Name: メカノノードポアセンシング:マルチパラメータシングルセル粘弾性測定のための迅速でラベルフリーのプラットフォーム (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-12-02T14:20:00.000+00:00
Duration: 5 min 49 s
Description: 学ぶメカノノードポアセンシングによる高速・ラベルフリーな単細胞粘弾性測定法。電子ベースのマイクロ流体デバイスで細胞の弾性と粘性を非破壊に解析し、創薬や病態理解への応用が期待されます。

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本研究は、NIBIB 1R01EB024989-01およびNCI 1R01CA190843-01からの助成金によって支援されました。A.L.とR.R.は、H2H8協会大学院研究フェローシップの支援を受けました。KLCは、国立科学財団大学院研究フェローシップとシーベル奨学生フェローシップによってサポートされました。

1. デバイス形状の設計
<ol><li>サイジングセグメントとリカバリセグメントの幅を選択して、測定する最大のセルの直径よりも広く、十分な信号対雑音比(SNR)を維持します。さまざまな細胞株の異なるサイジングおよび回収セグメント幅の例については、 補足表2 を参照してください。</li>
	<li>収縮セグメント幅を選択して、メカノフェノタイピングを受ける細胞の平均サイズに30%〜40%のひずみを適用します。ひずみは次のように<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/64665/64665eq01.jpg" style="margin: auto;">定義されます。ここで、dはセル直径、wcは収縮チャネル幅2,8です。さまざまな細胞株のさまざまな収縮セグメント幅については、補足表2を参照してください。 注:直径が大きく異なる細胞の種類または条件を比較する場合は、各細胞の種類/条件に固有の収縮セグメント幅で個別のデバイス設計を使用する必要があります。</li>
	<li>一意のデバイス ジオメトリごとに参照デバイスを設計します。これは、De、マイクロ流体チャネルのサイジング細孔セグメントの有効直径を決定するために必要である。 メモ: 参照デバイスは、プライマリデバイスと同じジオメトリを使用します。唯一の変更は、既知のサイズのポリスチレンビーズによるキャリブレーションを可能にするために、収縮セグメントの幅がサイジング細孔セグメントと等しくなければならないことです。収縮を広げることで、キャリブレーション中にポリスチレンビーズが収縮チャネルを詰まらせるのを防ぎます。キャリブレーションプロセスは、ステップ4.1および5.3.1でさらに説明されています。較正は、市販のセルカウンターを用いても達成することができ、その場合、参照装置は必要ない。このプロセスについては、ステップ 4.2 で説明します。</li>
	<li>目的の最大のセルが収縮セグメント2内で制限なく完全に伸長できるようにチャネルの高さを選択します。チャネルの高さが hmin <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/64665/64665eq02.jpg" style="margin: auto;"> より大きいことを確認します(これは、セルが球面の事前変形であり、変形中にチャネルの長さと高さに沿って等角変形が発生することを前提としています)。 注:電流サブパルスの大きさを考えると、hminが大きいほど、<img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/64665/64665eq3v2.png" style="margin: auto;">全体的なSNRは低くなります。</li>
	<li>選択したチャネル幅のコンピューター支援設計ソフトウェアを使用して、フォトマスクを設計および作成します。サンプル・ファイルは、 補足ファイル 1 にあります。マイクロ流体マスクの設計を1.5%拡大して、ネガマスターから剥離した後のポリジメチルシロキサン(PDMS)収縮を考慮します。 注:アレイ全体がウェーハのサイズを超えない限り、デバイスのアレイを1つのマスクに含めることができます(補足図1A)。</li>
	<li>マイクロ流体デバイス電流の4点プローブ測定を実行するために使用される電極を備えたフォトマスクを設計および作成します(図1D)。サンプル・ファイルは、 補足ファイル 1 にあります。 注意: 電極のアレイは、アレイがスライドガラスのサイズを超えない限り、単一のマスクに含めることができます(補足図1B)。</li>
</ol>2. デバイスの作製(図2)
<ol><li>ガラス基板上に電極パターンを作製する。<ol><li>製品データシートに従って、ポジ型フォトレジストを無地のスライドガラスにスピンコート、パターン化、および処理します。この手順の例については、 補足ファイル 2 を参照してください。</li>
		<li>金属蒸着、リフトオフ、および金エッチングを実行します。<ol><li>スライド上に75 Å Ti、250 Å Pt、および250 Å Auの薄膜堆積を行います。電子銃蒸発を使用したこの手順の例は、 補足ファイル3に概説されています。</li>
			<li>スライドをアセトンに15分間浸して、余分な金属をリフトオフします。</li>
			<li>ドラフト内で、補足 図2に示すように、使い捨てピペットを使用して、マイクロ流体チャネルにさらされる電極の領域に金エッチング液をドロップキャストします。スライドの他の場所にエッチング液を落とさないように注意してください。 注意: 金のエッチング液は、皮膚や目の炎症を引き起こす可能性があります。蒸気を吸い込んだり、摂取したりしないでください。取り扱いには注意し、適切な個人用保護具(PPE)を着用し、地域の廃棄規制に従って廃棄物を廃棄してください。</li>
			<li>スライドを脱イオン(DI)水ですすぎ、乾燥窒素(N2)で乾燥させます。</li>
		</ol></li>
		<li>同じスライドガラスに複数の電極が印刷されている場合は、スライドを個々のチップにダイスします。<ol><li>ガラス切削工具を使用して、パターン化された電極境界に沿ってスライドにスコアを付けます。</li>
			<li>スコアに沿ってガラスを割って、スライドを個々のチップに分割します。</li>
		</ol></li>
		<li>顕微鏡で電極を目視検査します。個々の電極が電気的に開いていないこと、または電極が互いに短絡していないことを確認してください。</li>
	</ol></li>
	<li>チャネル用のネガティブマスターモールドを製作します。<ol><li>製品データシートに従って、研磨されたシリコンウェーハ上にSU-8エポキシレジストをスピンコート、パターン化、および処理します。この手順の例については、 補足ファイル 2 を参照してください。</li>
		<li>プロファイラー(表面形状測定機)を使用して特徴の高さを測定し、顕微鏡下で特徴を視覚的に検査します(補足図3)。目的のジオメトリが適切に定義されていることを確認します。</li>
	</ol></li>
	<li>ソフトリソグラフィでPDMSチャンネルを成形します。<ol><li>使い捨てカップでエラストマーと架橋剤を10:1の質量比で計量してPDMSを調製します。 注:直径3のウェーハの場合、30gのPDMSで十分です。</li>
		<li>PDMSが気泡で不透明になるまで、使い捨てフォークでPDMSを30秒間激しく混合します。</li>
		<li>真空チャンバー内でPDMSを約30〜90分間、またはPDMSが透明になり、気泡が見えなくなるまで脱ガスします。</li>
		<li>SU-8マスターモールドを備えたウェーハを使い捨てのペトリ皿に入れ、ウェーハの中央にPDMSを注ぎます。</li>
		<li>PDMSとウェーハが入ったペトリ皿を真空チャンバーに入れ、約30分間、またはPDMSに気泡がなくなるまで脱ガスします。</li>
		<li>PDMSを80°Cでオーブンまたはホットプレートで2時間焼きます。</li>
		<li>鋭利な刃で、PDMSを切り取り、SU-8ネガティブマスターから取り外します。</li>
		<li>成形されたPDMSスラブを鋭利な刃を使用して個々の金型にダイスします</li>
