同時2光子インビボイメージング

以下に説明するすべての実験手順は、ポーランド科学アカデミーのNenscki Institute of Experiemental BiologyのLocal Ethical Committeeによって承認されました。このビデオは、マウス後脾皮質のニューロンの慢性イメージングを可能にする開頭術の手順を示しています in vivo 2光子顕微鏡 足のトランスジェニックラインで。このアプローチは、背側海馬に発現するアデノ随伴ウイルスであるAAVのmCherryの注射と組み合わされます。

これらの技術を組み合わせることで、経験した依存症、後脾皮質の構造的可塑性の長期的なモニタリングが可能になります。この論文では、二光子in vivo顕微鏡法の関心領域として、後脾皮質の上の頭蓋窓の移植を提案します。神経細胞構造の形態変化を可視化するために、脳内の神経細胞の約10%に蛍光GFPタンパク質を発現させたBマウスのone-Gを用いています。

私たちが提案するもう一つの革新は、AAVを注入し、ニューロン特異的なプロモーターの下で蛍光タンパク質mCherryを海馬などの脳のより深い構造に発現させ、構造が後脾臓皮質に投影されることを視覚化することです。オートクレーブ内のすべてのツール、液体用のガラス容器、綿棒を滅菌します。あなたは使い捨ての手袋です。

手術台、定位フレーム、および周囲のすべてを70%エタノールで清掃します。滅菌されたサージカルパッドを使用して、すべての滅菌済み機器のための無菌スペースを作成します。ジェルフォームを細かく切り、滅菌生理食塩水に浸します。

動物を誘導室に入れ、イソフルランレベルを5%に設定し、酸素流量を毎分2リットルに設定します。この手順には約 3 分かかります。動物を誘導室から取り出します。

動物が完全に鎮静されていることを確認するために、尾またはつま先のつま先ピンチを使用してください。精密なトリマーを使用して、後頭部から耳の間、目まで髪を剃ります。動物を定位フレームに置き、イヤーバーで頭を安定させます。

麻酔レベルを1.5〜2%イソフルランとゼロポイント3リットル/分酸素に設定します。目の軟膏を塗ります。トルフェジン(1キログラムあたり4ミリグラム)、ブトミドール(1キログラムあたり2ミリグラム)、バイトリル(1キログラムあたり5ミリグラム)を動物に皮下注射して、それぞれ炎症、痛み、感染を防ぎます。

脳の腫れを防ぐために、動物にデキサメタゾン(ゼロポイント2ミリグラム/キログラム)を筋肉内注射します。滅菌綿棒を使用して、ベタジンと70%エタノールを混ぜて皮膚をきれいにします。手袋を交換し、70%エタノールをスプレーします。

鉗子で皮膚を持ち上げ、マイクロハサミを使用して、頭の付け根に沿って水平に皮膚を切開し、次に目の間の前点まで斜めに切開します。スキンフラップを取り外します。過度の出血や痛みを防ぐために、滅菌綿棒でリドカイン軟膏を骨膜に塗布します。.

滅菌綿棒またはメスを使用して骨膜を取り除きます。.滅菌綿棒で頭蓋骨を乾かします。滅菌針を使用して、皮膚の端に高密度のシアノアクリレート接着剤を塗布して固定し、歯科用セメントとの接触を防ぎます。

接着剤が乾くのを待ちます。ラムドイド縫合糸の前方の頭蓋骨に滅菌済みの3ミリメートルカバーガラスを置きます。カバー スリップを後脾座標、前部、後部ブレグマ マイナス 2 ポイント 8、内側外側ブレグマ 0 の中央に配置します。

滅菌針で頭蓋骨の表面を引っ掻いて、カバーの滑り端に印を付けます。カバーガラスを70%エタノールを含む滅菌容器に戻します。直径の小さいバーを備えた高速デンタルドリルを使用して、直径3ミリメートルの円の輪郭を描きます。

滅菌生理食塩水綿棒で骨粉から穴あけ部位を清掃します。ジェルフォームと綿棒を使用して、時折の出血を止め、骨をきれいにします。穴あけの合間に、細かい鉗子で骨の輪にそっと触れて骨の厚さを確認し、その可動性を確認します。

縫合部の骨が太くなっていることを念頭に置いてください。骨の輪が可動し、円周にさらに薄い骨の層だけが残っている場合は、穴あけを停止します。生理食塩水の先端を綿棒で、残りのすべての骨粉の手術場をきれいにします。

滅菌生理食塩水を穴あけエリアに落とし、ドリルした円を覆います。細い鉗子で骨の輪を慎重にこじ開けてから、骨を上に持ち上げて優しく、しかししっかりと取り除きます。硬膜への損傷を防ぐために、骨輪を持ち上げるときに骨円を歪めないように注意してください。

滅菌生理食塩水に浸したジェルフォームを硬膜にそっと塗布して、出血を抑えます。すべての出血が完全に止まるまで待ちます。.凝固プロセスを邪魔しないように、ジェルフォームを慎重に取り外します。

縫合部は血管新生が多いため、この時点での出血が深刻であることが判明する可能性があることに注意してください。出血が止まるのに十分な時間を待つことが不可欠です。輸液ポンプを定位タワーに取り付け、コントローラーを接続します。

