同時2光子

以下に述べるすべての実験手順は、ポーランド科学アカデミーのネンツキ実験生物学研究所の局所倫理委員会によって承認されました。このビデオでは、thi one-G of feetトランスジェニックラインを用い、生体二光子顕微鏡法によってマウスの後帯状皮質におけるニューロンの慢性的なイメージングを可能にする開頭術の手順を示します。この手法は、背側海馬へのmCherry発現アデノ随伴ウイルス（AAV）の注入と組み合わせて行われます。

これらの手法を組み合わせることで、依存状態の持続的なモニタリングおよび後帯状皮質における構造的可塑性の観察が可能になります。本論文では、2光子in vivo顕微鏡観察の関心領域として、後帯状皮質上の頭蓋窓の設置を提案します。神経構造の形態学的変化を視覚化するため、脳内のおよそ10%のニューロンで蛍光GFPタンパク質を発現するThy1-GFPマウスを使用します。

私たちが提案するもう一つの革新的な手法は、海馬などの脳の深部構造に、ニューロン特異的プロモーターの下で蛍光タンパク質mCherryを発現するAAVを注入し、その構造から後帯状皮質への投射を可視化することです。すべての器具、液体用ガラス容器、および綿棒をオートクレーブで滅菌してください。使い捨て手袋を着用してください。

手術台、定位固定フレーム、およびその周辺領域すべてを70% ethanolで清掃します。滅菌済みの手術用パッドを用いて、滅菌済み器具を置くための滅菌領域を確保します。ゲルフォームを小さく切り、滅菌生理食塩水に浸します。

動物を導入チャンバーに入れ、イソフルラン濃度を5%、酸素流量を2 L/minに設定します。この処置に約3分かかります。その後、動物を導入チャンバーから取り出します。

動物が完全に鎮静されていることを確認するため、尾または足先をつまみます。精密トリマーを用いて、耳の間から目の上のあたりまで、後頭部の毛を剃ります。動物を定位固定フレームに配置し、イヤーバーで頭部を固定します。

麻酔レベルを1.5～2%のisofluraneおよび0.3 L/minの酸素に設定します。眼軟膏を塗布します。炎症、疼痛、および感染をそれぞれ防止するため、tolfedineを4 mg/kg、butomidorを2 mg/kg、そしてBaytrilを5 mg/kg、動物に皮下注射します。

脳浮腫を防止するため、デキサメタゾン 0.2 mg/kg を動物に筋肉内注射します。ベタジンを浸した滅菌綿棒で皮膚を清浄し、続いて 70% ethanol で清浄します。手袋を交換し、70% ethanol をスプレーします。

ピンセットで皮膚を持ち上げ、マイクロ鋏を用いて頭部の基底に沿って水平に皮膚を切開し、次いで両眼の間の前面に向かって斜めに切開します。皮膚フラップを除去します。過剰な出血と痛みを防ぐため、滅菌綿棒を用いて骨膜にリドカイン軟膏を塗布します。

滅菌綿棒またはメスを使用して骨膜を除去します。滅菌綿棒で頭蓋骨を乾燥させます。滅菌針を用い、皮膚の縁に高粘度シアノアクリレート系接着剤を塗布して固定し、歯科用セメントとのさらなる接触を防ぎます。

接着剤が乾くまで待ちます。滅菌済みの3 mmのカバーガラスを、ラムダ縫合（lambdoid suture）より前方の頭蓋骨上に配置します。カバーガラスを後帯状皮質（retrosplenial）の座標（ブレグマから前方/後方 -2.8 mm、内側/外側 0 mm）に合わせて中心に据えます。

滅菌済みの針で頭蓋骨表面をひっかき、カバースリップの端に印を付けます。カバーガラスを70% ethanolが入った滅菌容器に戻します。小径のバーを装着した高速歯科用ドリルを使用して、直径3 mmの円を描くように切り出します。

滅菌生理食塩水を浸した綿棒を使用して、穿孔部位から骨粉を除去します。必要に応じてゲルフォームと綿棒を使用し、出血を止めて骨を洗浄してください。穿孔の合間に、微細鑷子で骨の円周部分を軽く触れ、可動性を確認することで骨の厚さをチェックします。

縫合線付近では骨が厚いことに留意してください。骨の円形部分が可動し、周囲に均一で薄い骨層だけが残った時点でドリリングを停止します。生理食塩水に浸した綿棒を用いて、術野から残っている骨粉をすべて清掃します。

穿孔部位に滅菌生理食塩水を滴下し、穿孔した円状の領域を覆います。微細鑷子を用いて慎重に骨円をこじ開け、上方に持ち上げるようにして、ゆっくりと、かつ確実に骨を取り除きます。硬膜を損傷させないよう、持ち上げる際に骨円を傾けないように注意してください。

滅菌生理食塩水に浸したゲルフォームを硬膜上にそっと適用し、止血を促します。完全に止血されるまで待ちます。凝固プロセスを妨げないよう、注意してゲルフォームを取り除きます。

注意点として、縫合部位は血管が豊富であるため、この段階で激しい出血が起こる可能性があります。出血が止まるまで十分に待機することが不可欠です。輸液ポンプをステレオタキシス装置に取り付け、コントローラーを接続します。