		<li>使い捨ての生検パンチを使用して、入口と出口のアクセス穴をコアします。最良の結果を得るには、PDMSスラブごとに新しいパンチを使用します。より鋭いパンチは滑らかなエッジの穴を生成し、収縮チャネルを塞ぐ可能性のある粒子を最小限に抑えます。 注意: アクセス穴の直径は、チューブの外径よりわずかに小さくする必要があります。たとえば、外径が1/32インチのポリテトラフルオロエチレン(PTFE)チューブを使用する場合は、1.5mmの穴を開ける必要があります。</li>
	</ol></li>
	<li>ガラス/電極基板をPDMSチャネルに接着します。<ol><li>電極ガラススライドをメタノール(≥99.8%)で洗浄します。乾燥N2で乾燥させる。</li>
		<li>PDMSデバイスをスコッチテープで洗浄し、イソプロピルアルコール(IPA)と脱イオン水(DI; 18 MΩ / cm2)ですすいでください。乾燥N2で乾燥させる。次に、もう一度スコッチテープで拭きます。</li>
		<li>プレハブ電極を備えたガラス基板と準備したPDMSモールド(フィーチャー面を上にして)をプラズマクリーナーに入れます。</li>
		<li>両方を酸素プラズマに2分間さらします(100〜300 mTorr、30 W)。</li>
		<li>PDMSモールドを、フィーチャー側を下向きにして、プレハブ電極を備えたガラス基板上に位置合わせして配置します。 注:プラズマ処理されたPDMSとガラスが接触すると、接合は瞬時に行われます。したがって、それ以上のアライメントの変更はできません。アライメントを容易にするために、DI水中のメタノールの2:1希釈の20 μLをプラズマ処理ガラス表面にピペットで移すことができます。メタノール溶液は、処理されたガラスとPDMSの間の物理的バリアとして機能し、アライメント調整を可能にします。メタノールを使用する場合は、整列して嵌合したデバイスを50°Cで2時間ベークして溶液を蒸発させ、接着プロセスを完了します。</li>
		<li>接着したデバイスを顕微鏡で目視検査します。電極とチャネルの形状が正しく位置合わせされていることを確認します。</li>
	</ol></li>
</ol>3. 細胞を測定する(図1D)
<ol><li>圧力源、PCB、ベンチトップハードウェア、およびデータ収集ソフトウェアを準備します。<ol><li>クランプを使用してマイクロ流体デバイスをPCBに接続します。PCBの例は、補足ファイル4(ガーバーファイル)および補足ファイル5(回路図、ボード、およびPCB部品リストファイル)に記載されています。<ol><li>クランプのバネ仕掛けのピンをマイクロ流体デバイスの電極コンタクトパッドに合わせ、クランプのヘッダーピンをPCBの穴に合わせます。</li>
			<li>clをしっかりと挿入しますamp のヘッダーピンをPCBの穴に、バネ仕掛けのピンが電極コンタクトパッドと位置合わせされていることを確認します。</li>
		</ol></li>
		<li>電子ハードウェアをセットアップして接続します。<ol><li>電源の2つの出力ポートを、ダブルバナナプラグ-バヨネットニールコンセルマン(BNC)メスアダプタとBNCケーブルを使用してPCBの電源電圧ポートに接続します。</li>
			<li>電源をオンにします。BNCの内部導体に接続されている出力を+15 Vに設定し、もう一方の出力を-15 Vに設定します。</li>
			<li>電源の出力ポートの3番目をPCBの入力電圧ポートにBNCケーブルで接続します。出力を希望の印加電圧に設定しますが、実験を開始するまで有効にしないでください。</li>
			<li>PCBの出力電流ポートをBNCケーブルで電流プリアンプの入力に接続します。</li>
			<li>電流プリアンプの出力を、BNCケーブルでデータ集録システムのBNC端子台の1つのアナログ入力に接続します。オプションで、アナログローパスフィルタをBNCケーブルに沿って接続して、高周波干渉を除去します。 メモ: SNR を改善するために、PCB とデバイスは厚い金属製の筐体に収納できます。すべてのBNCケーブルと流体チューブは、エンクロージャにドリルで開けられた穴に通すことができます。</li>
		</ol></li>
		<li>必要なソフトウェアをパーソナルコンピュータ(PC)にインストールしてセットアップする<ol><li>電源を入れ、圧力コントローラーをPCに接続します。製造元の指示に従って、必要な圧力コントローラソフトウェアをインストールします。</li>
			<li>MATLABとデータ収集ツールボックスをPCにインストールします。MATLABデータ収集ツールボックスインターフェイスがそれを検出できるように、データ収集システムに必要なドライバがインストールされていることを確認してください。</li>
			<li>付属のデータ収集スクリプト「NPS.m」を https://github.com/sohnlab/node-pore-sensing-public からダウンロードします。</li>
		</ol></li>
		<li>データ集録スクリプトを開いて設定します。<ol><li>正しい値を設定して、ベンダーID、DAQのデバイスID、アナログ入力チャンネル番号(付属のスクリプトの34〜36行目)を含むデータ集録セッションを初期化します。 注: デバイス ID は、関数 "daq.getDevices" または "daqlist" を使用して見つけることができます。</li>
			<li>集録に必要なサンプルレートを設定します(付属のスクリプトの23行目)。最適な結果を得るには、少なくとも10kHzに設定する必要があります。</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
	<li>細胞懸濁液を調製する。<ol><li>1xリン酸緩衝生理食塩水(PBS)中の2%ウシ胎児血清(FBS)の溶液を調製し、0.22 μmフィルターでろ過します。</li>
		<li></li></ol></li><li><ol><li><ol><li><li><li><li> </li></ol></li><li><ol><li> <ol><li><li></ol></li><li> </li><li> </li><li></li><li></li><li><ol><li><li> </li><li></ol></li></ol></li></ol></li></ol><ol><li><ol><li><li></li><li></li></ol></li><li><ol><li></li></ol></li></ol><ol><li><ol><li><li><li></li><li></ol></li><li><ol><li></li><li><ol><li></li><li></ol></li></ol></li><li><ol><li> <img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/64665/64665eq04.jpg" style="margin: auto;"> <ol><li></li></ol></li><li><ol><li></li><li> <img alt="Equation 5" src="/files/ftp_upload/64665/64665eq05.jpg" style="margin: auto;"> </li></ol></li><li></li><li><ol><li><img alt="Equation 6" src="/files/ftp_upload/64665/64665eq06.jpg" style="margin: auto;"></li><li> <img alt="Equation 7" src="/files/ftp_upload/64665/64665eq07.jpg" style="margin: auto;"> </li><li> <img alt="Equation 8" src="/files/ftp_upload/64665/64665eq08.jpg" style="margin: auto;"></li><li><img alt="Equation 9" src="/files/ftp_upload/64665/64665eq09.jpg" style="margin: auto;"></li></ol></li></ol></li></ol>

