同所性骨肉腫および肺転移マウスモデルを生成するための脛骨内骨肉腫細胞注射
2021年10月28日
本プロトコールは、同所性骨肉腫および肺転移病変を有するマウスモデルを生成するための脛骨内骨肉腫細胞注射を記載する。
このプロトコルは、原発性骨肉腫および肺転移病変を有するマウスモデルを生成する技術を記述する。骨肉腫細胞の脛骨内注射によって、このモデルは腫瘍骨肉腫の臨床発達特性を最もよく模倣する。正確な数の骨肉腫細胞は、マイクロボリュームシリンジを使用して脛骨に直接注入され、同一の腫瘍形成速度および腫瘍体積を可能にする。
骨肉腫細胞注射の日に、PBSで細胞を2回洗浄する。1.5ミリリットルの0.25%トリプシンで細胞を3分間トリプシン処理する。次いで、6ミリリットルの10%血清含有MEM培地を加える。
細胞を15ミリリットルの遠沈管に集める。20マイクロリットルの細胞懸濁液を細胞計数プレートのチャンバー内に吸引し、自動セルカウンターを用いて細胞濃度を算出した。細胞を800倍gで室温で5分間遠心分離する。
上清をピペットで吸引し、細胞ペレットを8.5ミリグラム/ミリリットルの基底膜マトリックスに再懸濁し、氷上に置きます。マウスを仰臥位に置きます。親指と人差し指でマウスの足首を持ち、脛骨の注射部位を70%エタノール綿棒で消毒します。
各マウスの足首関節を外側に回転させて脛骨と腓骨を動かし、近位脛骨プラトーが皮膚を通して見えるまで膝関節を適切な位置に曲げる。針を1ミリリットルのシリンジに取り付け、針先を脛骨の軸に平行な注射部位に向けて向ける。経皮的に針を挿入して、脛骨プラットフォームを通って脛骨の遠位端に向かって穴を開ける。
氷上に予め置いた骨肉腫細胞懸濁液をマイクロボリュームシリンジにロードし、脛骨内の1ミリリットルのシリンジを骨肉腫細胞搭載マイクロボリュームシリンジと交換する。約10マイクロリットルの骨肉腫細胞懸濁液を、あまり圧力をかけずに各無胸腺マウスの脛骨にゆっくりと注入する。その後、注射部位からマイクロボリュームシリンジを取り出し、綿棒で約30秒間部位を押す。
マウスを清潔なケージに戻し、10分間その回復を観察します。この図は、脛骨内骨肉腫細胞注射およびその単離された形態から発症した同所性骨肉腫を有するマウスモデルを描写する。腫瘍体積の漸進的な増加が毎週観察される。
ルシフェラーゼ標識骨肉腫細胞の注射後1週目から6週目にかけて得られたX線画像は、体積の漸進的な増加を示した。さらに、マウス脛骨への注射後に得られた画像は、生体内での同所性骨肉腫増殖を示した。骨肉腫細胞の脛骨内注射によって引き起こされる肺転移を、生物発光ライブイメージングシステムを用いてインビボで追跡することに成功した。
実体顕微鏡下での観察により、単離された肺組織における転移性コロニーが明らかになった。パラフィン包埋肺組織上のHE染色は転移性病変を示した。針は、膝蓋骨靭帯を介して関節カプセルに経皮的に挿入され、シリンジを回転させることによって、デジタル脛骨に向かって脛骨プラットフォームを介して穴をあけるべきである。
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概要
本プロトコルでは、原発性骨肉腫および肺転移病変を有するマウスモデルを作製する手法について解説します。骨肉腫細胞を脛骨内に注入することで、本モデルは腫瘍性骨肉腫の臨床的な進展特性を最適に再現します。
研究の主要構成要素
科学分野
- 神経科学
- 腫瘍学
- 動物モデル
背景
- 骨肉腫は、小児および青少年に多く見られる一般的な骨癌です。
- その転移を理解することは、効果的な治療法を開発するために極めて重要です。
- 腫瘍の挙動や治療反応を研究するには、動物モデルが不可欠です。
- 脛骨内注射により、局所的な腫瘍増殖および転移の研究が可能になります。
研究目的
- 骨肉腫研究のための信頼性の高いマウスモデルを確立すること。
- 原発腫瘍とその転移の特性を調査すること。
- 制御された環境下で治療戦略の検証を容易にすること。
使用した手法
- マイクロボリュームシリンジを用いた骨肉腫細胞の脛骨内注入。
- 注入前のPBSによる細胞の洗浄。
- 注入準備のための細胞のトリプシン処理。
- 注入後の腫瘍形成率および腫瘍体積のモニタリング。
主な結果
- モデル全体で一貫した腫瘍形成率が達成されました。
- 同一の腫瘍体積が観察され、再現性が示されました。
- モデルにおいて肺転移の確立に成功しました。
- 本モデルは、骨肉腫進行の臨床的特徴を反映しています。
結論
- 脛骨内注射法は、骨肉腫モデルの作製に有効である。
