シゾサッカロミセス・ポンベにおけるマルチコピーサプレッサー同定のための遺伝子スクリーニング

サプレッサースクリーニングは、目的の遺伝子の機能、およびそれらが生体内で関与する可能性のある経路および生物学的プロセスに光を当てる遺伝的相互作用を特定します。この手法は、他のアプローチでは実証されなかった可能性のある2つの遺伝子産物間の遺伝的関係を特定できます。酵母におけるこのようなスクリーニングの結果は、ほとんどの基本的な生物学的経路とプロセスが進化全体にわたって保存されているため、高真核生物にまで拡張できます。

このスキームの成功は、入手可能性、高品質、および酵母細胞への形質転換の高効率にかかっています。したがって、YE培地プレート上で摂氏32度でシゾサッカロマイセス・ポンベell1欠失株を増殖させる前のプラスミドを用いた形質転換プロトコル。プレートからell1変異株でいっぱいのループを取り、5ミリリットルの添加YE培地を接種し、摂氏32度で一晩振とうしながらバイアルをインキュベートします。

インキュベーション後、目的のサプリメントを含む100ミリリットルの新鮮なYE培地で一晩成長培養液を希釈して、600ナノメートルで0.3の光学密度を達成します。600ナノメートルの光学密度が中対数相に達するまで、200〜550 RPMで振とうしながら、摂氏32度で媒体をインキュベートします。100ミリリットルの培養液を2本の50ミリリットルの遠沈管に分割した後、室温で10分間4, 000倍Gで細胞をペレット化する。

上清が廃棄されたら、細胞ペレットを1ミリリットルの滅菌水に再懸濁します。遠心分離して上清をもう一度廃棄し、細胞ペレットを1ミリリットルの酢酸リチウムTEに再懸濁します。遠心分離によって細胞をペレット化し、各細胞ペレットを250マイクロリットルの酢酸リチウムTEに再懸濁する。次に、125マイクロリットルのコンピテントセルを4つの異なる滅菌マイクロ遠心チューブに移し、後続の形質転換ステップを行います。サケの精巣またはニシンの精子からのキャリアDNAを1分間煮沸し、すぐにチューブを氷の上に置きます。

形質転換ごとに、125マイクロリットルのコンピテントセルを含むマイクロ遠心チューブに10マイクロリットルの一本鎖キャリアDNAを加え、ピペッティングで穏やかに混合します。続いて、50マイクログラムのシゾサッカロミセスポンベcDNAライブラリを、コンピテントセルとキャリアDNA混合物を含むチューブに追加します。チューブを室温で10分間インキュベートした後、260マイクロリットルのポリエチレングリコール - 酢酸リチウム溶液を加え、ピペッティングにより混合する。

変換混合物を含むチューブを摂氏32度で振とうせずに2時間インキュベートします。43マイクロリットルの予熱したジメチルスルホキシドをチューブに加え、穏やかに混合します。次に、チューブを摂氏42度のヒートショックに5分間さらします。

細胞をペレット化し、前述のように上清を廃棄してから、残留ポリエチレングリコール酢酸リチウムTE溶液をピペットで取り出します。細胞を100マイクロリットルの滅菌水に再懸濁し、必要なサプリメントと4-NQOのミリリットルあたり0.2マイクログラムを含む1枚のEMM2プレートにプレートします。次に、プレートを摂氏32度で5〜6日間インキュベートすることにより、コロニーがプレート上に現れるようにします。

さらなるスクリーニングのために、得られたコロニーを4-NQO1ミリリットル当たり0.2マイクログラムの存在下で同じ培地プレート上にストリークする。1つのライブラリー形質転換実験では、形質転換に500マイクロリットルのコンピテントセルを使用し、4-NQOを含まない必要なサプリメントを含むEMM2プレート上の形質転換混合物の1 x 10のプレートを使用して、形質転換後に得られたライブラリークローンの総数を計算し、サプレッサークローンをスクリーニングします。滅菌96ウェルマイクロタイタープレートの各ウェルに100〜200マイクロリットルの滅菌水を追加します。

滅菌爪楊枝または20〜200マイクロリットルのマイクロピペットチップを使用して、4-NQOを含むプレート上のcDNAライブラリ形質転換後に得られた各コロニーから少量の接種材料をピックします。異なるコロニーのそれぞれからの接種材料を滅菌水を含むプレートの各ウェルに加え、完全に混合する。各ウェルから3マイクロリットルの細胞懸濁液をEMM2寒天プレートにスポットし、適切な濃度の4-NQOをプレートに加えます。