<ol><li>Pegoraro, A. F., Janmey, P., Weitz, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+properties+of+the+cytoskeleton+and+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspectives+in+Biology%22%5BJournal%5D)">Mechanical properties of the cytoskeleton and cells.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 9 (11), 022038(2017).</li>
<li>Kim, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterizing+cellular+mechanical+phenotypes+with+mechano-node-pore+sensing%5BTitle%5D)+AND+%22Microsystems+%26+Nanoengineering%22%5BJournal%5D)">Characterizing cellular mechanical phenotypes with mechano-node-pore sensing.</a> Microsystems & Nanoengineering. 4, 17091(2018).</li>
<li>Mierke, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bidirectional+mechanical+response+between+cells+and+their+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Physics%22%5BJournal%5D)">Bidirectional mechanical response between cells and their microenvironment.</a> Frontiers in Physics. 9, 619(2021).</li>
<li>Kumar, S., Weaver, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanics%2C+malignancy%2C+and+metastasis%3A+The+force+journey+of+a+tumor+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+and+Metastasis+Reviews%22%5BJournal%5D)">Mechanics, malignancy, and metastasis: The force journey of a tumor cell.</a> Cancer and Metastasis Reviews. 28 (1), 113-127 (2009).</li>
<li>Nia, H. T., Munn, L. L., Jain, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physical+traits+of+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Physical traits of cancer.</a> Science. 370 (6516), (2020).</li>
<li>Fletcher, D. A., Mullins, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+mechanics+and+the+cytoskeleton%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cell mechanics and the cytoskeleton.</a> Nature. 463 (7280), 485-492 (2010).</li>
<li>Wirtz, D., Konstantopoulos, K., Searson, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+physics+of+cancer%3A+The+role+of+physical+interactions+and+mechanical+forces+in+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">The physics of cancer: The role of physical interactions and mechanical forces in metastasis.</a> Nature Reviews Cancer. 11 (7), 512-522 (2011).</li>
<li>Li, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+phenotyping+reveals+unique+biomechanical+responses+in+retinoic+acid-resistant+acute+promyelocytic+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22iScience%22%5BJournal%5D)">Mechanical phenotyping reveals unique biomechanical responses in retinoic acid-resistant acute promyelocytic leukemia.</a> iScience. 25 (2), 103772(2022).</li>
<li>Kozminsky, M., Sohn, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+promise+of+single-cell+mechanophenotyping+for+clinical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Biomicrofluidics%22%5BJournal%5D)">The promise of single-cell mechanophenotyping for clinical applications.</a> Biomicrofluidics. 14 (3), 031301(2020).</li>
<li>Li, M., Dang, D., Liu, L., Xi, N., Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atomic+force+microscopy+in+characterizing+cell+mechanics+for+biomedical+applications%3A+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Transactions+on+Nanobioscience%22%5BJournal%5D)">Atomic force microscopy in characterizing cell mechanics for biomedical applications: A review.</a> IEEE Transactions on Nanobioscience. 16 (6), 523-540 (2017).</li>
<li>Wottawah, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+rheology+of+biological+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Physical+Review+Letters%22%5BJournal%5D)">Optical rheology of biological cells.</a> Physical Review Letters. 94 (9), 1-4 (2005).</li>
<li>Darling, E. M., Di Carlo, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+assessment+of+cellular+mechanical+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biomedical+Engineering%22%5BJournal%5D)">High-throughput assessment of cellular mechanical properties.</a> Annual Review of Biomedical Engineering. 17 (1), 35-62 (2015).</li>
<li>Carey, T. R., Cotner, K. L., Li, B., Sohn, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developments+in+label-free+microfluidic+methods+for+single-cell+analysis+and+sorting%5BTitle%5D)+AND+%22Wiley+Interdisciplinary+Reviews%3A+Nanomedicine+and+Nanobiotechnology%22%5BJournal%5D)">Developments in label-free microfluidic methods for single-cell analysis and sorting.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews: Nanomedicine and Nanobiotechnology. 11 (1), 1529(2019).</li>
<li>Bagnall, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deformability+of+tumor+cells+versus+blood+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Deformability of tumor cells versus blood cells.</a> Scientific Reports. 5, 18542(2015).</li>
<li>Byun, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterizing+deformability+and+surface+friction+of+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Characterizing deformability and surface friction of cancer cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (19), 7580-7585 (2013).</li>
<li>Otto, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+deformability+cytometry%3A+On-the-fly+cell+mechanical+phenotyping%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Real-time deformability cytometry: On-the-fly cell mechanical phenotyping.</a> Nature Methods. 12 (3), 199-202 (2015).</li>
<li>Gossett, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrodynamic+stretching+of+single+cells+for+large+population+mechanical+phenotyping%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Hydrodynamic stretching of single cells for large population mechanical phenotyping.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (20), 7630-7635 (2012).</li>
<li>Guck, J., Chilvers, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanics+meets+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Mechanics meets medicine.</a> Science Translational Medicine. 5 (212), 3-6 (2013).</li>
<li>Balakrishnan, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Node-pore+sensing%3A+A+robust%2C+high-dynamic+range+method+for+detecting+biological+species%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Node-pore sensing: A robust, high-dynamic range method for detecting biological species.</a> Lab on a Chip. 13 (7), 1302-1307 (2013).</li>
<li>Carbonaro, A., Sohn, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+resistive-pulse+sensor+chip+for+multianalyte+immunoassays%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">A resistive-pulse sensor chip for multianalyte immunoassays.</a> Lab on a Chip. 5 (10), 1155-1160 (2005).</li>
<li>Saleh, O. A., Sohn, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+detection+of+antibody-antigen+binding+using+an+on-chip+artificial+pore%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Direct detection of antibody-antigen binding using an on-chip artificial pore.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 100 (3), 820-824 (2003).</li>
<li>Saleh, O. A., Sohn, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+artificial+nanopore+for+molecular+sensing%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Letters%22%5BJournal%5D)">An artificial nanopore for molecular sensing.</a> Nano Letters. 3 (1), 37-38 (2003).</li>
<li>Saleh, O. A., Sohn, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+sensing+of+nanoscale+colloids+using+a+microchip+Coulter+counter%5BTitle%5D)+AND+%22Review+of+Scientific+Instruments%22%5BJournal%5D)">Quantitative sensing of nanoscale colloids using a microchip Coulter counter.</a> Review of Scientific Instruments. 72 (12), 4449-4451 (2001).</li>
