と3チューブの内容の半分を取り、次のラウンドのために96ウェル結合プレートでターゲットタンパク質ごとに4つの井戸をコーティングします。次に、ラウンド1出力の半分を使用して、3ミリリットルの中ログ位相細胞を接種します。200 RPM軌道揺れで30分間摂氏37度でインキュベートします。
M13KO7ヘルパーファージをミリリットル当たり100億PFUの最終濃度に加えます。200 RPM軌道揺れで摂氏37度で再び1時間インキュベートします。1時間後、培養3ミリリットル全体を2YTカルベニシリンカナマイシン溶液の30ミリリットルに移す。
200 RPM軌道揺れで摂氏37度で一晩成長します。UBE4Bに対するユビキチンバリアント選択の代表結果を以下に示します。VPVは最も高い周波数から最低の周波数に注文されました。
配列は、すべてのランダム化残基を有するUBVの多様なユビキチン領域を表す。結合剤の結合親和性を野生型標的タンパク質に対して、変異標的タンパク質、ならびにオフターゲットタンパク質は、酵素結合免疫吸着アッセイまたはELISAによって測定される。すべてのELISA吸光度を96の平均BSA ELISAスコアおよび96の平均GST ELISAスコアに対して正規化した。
濃い緑色は、強い相対結合を表します。GSTは、標的タンパク質がGSTタグ付けされているため、非特異的結合のコントロールとして含まれていた。ELISA の結果は、ここでグラフィカルに表示されます。
X 軸は VV を表し、y 軸は対応する正規化された吸光度を表します。この手順を試みる場合は、塩酸を添加した後にプレートに溶液を捨てないでください。ファージは溶液中で中断され、後続の濃縮最終分析またはその両方を実行できるように、これらを維持したいと考えています。
この手順に従って、UBV周波数を決定するためにシーケンスを実行する必要があります。ELISAおよびIC50アッセイは、それぞれ結合性有効性および阻害効果を決定し、さらに特徴付けるVPVを決定するのに役立ちます。
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概要
この記事では、ユビキチン化に関与するE3リガーゼを調節できる新しいユビキチンバリアントを分離するためにファージディスプレイを使用する方法について説明します。ユビキチン化は、様々なヒトの疾患に関連する重要な翻訳後修飾です。
主要な研究構成要素
科学の分野
- 神経科学
- 生化学
- タンパク質工学
背景
- ユビキチン化はタンパク質の分解と細胞プロセスの調整に不可欠です。
- ユビキチン化の調節異常は多くの疾患と関連しています。
- ファージディスプレイはタンパク質相互作用を発見するための強力な技術です。
- この方法により酵素の特定の調節剤の開発が可能になります。
研究の目的
- ファージディスプレイを使用して新しいユビキチンバリアントを分離する。
- これらのバリアントがE3リガーゼの活性にどのように影響を与えるかを理解する。
- 疾患の文脈におけるユビキチン調節の意味を探る。
使用された方法
- 2YTテトラサイクリンブロスでの細菌培養の接種。
- 37度セルシウスでの振とう器上でのインキュベーション。
- 結合アッセイのためのファージディスプレイ技術の利用。
- ユビキチンバリアントの分離と特徴付け。
主要な結果
- 新しいユビキチンバリアントの成功的な分離。
- E3リガーゼへの結合特性の実証。
- これらのバリアントがユビキチン化パターンを調節する可能性。
- 疾患メカニズムにおけるユビキチン化の役割への洞察。
結論
- ファージディスプレイはユビキチンバリアントを発見するための効果的な方法です。
- E3リガーゼの活性を調節することは治療上の意味を持つ可能性があります。
- これらの発見の臨床応用を探るためのさらなる研究が必要です。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Phage display-driven engineering of ubiquitin variants (UbVs) enables precise modulation of E3 ligases, a critical inflection point for target validation in ubiquitin-proteasome system research. This approach enhances predictive confidence in early discovery by generating high-affinity, specific binders for mechanistic de-risking and functional interrogation of E3 ligase biology. The resulting UbVs support portfolio triage and prioritization by providing robust tools for downstream assay development and translational research.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables systematic interrogation of E3 ligase function using engineered UbVs with improved affinity and specificity.
- Supports biological de-risking by isolating variants that discriminate between wildtype and mutant or off-target proteins.
- Facilitates predictive confidence in target engagement and mechanistic studies through iterative selection and enrichment.
Screening & Assay Development
- Provides validated UbVs for use in ELISA and IC50 assays to quantify binding and inhibitory efficacy.
- Enables reproducible, quantitative assessment of UbV-target interactions across multiple rounds of selection.
- Supports assay standardization and scalability for reliable compound evaluation and screening workflows.
Translational & Preclinical Research
- Aligns engineered UbVs with disease-relevant E3 ligases for translational biomarker studies when supported by downstream characterization.
- Maintains continuity from discovery through preclinical validation by enabling further functional and inhibitory profiling of selected UbVs.
- Reduces mechanistic ambiguity in preclinical models by providing specific molecular tools for pathway interrogation.
Pipeline & Workflow Integration
This phage display platform integrates from early discovery through lead identification, supporting both hypothesis testing and quantitative assay development for E3 ligase modulators.
- Discovery Biology: Iterative selection and enrichment clarify E3 ligase binding pathways and validate target engagement.
- Screening: ELISA and IC50 assays with UbVs deliver reproducible, quantitative outputs for downstream evaluation.
- Analytics: Sequencing and absorbance normalization enable robust comparison of UbV binding profiles and selection frequencies.
- Translational Research: Characterized UbVs can be advanced for further disease-relevant studies as supported by binding and inhibition data.
- Enterprise Reuse: The phage display workflow is adaptable for diverse E3 ligases and other protein targets, supporting platform scalability.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in E3 ligase target validation.
- Operational Value: Standardizes binder selection and assay development for reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Enables informed go/no-go decisions and capital-efficient advancement of validated targets.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of E3 ligase modulators across discovery programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in phage display, protein engineering, and quantitative binding assays.
- Demands access to bacterial culture, phage handling, and ELISA instrumentation.
- Necessitates cross-team standardization of selection, washing, and analytical protocols.
- Adaptable to various E3 ligases and target proteins with appropriate library design.
- Dependent on rigorous washing and selection to avoid enrichment of weak or promiscuous binders.