細胞を摂氏32度で3〜4日間増殖させた後、推定サプレッサーとして異なる濃度の4-NQOで増殖を示すコロニーを特定します。サプレッサーをさらに検証するには、選択したサプレッサーと適切なコントロール株を、ミリリットルあたり225マイクログラムのアデニンとウラシルを含むEMM2培地で、摂氏32度で一晩振とうしながら増殖させます。インキュベーション終了後、新鮮なEMM2培地で細胞を光学密度0.3に希釈し、中期まで摂氏32度で振とうしながら増殖させます。

EMM2プレート上で培養物の適切な段階希釈を、0.4マイクロモルの4-NQOまたは0.01%MMSを含む必要なサプリメントで見つけます。対照のために、必要なサプリメントを含むEMM2プレート上の菌株を見つけますが、DNA損傷剤はありません。プレートを摂氏32度で3〜5日間インキュベートして、成長を監視します。

目的の完全長遺伝子または空のベクターで形質転換された変異株を、ライブラリー形質転換体とともに、それぞれポジティブコントロールおよびネガティブコントロールとして見つけます。1ミリリットルあたり225マイクログラムのアデニンとウラシルを含むEMM2培地に単一の酵母コロニーを接種し、200〜250RPMで振とうしながら、摂氏32度で一晩細胞を増殖させます。インキュベーションの終わりに、室温で2分間4, 000倍Gで遠心分離することにより、光学密度0.5の10ミリリットルの培養物を収穫します。

上清を除去し、細胞ペレットを0.2ミリリットルの溶解バッファーに再懸濁します。0.2ミリリットルのフェノールクロロホルムイソアミルアルコールと0.3グラムの酸洗浄ガラスビーズを微量遠心管に加える。チューブを2分間ボルテックスして混合し、続いて氷上で1分間インキュベートします。

チューブを室温で15分間10, 000倍Gで遠心分離します。上部の水層を新しい微量遠心チューブに移し、200マイクロリットルのフェノールクロロホルムイソアミルアルコールを加えます。10, 000倍Gで10分間再度遠心分離した後、上部水層を新しいチューブに移します。

次に、2倍量の100%エタノールと1×10容量の酢酸ナトリウムをチューブに加え、摂氏マイナス70度で1時間インキュベートします。摂氏4度で15分間10, 000倍Gで遠心分離してDNAを沈殿させ、上清を除去します。DNAペレットを70%エタノールで洗浄し、室温で風乾します。

DNAを20マイクロリットルの滅菌水に再懸濁し、3〜5マイクロリットルのプラスミドDNAを使用して、有能な大腸菌細胞を形質転換します。標準プロトコルを使用して、単離した酵母プラスミドを大腸菌TOP10株に形質転換し、必要な抗生物質を含むLBプレート上に細胞を広げます。標準的なアルカリ溶解プロトコルを使用して大腸菌形質転換体からプラスミドを単離した後、制限酵素の適切な組み合わせに従って、制限酵素によるインサートDNA断片の放出を確認します。

次に、ell1欠失株における制限消化後のインサート放出を示すプラスミドを再形質転換し、ell1欠失株の遺伝毒性ストレス感受性表現型を救済する能力を調べた。ell1欠失シゾサッカロミセス・ポンベ株は野生株と比較して4-NQOに対して感受性を示した。4-NQOを欠くプレート上に多数のコロニーが得られる。

しかし、4-NQOプレートでは、ell1 null変異体の4-NQO感受性の懲罰的抑制因子として作用するため、より少ない形質転換体が得られました。620個の形質転換体のうち、74個が0.4マイクロモルの4-NQOで増殖を示した。74人中16人だけが0.8マイクロモルの4-NQOの存在下で成長を示したことが観察されました。

ell1欠失株を空のベクターで形質転換し、16個の形質転換体すべてが4-NQOを欠くプレート上で増殖を示した。空ベクターのみを含むell1欠失変異体は0.8マイクロモル4-NQOで増殖を示さず、6つの形質転換体は0.8マイクロモル4-NQOで増殖を示し、それらに存在するライブラリクローンがell1ヌル変異体の遺伝毒性ストレス表現型を抑制できることが示唆された。サプレッサープラスミド84および104の制限消化は、それぞれ1キロ塩基および800塩基対のインサートを放出した。

サプレッサープラスミドクローンをell1 null変異体に再導入すると、4-NQO関連増殖感受性が抑制されました。しかし、MMSの存在下では、ell1欠失変異体を含むサプレッサープラスミドは、空のベクターを有するものよりも多くの増殖を示した。これらの遺伝子スクリーニングは、潜在的な耐性メカニズムを描写し、新規の抗菌、抗真菌、抗寄生虫、または抗癌化合物のタンパク質標的を特定することができます。

彼らはまた、医薬品の作用機序を特定することができます。