<li>DeBlois, R. W., Bean, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Counting+and+sizing+of+submicron+particles+by+the+resistive+pulse+technique%5BTitle%5D)+AND+%22Review+of+Scientific+Instruments%22%5BJournal%5D)">Counting and sizing of submicron particles by the resistive pulse technique.</a> Review of Scientific Instruments. 41 (7), 909-916 (1970).</li>
<li>Li, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluating+sources+of+technical+variability+in+the+mechano-node-pore+sensing+pipeline+and+their+effect+on+the+reproducibility+of+single-cell+mechanical+phenotyping%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Evaluating sources of technical variability in the mechano-node-pore sensing pipeline and their effect on the reproducibility of single-cell mechanical phenotyping.</a> PLoS ONE. 16 (10), 0258982(2021).</li>
<li>Zhang, Z. M., Chen, S., Liang, Y. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Baseline+correction+using+adaptive+iteratively+reweighted+penalized+least+squares%5BTitle%5D)+AND+%22Analyst%22%5BJournal%5D)">Baseline correction using adaptive iteratively reweighted penalized least squares.</a> Analyst. 135 (5), 1138-1146 (2010).</li>
<li>Alibert, C., Goud, B., Manneville, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Are+cancer+cells+really+softer+than+normal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Are cancer cells really softer than normal cells.</a> Biology of the Cell. 109 (5), 167-189 (2017).</li>
<li>Fujiwara, I., Zweifel, M. E., Courtemanche, N., Pollard, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Latrunculin+A+accelerates+actin+filament+depolymerization+in+addition+to+sequestering+actin+monomers%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Latrunculin A accelerates actin filament depolymerization in addition to sequestering actin monomers.</a> Current Biology. 28 (19), 3183-3192 (2018).</li>
<li>Saleh, O. A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22A+novel+resistive+pulse+sensor+for+biological+measurements%22">A novel resistive pulse sensor for biological measurements</a>. , Princeton University. Princeton. PhD Thesis (2003).</li>
<li>Dokukin, M. E., Guz, N. V., Sokolov, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+study+of+the+elastic+modulus+of+loosely+attached+cells+in+AFM+indentation+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Quantitative study of the elastic modulus of loosely attached cells in AFM indentation experiments.</a> Biophysical Journal. 104 (10), 2123-2131 (2013).</li>
<li>Li, Q., et al. Probing the elasticity of breast cancer cells using AFM. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLi%2C+Q+%2213th+International+Conference+on+Biomedical+Engineering.+IFMBE+Proceedings%22">13th International Conference on Biomedical Engineering. IFMBE Proceedings</a>. Lim, C. T., Goh, J. C. H. 23, Springer. Berlin, Heidelberg. 2122-2125 (2009).</li>
<li>Rother, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atomic+force+microscopy-based+microrheology+reveals+significant+differences+in+the+viscoelastic+response+between+malign+and+benign+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Open+Biology%22%5BJournal%5D)">Atomic force microscopy-based microrheology reveals significant differences in the viscoelastic response between malign and benign cell lines.</a> Open Biology. 4 (5), 140046(2014).</li>
<li>Li, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AFM+indentation+study+of+breast+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">AFM indentation study of breast cancer cells.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 374 (4), 609-613 (2008).</li>
<li>Xu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elasticity+measurement+of+breast+cancer+cells+by+atomic+force+microscopy.+Proc.+SPIE+9230%5BTitle%5D)+AND+%22Twelfth+International+Conference+on+Photonics+and+Imaging+in+Biology+and+Medicine.+%28PIBM+2014%29%22%5BJournal%5D)">Elasticity measurement of breast cancer cells by atomic force microscopy. Proc. SPIE 9230.</a> Twelfth International Conference on Photonics and Imaging in Biology and Medicine. (PIBM 2014). 92300, (2014).</li>
<li>Alcaraz, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microrheology+of+human+lung+epithelial+cells+measured+by+atomic+force+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Microrheology of human lung epithelial cells measured by atomic force microscopy.</a> Biophysical Journal. 84 (3), 2071-2079 (2003).</li>
<li>Li, M., Dang, D., Liu, L., Xi, N., Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atomic+force+microscopy+in+characterizing+cell+mechanics+for+biomedical+applications%3A+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Transactions+on+Nanobioscience%22%5BJournal%5D)">Atomic force microscopy in characterizing cell mechanics for biomedical applications: A review.</a> IEEE Transactions on Nanobioscience. 16 (6), 523-540 (2017).</li>
<li>Urbanska, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparison+of+microfluidic+methods+for+high-throughput+cell+deformability+measurements%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">A comparison of microfluidic methods for high-throughput cell deformability measurements.</a> Nature Methods. 17, 587-593 (2020).</li>
<li>Hill, R. T., Chilkoti, A. Surface Patterning. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHill%2C+RT+%22Biomaterials+Science%3A+An+Introduction+to+Materials%3A+Third+Edition%22">Biomaterials Science: An Introduction to Materials: Third Edition</a>. , Elsevier Academic Press. NY. 276-301 (2013).</li>
<li>Wang, Z., Volinsky, A. A., Gallant, N. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crosslinking+effect+on+polydimethylsiloxane+elastic+modulus+measured+by+custom-built+compression+instrument%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Polymer+Science%22%5BJournal%5D)">Crosslinking effect on polydimethylsiloxane elastic modulus measured by custom-built compression instrument.</a> Journal of Applied Polymer Science. 131 (22), 41050(2014).</li>
<li>Gibson, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+hierarchical+structure+and+mechanics+of+plant+materials%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+Royal+Society+Interface%22%5BJournal%5D)">The hierarchical structure and mechanics of plant materials.</a> Journal of the Royal Society Interface. 9 (76), 2749-2766 (2012).</li>
<li>Stephens, A. D., Banigan, E. J., Adam, S. A., Goldman, R. D., Marko, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+and+lamin+a+determine+two+different+mechanical+response+regimes+of+the+cell+nucleus%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Chromatin and lamin a determine two different mechanical response regimes of the cell nucleus.</a> Molecular Biology of the Cell. 28 (14), 1984-1996 (2017).</li>
<li>Rosenbluth, M. J., Lam, W. A., Fletcher, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Force+microscopy+of+nonadherent+cells%3A+A+comparison+of+leukemia+cell+deformability%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Force microscopy of nonadherent cells: A comparison of leukemia cell deformability.</a> Biophysical Journal. 90 (8), 2994-3003 (2006).</li>
<li>Evers, T. M. J., Holt, L. J., Alberti, S., Mashaghi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reciprocal+regulation+of+cellular+mechanics+and+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Reciprocal regulation of cellular mechanics and metabolism.</a> Nature Metabolism. 3 (4), 456-468 (2021).</li>
<li>Balakrishnan, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Node-pore+sensing+enables+label-free+surface-marker+profiling+of+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Node-pore sensing enables label-free surface-marker profiling of single cells.</a> Analytical Chemistry. 87 (5), 2988-2995 (2015).</li>
</ol>