35ゲージの針を充填シリンジに挿入します。シリンジをエタノールで10回洗い流して滅菌し、滅菌生理食塩水で10回洗い流して微量のエタノールを取り除きます。シリンジから気泡を取り除きます。

シリンジをポンプに挿入します。AV製剤を1回分充填し、氷の上に保ちます。シリンジにウイルス溶液を入れます。

針をブレグマの中央に配置し、次に次の座標を使用して海馬に静かに挿入します:前部、後部マイナス2、内側外側プラスマイナス1、背側腹側マイナス1。これらの座標は、頭蓋領域の端近くに配置されます。組織が安定するまで5分間待ちます。

ゼロポイント7マイクロリットルのAV溶液を毎分50ナノリットルの速度で注入します。ウイルスが完全に吸収されるまで10分待ちます。針をそっと取り外します。

出血が発生した場合は、ジェルフォームで吸い取ります。反対側で繰り返します。滅菌乾燥カバーガラスを硬膜の上部にドリルで開けた円フレームに置きます。.

カバーガラスを前頭筋で保持して硬膜を静かに平らにし、カバーガラスの端を頭蓋骨の表面に近づけます。滅菌針を使用して、カバーガラスの端に高密度のシアノアクリレート接着剤を塗布して、頭蓋骨に取り付けます。接着剤が乾くのを待ちます。

頭蓋骨の前部に固定バー、アントンナット、またはカスタムメイドのデザインを置きます。固定バーは、イメージングセッション中に頭蓋窓を水平に配置できる位置に配置する必要があることに注意してください。バーの端に接着剤を塗ります。

接着剤が乾くのを待ちます。固定バーは窓からできるだけ離して配置する必要があることに注意してください。窓に近すぎると、バーとカスタムメイドのホルダーに接続するネジが、イメージングプロセス中に対物レンズの障害となる可能性があります。

歯科用アクリルを準備し、ガラスの周りの頭蓋骨の表面に貼り付けます。窓の周りにクレーターのような形を作ると便利です。これは、後で水対物レンズでイメージングするために適用される水の空洞を作成します。

歯科用アクリルでキャップを作成し、手術領域の残りの部分を覆う 皮膚の端 固定バー 頭蓋窓の周りのクレーターを補強します。歯科用セメントが固まるのを待ちます。動物を定位フレームから取り外し、回収チャンバーに入れます。

動物が手術から回復するのを待ちながら、生理機能を観察します。術後麻酔のシロプロフェリンを1キログラムあたり10ミリグラム、および抗生物質治療バイトリルを1キログラムあたり5ミリグラムを48時間適用します。tiサファイアレーザーを開始し、顕微鏡の電源を入れます。

この実験で使用したシステムは、2光子レーザー、OPOシステム、およびデュアルガリウムヒ素偽造PMTを備えており、動物を誘導室に入れて麻酔を誘発します。動物を誘導室から取り出し、顕微鏡下のガス麻酔マスクに入れます。

酸素の流れをゼロポイントに3リットル/分に減らし、イソフルラン濃度を1.52%MTスクリューまたは別のカスタムシステムで動物をカスタム顕微鏡フレームに固定します。頭蓋窓を水平にします。顕微鏡メーカーの頭部固定システムを使用することも可能ですが、特定のカスタムフレームを使用すると、慢性実験中の複数のセッションでより良い結果が得られ、頭部の安定性が向上し、一定の位置決めが可能になります。

広視野顕微鏡の設定、低倍率の対物レンズを使用して、後脾皮質の片側にビューを中央に配置し、カバースリップ面に焦点を合わせます。クレーター状のアクリルウェルに水滴を塗ります。長距離水浸対物レンズに切り替えます。

水の半月板が標本と対物レンズを接続するまで、対物レンズを頭蓋窓に向かって動かします。2光子設定に切り替えて、最小ズームを使用して試料を上から下にスキャンし始めます。硬膜物質の交差は、高い非特異的信号のグレアとして見えます。

蛍光細胞からのシグナル強度に応じて、GFPとmCherryの両方のチャンネルで顕微鏡の取り込み設定を調整し、ダイナミックレンジ全体をカバーします。樹状突起が他の細胞から分離された適切なニューロンを見つけた後、最小ズームとZ距離5ミクロンに設定されたGFPフィルターのみを使用して初期スキャンを実行します。スキャンスタックの最大投影を取得し、反転色を使用して注釈用に印刷します。

ズームを、目的の形態学的詳細を画像化できる値に設定します。最大投影をガイドとして使用して、GFPおよびmCherryチャネルで樹枝状樹全体を画像化します。このプロトコルを使用すると、後脾臓皮質のシナプス前構造とシナプス後構造の両方を繰り返し監視することが可能になります。

このアプローチは、樹状突起、シナプススパイン、またはシナプス前中性子の形態の変化時に行動操作が相関すると予想される慢性実験で利用できる可能性があります。イメージングセッションは任意の頻度で行うことができますが、動物の適切な回復を可能にし、麻酔の影響を最小限に抑えるために、24時間の時間間隔が好ましいです。この技術を適切に適用すれば、数ヶ月にわたって複数のイメージングセッションを実行することができます。