出芽酵母におけるタンパク質ベース継承の高速スクリーニング

このハイスループット酵母表現型の全体的な目標は、タンパク質ベースの遺伝の代理として、発現が過ぎ去ったという持続的な表現型の記憶を不正にするタンパク質をスクリーニングすることです。この方法は、酵母プリオン分野の重要な問題、例えば、このタイプの遺伝を不正に行うことができるタンパク質の数などに答えるのに役立ちます。この手法の主な利点は、多くのタンパク質と経路を偏りなくスクリーニングできることです。

この手順は、テキストプロトコルに記載されているように、96ウェルプレートで30°Cの適切な酵母細胞を増殖させることから開始します。培養物を目視検査して、培養物が飽和していること、各ウェルの底に細胞が目視で見えることを確認します。リキッドハンドリングロボットを使用して、ウェルあたり45マイクロリットルの適切な培地を含む384ウェルプレートを準備します。

まず、Scal-URAを384ウェルプレートのウェルに分注します。次に、Scal-URAと対象のストレッサーを2番目のプレートのウェルに分注し、この実験では20ミリモルの塩化マンガンをストレッサーとして使用します。第三に、プラスミド発現を誘導しないSD-URAと塩化マンガンを別のプレートに分注します。

培養物を含む96ウェルプレートをリキッドハンドリングロボットに降ろし、96ウェルプレートの各ウェルから1マイクロリットルの1〜4アレイを、異なる培地で満たされた各384ウェルプレートの4つの別々のウェルに接種します。細胞を含むプレートを直ちに、室温および大気中の二酸化炭素でマイクロプレートスタッカー上に置きます。プロトコルを72時間の連続ループに設定し、マイクロプレートリーダーで600ナノメートルの光学密度を測定します。

増殖測定後、タンパク質の過剰発現を経験したSCal-URA誘導培養物のウェルあたり1マイクロリットルを、プラスミドのタンパク質発現を許さないST-URA培地のウェルあたり45マイクロリットルを含む新しい384ウェルプレートに移します。並行して、ストレッサーの存在下でST-URAで成長させた培養物から、ST-URAのウェルあたり45マイクロリットルを含む384ウェルプレートの2番目のセットの類似接種を行います。プレートを加湿チャンバーに入れ、プレートを摂氏30度から飽和度まで48時間成長させます。

48時間後、プレートを使用して、ST-URAのウェルあたり45マイクロリットルを含む384ウェルプレートにウェルあたり1マイクロリットルを再接種します。次に、同じソースプレートから、ストレッサーを使用してST-URAのウェルあたり45マイクロリットルを含む別の384ウェルプレートに、ウェルあたり1マイクロリットルの個別の再接種を行います。マイクロスタッカーの細胞を入れたプレートを室温および大気中の二酸化炭素に直ちに置き、プロトコルを48時間の連続ループに設定し、マイクロプレートリーダーで600ナノメートルの光学密度を測定します。

成長測定が完了したら、プレートリーダーソフトウェアを使用して、600ナノメートル測定での時間対光学密度をXYテーブルとしてエクスポートします。各生物学的複製の光学密度測定値のカラムをグループ化し、平均を計算します。600ナノメートルでの時間対光学密度のXYプロットを作成して、成長曲線を生成します。

祖先タンパク質の過剰発現に依存して、所与のストレッサーに応答して有意な増殖差を選択した培養物については、各生物学的複製から1マイクロリットルを採取し、10ミリリットルの水で希釈し、次いで5-FOAを含むプレート上に50マイクロリットルをプレート化する。摂氏30度で3日間成長します。これにより、プレートあたりのコロニーが多すぎたり少なすぎたりする場合は、それに応じて希釈係数を調整します。

プレートあたり100〜200コロニーが理想的です。オートクレーブ爪楊枝で8〜32個の単一コロニーを選び、ウェルあたり150マイクロリットルのSDCSMを含む96ウェルプレートに固定します。プレートを加湿チャンバーに入れ、摂氏30度で48〜72時間飽和まで成長させます。

これらの培養物を使用して、ストレッサーの有無にかかわらず、SDCSMのウェルあたり150マイクロリットルを含む96ウェルプレートの2つの新しいセットを接種します。プレートをマイクロプレートスタッカーに置き、48時間の連続ループで600ナノメートルの光学密度を測定するようにプロトコルを設定します。48時間後、先に示したようにデータを解析し、前に見られた有意な増殖差がプラスミド損失後も維持されることを確認します。

次に、誘導された表現型を維持する細胞は、テキストプロトコルに記載されているタンパク質ベースの遺伝の古典的な特徴について試験されます。このタンパク質ベースの遺伝スクリーニングにより、PSP1オープンリーディングフレームの一過性の過剰発現が明らかになり、過剰発現が停止した後も細胞内で数百世代にわたって維持されていた塩化マンガンに対する耐性が駆動されます。プリオン予測アルゴリズムは、PSP1の終末端を適度にプリオンに似ていると評価しました。

対照的に、このアルゴリズムは、この代表的な分析で示されているように、スクリーン上で回収されたほとんどの誘導タンパク質から有意なプリオン様配列の特徴を事実上予測しませんでした。塩化マンガンを用いた菌株とSDCSMの増殖測定は、対応するナイーブなPSP1マイナスコントロールに正規化され、HSP104脱凝集酵素の阻害はPSP1依存性塩化マンガン耐性を損なわないことを示しましたが、HSP70シャペロンとPSP1遺伝子の除去は、この表現型を遺伝的に排除することを示しました。PSP1依存性表現型状態とナイーブ株を保有する、系統間の交配の単一の四分から得られるすべての胞子は、塩化マンガン抵抗性を示し、表現型の非メンデル遺伝を示しています。

模擬ライセートと、感染性物質としてライセートを保有するPSP1との間のタンパク質形質転換の感染性を比較したところ、播種したPSP1で形質転換したナイーブ細胞の53%以上が、対応する塩化マンガン耐性の表現型を受け取っていることが示されました。一度習得すれば、この技術はインキュベーションステップを含めて数週間で完了し、ほとんどのスクリーニングステップの準備は、多数のプレートを使用しても1日あたり2時間未満で行うことができます。この手順を試す際には、事前にテストしたいものを正確に計画し、実験の規模を念頭に置いておくことが重要です。

さて、これはこのテクニックの初心者にとって特に重要です。この手順に続いて、テキストプロトコルに記載されているような他の方法を実行して、スクリーニングで観察された表現型が真のプリオン様遺伝パターンを示すかどうかを判断できます。この技術の開発後、この技術は、エピジェネティクスの分野の研究者がサクラリスサービスCIにおけるプリオン生物学の幅を探求する道を開きました。このビデオを見た後、酵母における新しい形態のタンパク質ベースの遺伝のためのハイスループットスクリーニングを、偏りなく、かつターゲットを絞った方法で設計する方法を十分に理解しているはずです。

DNA損傷剤などの特定の化学的ストレス要因は非常に危険である可能性があるため、この手順を実行するときは常に個人用保護具の着用などの予防措置を講じる必要があることを忘れないでください。