L. L. Sは、2022年7月12日に発行された米国特許第11,383,241号「メカノノードポアセンシング」、J.キム、S.ハン、L.L.ソンを保有しています。

このメカノフェノタイピング技術を使用した単一細胞の機械的特性の測定は、デバイス製造、データ取得、およびデータ分析の3つの段階で構成されています。各段階では、実験結果に大きな影響を与える可能性のある注目すべき側面があります。デバイスの製造時には、正確で再現性のある結果を得るには、一貫したチャネル形状とデバイス間の均一性が不可欠です。具体的には、各デバイスの側壁は比較的滑らかでなければならず(図4Ai)、複製デバイス間のチャネルの高さは同等でなければなりません。特に収縮チャネル(図4Aii)において、細胞の流れを部分的に妨げる欠陥のあるデバイスは廃棄する必要があります。チャネル形状に識別可能な欠陥があるデバイスを使用すると、不正確で再現性のない結果になります。データ収集中、データ収集中にユーザーがチャネル内の詰まりの存在を認識できることが重要です。サンプルスクリプト「NPS.m」(https://github.com/sohnlab/node-pore-sensing-public で入手可能)は、現在の測定値を表示し、ユ...

単一セルは動的な粘弾性材料です1。多数の内部および外部プロセス(例えば、有糸分裂の開始または細胞外マトリックス[ECM]のリモデリング)は、それらの構造および組成2,3,4に影響を与え、しばしばそれらの現在の状態を補完する明確な生物物理学的特性をもたらす。特に、機械的特性は、細胞の発生、生理学、および病理学の重要なバイオマーカーであることが示されており、標準的な分子的および遺伝的アプローチを補完できる貴重な定量的情報を生み出しています5、6、7。例えば、Liらは最近、薬剤耐性と薬剤応答性の急性前骨髄球性白血病細胞の機械的な違いを説明し、RNA-seqを使用して発現差のある細胞骨格関連遺伝子を明らかにしました8。単一細胞力学と細胞機能の間の複雑な相互作用を理解することにより、メカノフェノタイピングは基礎科学と臨床診断の変革においてより広い用途を持っています9。
単一細胞の力学を測定するために最も広く採用されているツールは、原子間力顕微鏡(AFM)です。AFMは、細胞の機械的特性の高分解能の局所的な測定を可能にしますが、スループットは<0.01細胞/秒10に制限されています。あるいは、2つの発散レーザービームを使用して吊り下げられた単一細胞11をトラップおよび変形させる光学ストレッチャーは、<1細胞/秒12のわずかに高いスループットに制限される。マイクロ流体技術の最近の進歩により、迅速な単一セルの機械的評価のための新世代のデバイスが可能になりました12,13。これらの技術は、狭い狭窄チャネル14、15、せん断流16、または流体力学的伸張17を使用して、10〜1,000セル/秒18のスループットで細胞を迅速に変形させる。これらのアプローチの測定速度は従来の技術よりもかなり高速ですが、限られた機械的読み出しのために高スループット能力と引き換えによく見られます(補足表1)。前述の迅速なマイクロ流体法はすべて、通過時間や変形可能性比など、細胞の弾性特性のみを反映する基本的な単一パラメータのメトリックに焦点を当てています。しかし、単一細胞の固有の粘弾性性を考えると、細胞の堅牢で徹底的な機械的特性評価には、弾性成分だけでなく粘性応答も考慮する必要があります。
メカノノードポアセンシング(mechano-NPS)2,8(図1A)は、シングルセルメカノフェノタイピングの既存の制限に対処するマイクロ流体プラットフォームです。この方法では、細胞径、相対変形能、変形からの回復時間など、複数の生物物理学的パラメータを同時に測定でき、1〜10細胞/秒の中程度のスループットが得られます。この手法は、ノード細孔センシング(NPS)19,20,21,22,23,24に基づいており、4点プローブ測定を使用して、「ノード」と呼ばれるより広い領域によってセグメント化されたマイクロ流体チャネルを通過するセルによって生成される変調電流パルスを測定します。変調された電流パルスは、セルがセグメント(すなわち「細孔」)およびノード内の電流の流れを部分的に遮断した結果であり、前者では後者よりも多くの電流が遮断される。メカノNPSでは、1つのセグメントである「収縮チャネル」はセル直径よりも狭くなります。したがって、チャネル全体を通過するには、セルが変形する必要があります(図1B)。細胞直径は、細胞が収縮チャネルの前にノード孔を通過するときに生成されるサブパルスの大きさによって決定できます(図1B、C)。ここで、|ΔYnp|は、セルが細孔内にあるときの電流降下であり、細孔に対するセルの体積比、Vセル/V細孔2,8,19に比例します。細胞の剛性は、細胞が収縮チャネルを通過するときに生成される劇的に大きなサブパルスの持続時間であるΔTcによって決定できます(図1B、C)。硬いセルは、柔らかいセルよりもチャネルを通過するのに時間がかかります2,8。最後に、細胞の「回復」、つまり変形後に元のサイズと形状に戻る細胞の能力は、細胞が収縮チャネルの後に節孔を通過するときに生成される一連のサブパルスによって決定できます(図1B、C)。回復時間ΔTrは、セルが圧迫される前に、現在のサブパルスが前のサブパルスの大きさに戻るのにかかる時間です。全体として、セルがマイクロ流体チャネルを通過するときに生成される変調電流パルスが記録され、分析されて、関連する単一セルの機械的パラメータが抽出されます(図1D)2,8。
このエレクトロニクスベースのマイクロ流体プラットフォームの再現性と使いやすさは、以前に実証されています25。さらに、このプラットフォームは、シングルセルメカノフェノタイピングの参入障壁が低い。標準的なソフトリソグラフィは、マイクロ流体デバイスの作製に採用されています。計測ハードウェアは、シンプルなプリント回路基板(PCB)、電源、プリアンプ、データ集録ボード(DAQ)、コンピュータなどの安価なコンポーネントで構成されています。最後に、データの取得と分析にユーザーフレンドリーなコードが用意されているため、簡単に実装できます。このメカノフェノタイピング技術は、非悪性および悪性の乳腺および肺上皮細胞株の集団を区別し、初代ヒト乳腺上皮細胞におけるサブ系統を区別し、細胞骨格摂動および他の薬理学的物質の影響を特徴付けることができる2,8。全体として、このプラットフォームは、単一細胞のメカノフェノタイピングに効果的なアプローチです。