35ゲージの針を充填用シリンジに装着します。エタノールで10回洗浄して滅菌し、その後、滅菌生理食塩水で10回洗浄してエタノールの残留物を除去します。シリンジ内から気泡を取り除きます。

シリンジをポンプに装着します。AV調製液を1回分量充填し、氷上で保持します。シリンジにウイルス溶液を満たします。

針をブレグマに中心合わせし、以下の座標に従って海馬にゆっくりと刺入します：前後方向（Anterior, posterior）-2、内外方向（medial lateral）±1、背腹方向（dorsal ventral）-1。これらの座標は、頭蓋領域の端付近に位置します。組織が安定するまで5分間待ちます。

0.7 µLのAV溶液を50 nL/minの速度で注入します。ウイルスが完全に吸収されるまで10分間待ちます。その後、ゆっくりと針を抜きます。

出血した場合は、ゲルフォームで吸い取ります。対側でも同様に繰り返します。ドリルで作成した円形のフレーム内の硬膜の上に、滅菌済みの乾燥したカバーガラスを置きます。

ピンセットでカバーガラスを保持し、硬膜をゆっくりと平らにしながら、カバーガラスの端を頭蓋骨の表面に近づけます。滅菌済みの針を用いて、カバーガラスの端に高密度シアノアクリレート系接着剤を塗布し、頭蓋骨に固定します。接着剤が乾くまで待ちます。

頭蓋骨の前部に、固定バー、アントンナット、またはカスタムメイドの設計物を配置します。なお、固定バーは、イメージングセッション中にクレイニアルウィンドウを水平に配置できる位置に設置してください。バーの端に接着剤を塗布します。

接着剤が乾くまで待ちます。なお、固定バーはウィンドウからできるだけ離して配置してください。ウィンドウに近すぎると、イメージングの際にバーおよびカスタムホルダーとそれを接続するネジが対物レンズの妨げになる可能性があります。

歯科用アクリル樹脂を準備し、ガラス周囲の頭蓋骨表面に塗布します。ウィンドウの周囲にクレーターのような形状に成形すると有用です。これにより、後に水浸対物レンズでイメージングを行う際に使用する水の貯留腔が形成されます。

歯科用アクリルでキャップを作成し、操作領域の残りの皮膚縁を覆い、頭蓋窓周囲のクレーターを補強する固定バーを設置します。歯科用セメントが硬化するまで待ちます。動物をステレオタキシックフレームから取り出し、リカバリーチャンバーに移します。

生理機能を観察しながら、動物が手術から回復するまで待機します。術後麻酔としてCyroproferrinを10 mg/kg、および抗生物質としてBaytrilを5 mg/kg、48時間投与します。Tiサファイアレーザーを起動し、顕微鏡の電源を入れます。

本実験で使用したシステムは、2光子レーザー、OPOシステム、およびデュアルガリウム砒素光陰極増倍管（PMT）を備えています。動物を導入チャンバーに入れ、麻酔を導入します。導入チャンバーから動物を取り出し、顕微鏡下のガス麻酔マスクに配置します。

酸素流量を0.3 L/minに、イソフルラン濃度を1.52%に下げます。MTネジまたはその他のカスタムシステムを用いて、動物をカスタム顕微鏡フレームに固定します。頭蓋窓を水平にします。なお、顕微鏡メーカーの頭部固定システムを使用することも可能ですが、専用のカスタムフレームを使用することで、より良好な結果が得られ、頭部の安定性が向上し、慢性実験における複数回のセッションで一定のポジショニングが可能になります。

広視野顕微鏡の設定を用い、低倍率の対物レンズで後帯状皮質の片側に視野を合わせ、カバースリップの表面に焦点を合わせます。クレーター状のアクリルウェルに水の一滴を滴下します。その後、長作動距離の水浸対物レンズに切り替えます。

対物レンズを頭蓋窓に向かって移動させ、水のメニスカスで検体と対物レンズが接するようにします。2光子設定に切り替え、最低倍率で検体の上端から下端までスキャンを開始します。硬膜の交差部分は、非特異的な信号による強い光輝として観察されます。

蛍光細胞からの信号強度に基づき、GFPおよびmCherryの両チャンネルで顕微鏡の取得設定を調整し、ダイナミックレンジ全体をカバーするようにします。樹状突起が他の細胞と分離している適切なニューロンを見つけたら、最低倍率のズームと5 µmのZ距離に設定したGFPフィルターのみを使用して初期スキャンを行います。スキャンスタックの最大投影（maximum projection）を取得し、色を反転させてアノテーション用に印刷します。

目的とする形態学的詳細を画像化できる値にズームを設定します。最大投影法をガイドとして用い、GFPおよびmCherryチャネルで樹状突起全体を画像化します。本プロトコルを用いることで、後帯状皮質におけるシナプス前およびシナプス後の両構造を繰り返し観察することが可能になります。

この手法は、樹状突起、シナプス棘、またはプリシナプスニューロンの形態変化と相関することが期待される行動操作を含む慢性実験に利用できます。イメージングセッションは任意の頻度で実施可能ですが、動物を適切に回復させ、麻酔の影響を最小限に抑えるため、24時間の時間間隔を置くことが推奨されます。適切に適用すれば、この技術により、数ヶ月にわたって複数回のイメージングセッションを行うことが可能になります。