- 本モデルは、今後の治療研究に利用可能である。
- これらの知見は、骨肉腫の生物学および治療の理解に寄与する。
よくある質問
業界における重要性
脛骨内注射によって作製される正位性骨肉腫モデルは、再現性のある腫瘍形成および肺転移を可能にし、標的の妥当性確認や治療 efficacy 試験のための臨床的に関連したシステムを提供します。この手法は、免疫不全マウスにおいてヒトの疾患進行を再現することで、原発巣および転移巣の負荷の経時的なモニタリングを可能にし、メカニズム面でのリスク低減を支援します。本モデルは生物発光イメージングおよびX線イメージングに対する感度が高いため、腫瘍学のパイプラインにおける前臨床段階のgo/no-go判断に不可欠な定量的リードアウトを容易にします。
バイオファーマR&Dにおける戦略的応用
初期発見およびターゲットバリデーション
- 科学的価値：ヒト骨肉腫の癌化および肺転移を模倣した疾患関連システムにおいて、治療仮説の検証を可能にする。
- 運用的価値：一貫した腫瘍生着率と測定可能な成長キネティクスを提供し、信頼性の高いターゲット結合およびパスウェイ調節研究を実現する。
- 予測的価値：臨床的な転移パターンを反映することで前臨床モデルの選択を支援し、ターゲット優先順位付けの信頼性を向上させる。
スクリーニングおよびアッセイ開発
- 科学的価値： 下流の薬剤スクリーニングに使用される検証済み生物学的システムの構築に適した、標準化された同所性腫瘍を作製する。
- 運用的価値： イメージングによる腫瘍体積および転移負荷の再現可能な定量化を可能にし、研究間でのアッセイの標準化を支援する。
- 拡張性： インキュベーション期間が短く成長が速いため、適時な化合物の評価およびリード化合物同定キャンペーンにおけるプラットフォームの再利用が可能である。
トランスレーショナル・前臨床研究
- トランスレーショナルな連続性：肺転移を主要な致死的表現型とする臨床的な骨肉腫の進行を反映しており、患者の転帰と一致している。
- メカニズムの低リスク化：生理学的文脈を備えたモデルにおいて、腫瘍微小環境の相互作用および転移の駆動因子の評価が可能となる。
- 治療評価：候補物質のin vivoでの有効性試験を促進し、原発腫瘍および転移病変をエンドポイント解析のために単離できる。
パイプラインおよびワークフローへの統合
このモデルは、ターゲットのバリデーションからリード化合物の同定、そして前臨床段階での有効性評価に至る創薬の連続的なプロセスに適合しており、特に骨親和性薬剤や転移調節薬剤の評価に有用です。
- 探索生物学：正位移植および免疫不全ホストシステムを用いて、骨肉腫のドライバー因子および転移抑制因子の仮説検証をサポートします。
- スクリーニング：定量的なイメージングベースの出力（生物発光、X線）を提供し、腫瘍の成長および播種に対する治療効果の比較を可能にします。
- 解析：腫瘍量および転移発生率に関する縦断的かつ定量可能な指標を提供し、部門横断的なデータ解釈を支援します。
- トランスレーショナルリサーチ：臨床的に関連のある転移パターンを通じて、初期のメカニズム解明の結果を前臨床検証へと結びつけます。
- 企業内での再利用：骨肉腫オンコロジープログラムのための再利用可能なプラットフォームを構築し、プロジェクト間でのモデル再開発の負担を軽減します。
運用およびエンタープライズへの影響
- 科学的価値：肺への転移播種を含む骨肉腫進行の全スペクトラムをモデル化することにより、予測の信頼性を向上させる。
- 運用の価値：標準化された細胞調製、注入技術、およびイメージングベースのモニタリングを通じて、再現性を確保する。
- 戦略的価値：転移感受性エンドポイントを介して効果のない候補物質を早期に検出できるようにし、資本効率を改善する。
- ポートフォリオへの影響：腫瘍-ストロマ相互作用および転移能に関するメカニズム的知見を提供し、リスク調整済みの開発推進に関する意思決定に寄与する。
実施上の考慮事項
- 正位注入技術および免疫不全マウスモデルの取り扱いに関する専門知識が必要です。
- 微量シリンジ、基底膜マトリックス、および生物発光/X線イメージングシステムへのアクセスが必要です。
- 再現性のある結果を得るためには、細胞調製、注入量、およびエンドポイント基準に関するチーム間の標準化が必要です。
- 他の骨肉腫細胞株に適応させる場合、マトリックス濃度および注入量の最適化が必要になる場合があります。
- 実際的な制限として、注入精度によるモデルの個体差や、IACUC（施設動物ケアおよび使用委員会）に準拠した腫瘍サイズのエンドポイント設定が挙げられます。