<table><tbody><tr><td>アセトン</td><td>J.T. Baker</td><td>5356-05</td><td>純度 (GC)&nbsp; &ge; 99.5% (https://us.vwr.com/store/product/6057739/acetone-99-5-vlsi-j-t-baker)</td></tr><tr><td>アルミ箔</td><td>n/a</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>アナログローパスフィルター</td><td>ThorLabs</td><td>EF504</td><td>&le;240kHz通過帯域、同軸BNCフィードスルー&nbsp;(https://www.thorlabs.com/thorproduct.cfm?partnumber=EF504#ad-image-0)</td></tr><tr><td>生検パンチ</td><td>インテグラミルテックス</td><td>33-31AA-P / 25</td><td>1mm、使い捨て、プランジャー付き(https://mms.mckesson.com/product/573313/Miltex-33-31AA-P25)</td></tr><tr><td>ブレード</td><td>なし N</td><td>/ A</td><td></td></tr><tr><td>BNCケーブル</td><td>ポモナエレクトロニクス</td><td>2249-C-12</td><td>https://www.digikey.com/en/products/detail/pomona-electronics/2249-C-12/603323?utm_adgroup=Coaxial%20Cables%20%28RF%29&utm_source=google&utm_ medium=cpc&utm_campaign= Shopping_Product_Cable%20Assemblies_NEW&utm_term= &utm_content=同軸%20ケーブル%20%28RF%29&gclid=Cj0KCQjwlK-WBhDjARIsAO2sErQqnVJ pj5OXVObuTI8ZUf1ZeIn7zvzGnx mCWdePrG6SdEJMF3X6ubUaAs w-EALw_wcB</td></tr><tr><td>クリーンルームポリエステル綿棒</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>18383</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/texwipe-cleantip-alpha-polyester-series-swabs-6/18383</td></tr><tr><td>電流プリアンプ</td><td>DL Instruments</td><td>1211</td><td>https://www.brltest.com/index.php?main_page=product_info&products_ id=1419</td></tr><tr><td>カスタムPCB (部品付き)</td><td>該当</td><td>なし 該当なし</td> 補足<td>ファイルを参照 4 と</td></tr><tr><td>5 DAQ 端子台</td><td>National Instruments BNC-2120</td><td></td><td>https://www.ni.com/en-in/support/model.bnc-2120.html</td></tr><tr><td>DAQ to BNC-2110 ケーブル&nbsp;</td><td>ナショナルインスツルメンツ</td><td>SHC68-68-EPM</td><td>https://www.ni.com/en-in/support/model.shc68-68-epm.html</td></tr><tr><td>データ収集ボード(DAQ)</td><td>ナショナルインスツルメンツ</td><td>PCI-6251</td><td></td></tr><tr><td>https://www.ni.com/docs/en-US/bundle/pci-6251-feature/page/overview.html デシケーター</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>5311-0250</td><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/5311-0250</td></tr><tr><td>メスBNCからバナナプラグ</td><td>アダプターPomona Electronics</td><td>72909</td><td>https://www.digikey.com/en/products/detail/pomona-electronics/72909/1196318</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td><td>VWR</td><td>89510-186</td><td>https://us.vwr.com/store/product/18706419/avantor-seradigm-select-grade-usda-approved-origin-fetal-bovine-serum-fbs</td></tr><tr><td>Glass</td><td>Cutter Chemglass</td><td>CG-1179-21</td><td>https://chemglass.com/plate-glass-cutters-diamond-tips</td></tr><tr><td>金エッチング液 TFA</td><td>トランセン</td><td>NC0977944</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/NC0977944/NC0977944</td></tr><tr><td>ホットプレート</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>SP131825&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>イソプロピルアルコール</td><td>スペクトラムケミカル</td><td>I1056-4LTPL</td><td>純度(GC)&nbsp; &ge;99.5% (https://www.spectrumchemical.com/isopropyl-alcohol-99-percent-fcc-i1056)</td></tr><tr><td>金属製ハードウェア エンクロージャ</td>ー <td>ハモンド 製造</td><td>EJ12126</td><td>https://www.digikey.com/en/products/detail/hammond-manufacturing/EJ12126/2423415</td></tr><tr><td>メタノール</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34860</td><td>純度 (GC)&nbsp; &ge;99.8% (https://www.sigmaaldrich.com/IN/en/substance/methanol320467561)</td></tr><tr><td>MF-321 現像剤</td><td>Kayaku Advanced Materials</td><td>n/a</td><td></td></tr> <tr><td>https://kayakuam.com/products/mf-321/ MICROPOSIT S1813 ポジ フォトレジスト</td><td>デュポン</td><td>n/a</td><td></td></tr> <tr><td>https://kayakuam.com/products/microposit-s1800-g2-series-photoresists/ リン酸緩衝生理食塩水 (PBS)</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>10010049</td><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/10010049?SID=srch-hj-10010049</td></tr><tr><td>フォトマスク</td><td>ファインラインイメージングn</td><td>/a</td><td>フォトマスクは、当社のCADデザインからカスタムオーダーされています(https://www.fineline-imaging.com/)</td></tr><tr><td>プレーンガラス顕微鏡スライド</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>12-553-5B</td><td>材質:ソーダライム、L75 x W50 mm、厚さ:0.90&ndash;1.10ミリメートル&nbsp;</td></tr><tr><td>プラズマクリーナー</td><td>Harrick Plasma</td><td>PDC-001</td><td>https://harrickplasma.com/plasma-cleaners/expanded-plasma-cleaner/</td></tr> <tr><td>プラスチックシャー</td>レ <td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>FB0875712</td><td>100 mm (https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-petri-dishes-clear-lid-raised-ridge-100-x-15mm/FB0875712)</td></tr><tr><td>圧力コントローラー</td><td>Fluigent</td><td>MFCS-EZ</td><td>https://www.fluigent.com/research/instruments/pressure-flow-controllers/mfcs-series/</td></tr> <tr><td>圧力コントローラーソフトウェア</td><td>Fluigent</td><td>MAESFLO</td><td></td></tr><tr><td>プログラミング &データ</td><td>取得および解析用</td>計算ソフトウェア <td>MATLAB</td><td>R2021b</td> (https://www.mathworks.com/products/matlab.html)</tr><tr><td>PTFE Tubing</td><td>Cole Parmer</td><td>06417-31</td><td>0.032" ID x 0.056"&nbsp;(https://www.coleparmer.com/i/masterflex-transfer-tubing-microbore-ptfe-0-032-id-x-0-056-od-100-ft-roll/0641731)</td></tr><tr><td>Scepter 2.0 ハンドヘルド自動セルカウンター</td><td>ミラポア シグマ</td><td>PHCC20060</td><td>https://www.sigmaaldrich.com/IN/en/product/mm/phcc20060</td></tr><tr><td>シリコンウェーハ</td><td>ウェーハ ワールド</td><td>2885</td><td>76.2 mm、片面ポリッシュ (https://www.waferworld.com/product/2885)</td></tr><tr><td>スピンコーター</td><td>n/a</td><td></td><td>該当なし</td></tr><tr><td>SU-8 3025 ネガ フォトレジスト</td><td>カヤク アドバンスド マテリアル</td><td>ズ 該当なし</td><td></td></tr> <tr><td>https://kayakuam.com/products/su-8-2000/ SU8 デベロッパー</td><td>カヤク アドバンスド マテリアル</td><td>ズ https://kayakuam.com/products/su-8-developer/</td><td></td></tr> <tr><td>シガード 184 ポリジメチルシロキサン</td><td>ダウ ケミカル</td><td>4019862</td><td>https://www.ellsworth.com/products/by-market/consumer-products/encapsulants/silicone/dow-sylgard-184-silicone-encapsulant-clear-0.5-kg-kit/</td></tr> <tr><td>テープ</td><td>スコッチ</td><td>810-341296</td><td>https://www.staples.com/Scotch-Magic-Tape-810-3-4-x-36-yds-1-Core/product_130567?cid=PS:GS:SBD:PLA:OS&gclid= Cj0KCQjwlK-WBhDjARIsAO 2sErRwzrrgjU0NjFkDkne1xm vT7ekS3tdzvAgiMDwPoxocgH VTQZi7vJgaAvQZEALw_wcB</td></tr><tr><td>チタン、プラチナ、金</td><td>該当なし</td><td>該当なし トリプル</td><td></td></tr><tr><td>出力電源</td><td>キーサイト</td><td>E36311A</td><td></td></tr><tr><td>https://www.newark.com/keysight-technologies/e36311a/dc-power-supply-3o-p-6v-5a-prog/dp/15AC9653 UVマスクアライナー</td><td>カール・サス・アメリカ</td><td>MJB3マスクアライナー&nbsp;</td><td></td></tr></tbody></table>

メカノノードポアセンシング:マルチパラメータシングルセル粘弾性測定のための迅速でラベルフリーのプラットフォーム

Mechano-Node-Pore Sensing: A Rapid, Label-Free Platform for Multi-Parameter Single-Cell Viscoelastic Measurements

細胞の機械的特性は、幹細胞の分化から癌の転移に至るまで、さまざまな生物学的プロセスや疾患に関与しています。原子間力顕微鏡(AFM)やマイクロピペット吸引(MA)など、これらの特性を測定する従来の方法は、細胞の完全な粘弾性応答を反映した豊富な情報をキャプチャします。ただし、これらの方法は非常に低いスループットによって制限されます。リアルタイム変形能サイトメトリー(RT-DC)などのハイスループットアプローチは、細胞の弾性特性のみを反映する単一パラメータ読み出しに制限されることが多いため、限られた機械的情報しか測定できません。これらの方法とは対照的に、メカノノードポアセンシング(mechano-NPS)は、中程度のスループットでセルのマルチパラメータ粘弾性測定を達成するためのギャップを埋める、柔軟でラベルフリーのマイクロ流体プラットフォームです。直流(DC)測定は、マイクロ流体チャネルを通過する細胞を監視し、狭い狭窄を通過する前、最中、および後に細胞のサイズと速度を追跡するために使用されます。この情報(サイズと速度)は、各セルの横方向の変形、変形に対する抵抗、および変形からの回復を定量化するために使用されます。一般に、このエレクトロニクスベースのマイクロ流体プラットフォームは、複数の粘弾性セル特性を提供し、したがって細胞の機械的状態のより完全な全体像を提供します。最小限のサンプル調製で済み、(高速カメラとは対照的に)簡単な電子測定を利用し、標準的なソフトリソグラフィ製造を利用するため、このプラットフォームの実装はシンプルでアクセスしやすく、ダウンストリーム分析に適応できます。このプラットフォームの柔軟性、有用性、感度は、多様な細胞に関する独自の機械的情報を提供し、基礎科学や臨床診断においてさらに多くのアプリケーションの可能性を秘めています。

ここで紹介するメカノフェノタイピングプラットフォームは、単一細胞の生物物理学的特性を中程度のスループットで測定するためのシンプルで汎用性の高いアプローチです。細胞は、一定の圧力駆動の流れを使用してマイクロ流体チャネル(図1A)を通って流れます。細胞が通過すると、マイクロ流体チャネルの長さと生成される電流パルスがデータ収集ハードウェアを使用して記録されます。取得した信号(図1B、C)は、MATLABのカスタムソフトウェアを使用して処理され、関連するシングルセルの機械的特性が抽出されます。 図1D は、実験プロトコルのグラフィカルな概要を示しています。
デバイスを製造するために、最初に負のマスターモールドが作成され、PDMSの鋳造に使用されます(図2)。 補足図3に示す成功したマスタ...

ここでは、メカノノード細孔センシング(mechano-NPS)と呼ばれるエレクトロニクスベースのマイクロ流体プラットフォームを使用して、単一細胞を機械的に表現型化する方法を示します。このプラットフォームは、細胞の弾性と粘性の両方の生物物理学的特性を測定しながら、1〜10細胞/秒の中程度のスループットを維持します。

Cellular mechanical properties are involved in a wide variety of biological processes and diseases, ranging from stem cell differentiation to cancer ...

単一細胞の機械的表現型のためのエレクトロニクスベースのマイクロ流体プラットフォームを紹介します。具体的には、シングルセルの弾性特性と粘性特性を毎秒最大10セルのスループットで測定します。私たちの方法は、最小限のサンプル前処理を必要とし、高価な光学ハードウェアや複雑な画像分析に代わる簡単な電子測定を利用し、非破壊的であるため、私たちのアプローチはダウンストリーム分析と互換性があります。Mechano-NPSは、一次サンプルを含む多くの細胞タイプに適用されており、単一細胞の粘弾性に対する細胞内成分の影響を測定しています。細胞の挙動の理解、疾患の進行の決定、または薬物反応のモニタリングに使用できます。まず、プラズマ処理されたコンポーネントをプラズマチャンバーから取り出します。予め作製された電極を有するガラス基板上にメタノールおよび脱イオン水の2対1溶液をピペットする。次に、フィーチャー側を下にしてPDMSモールドをガラス基板の上に配置します。デバイスをステレオスコープの下に置き、アライメントを調整します。位置合わせしたデバイスをベイクして、デバイスの製造を完了します。圧力源、PCB、ベンチトップハードウェア、およびデータ収集ソフトウェアを準備します。次に、クランプヘッダーピンをPCBの穴に合わせ、クランプのスプリング式ピンをマイクロ流体デバイスの電極コンタクトパッドに合わせます。次に、クランプヘッダーピンをPCBの穴に挿入し、バネ仕掛けのピンが電極コンタクトパッドと揃っていることを確認します。電子ハードウェアをセットアップして接続します。次に、値を設定してデータ集録セッションを初期化し、集録用のサンプルレートを設定します。培養し、選択した細胞株の適切な細胞培養プロトコールに従って細胞を調製した。次に、細胞を2%FBSおよび1X PBSの調製溶液に、ミリリットル当たり100, 000〜500, 000細胞の濃度で懸濁する。実験期間中、細胞を氷上に置いておきます。セルをマイクロ流体デバイスにロードするには、かみそりの刃で30センチメートルのポリテトラフルオロエチレンチューブを切り取ります。シリンジを使用して細胞サンプルをチューブの端に落とし、同じ端をデバイスの入口に接続します。最後に、チューブの反対側の端をマイクロ流体圧力コントローラーに接続します。実験を実行するには、圧力コントローラーソフトウェアで希望の一定の駆動圧力を設定し、サンプルがデバイスを満たすようにします。マイクロ流体チャネルに気泡が形成された場合は、行き止まり充填を使用します。デバイスの出口を塞ぎ、入口に低圧を加えて、ガス透過性PDMSを通して空気を強制的に排出します。次に、電圧を回して目的の電圧を設定しますtage電源のノブを回し、オンボタンを押して電圧を有効にします。電流プリアンプの電源を入れ、感度をできるだけ低く設定してください。あるいは、プリアンプに過負荷をかけたり、DAQの最大アナログ入力電圧を超えたりすることなく、ゲインをできるだけ高く設定することもできます。MATLABリボンメニューの緑色の[実行]ボタンを押して、データ集録スクリプトNPSを開始します。m、データのサンプリングと保存を開始します。実験を終了するには、ライブプロットウィンドウの左下隅にある停止ボタンを押して、データ集録スクリプトを終了します。次に、Onボタンを押して電源出力を無効にします。最後に、圧力コントローラソフトウェアで圧力源をゼロ圧力に設定します。データ解析の場合、生の信号は、ノイズを除去して重要な成分を抽出するのに十分な信号対雑音比を備えている必要があります。重要なのは、各ノードからの電流信号の立ち上がりは、差動信号からサブパルスを簡単に識別できるように十分に堅牢である必要があります。悪性MCF-7細胞は、非悪性MCF-10A細胞よりもwCDI分布が大きく、悪性MCF-7細胞が非悪性MCF-10A細胞よりも柔らかいことを示しています。ラトランクリンで処理したMCF-10AおよびMCF-7細胞は、wCDIの増加を示す。2つの初代細胞タイプを区別する明確なwCDI分布は、LEP細胞がMEP細胞よりも柔らかいことを示しています。非悪性MCF-10Aおよび未処理のMCF-10AおよびMCF-7は、即座に回復する細胞の割合が高く、悪性またはラトランクリン処理された細胞よりも粘度が低いことを示しています。ライブ電流の読み取り値が異常に見える場合は、実験を中止してマイクロ流体チャネルを検査してください。気泡や詰まりがなく、セルが入口から出口まで自由に流れていることを確認してください。私たちの方法は細胞に害を及ぼさないため、RNA-seqや免疫蛍光などのダウンストリーム分析を実行できます。これは、細胞が明確な機械的表現型を持ついくつかの根本的な理由を明らかにするのに役立つ可能性があります。

mechano-node-pore-sensing-rapid-label-free-platform-for-multi

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Bioengineering

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