Name: 出芽酵母におけるタンパク質ベース継承の高速スクリーニング (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-08T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 12 s
Description: 学ぶ出芽酵母におけるタンパク質ベース継承の高速スクリーニング手法。S. cerevisiaeを用いて持続的な表現型記憶を誘導するタンパク質を同定し、プリオン生物学の理解に貢献する効率的なアプローチを解説します。

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我々 は、彼らの思慮深いコメントの校閲者と同様に、本稿で使用される試金の開発に彼らの支援のため Sohini Chakrabortee、サンドラ ・ ジョーンズ、ダビド ガルシア、Bhupinder Bhullar、アメリア チャン、彼女はリチャードとスーザン ・ リンドキストをありがちましょう。

<ol><li>Halfmann, R., Alberti, S., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prions%2C+protein+homeostasis%2C+and+phenotypic+diversity%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Prions, protein homeostasis, and phenotypic diversity.</a> Trends Cell Biol. 20 (3), 125-133 (2010).</li>
<li>Byers, J. S., Jarosz, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pernicious+pathogens+or+expedient+elements+of+inheritance%3A+the+significance+of+yeast+prions%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Pernicious pathogens or expedient elements of inheritance: the significance of yeast prions.</a> PLoS Pathog. 10 (4), 1003992(2014).</li>
<li>Jarosz, D. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cross-kingdom+chemical+communication+drives+a+heritable%2C+mutually+beneficial+prion-based+transformation+of+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cross-kingdom chemical communication drives a heritable, mutually beneficial prion-based transformation of metabolism.</a> Cell. 158 (5), 1083-1093 (2014).</li>
<li>True, H. L., Lindquist, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+yeast+prion+provides+a+mechanism+for+genetic+variation+and+phenotypic+diversity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A yeast prion provides a mechanism for genetic variation and phenotypic diversity.</a> Nature. 407 (6803), 477-483 (2000).</li>
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<li>Khan, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amyloidogenic+Oligomerization+Transforms+Drosophila+Orb2+from+a+Translation+Repressor+to+an+Activator%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Amyloidogenic Oligomerization Transforms Drosophila Orb2 from a Translation Repressor to an Activator.</a> Cell. 163 (6), 1468-1483 (2015).</li>
<li>Fioriti, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Persistence+of+Hippocampal-Based+Memory+Requires+Protein+Synthesis+Mediated+by+the+Prion-like+Protein+CPEB3%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">The Persistence of Hippocampal-Based Memory Requires Protein Synthesis Mediated by the Prion-like Protein CPEB3.</a> Neuron. 86 (6), 1433-1448 (2015).</li>
<li>Derkatch, I. L., Bradley, M. E., Hong, J. Y., Liebman, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prions+affect+the+appearance+of+other+prions%3A+the+story+of+%5BPIN%28%2B%29%5D%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Prions affect the appearance of other prions: the story of [PIN(+)].</a> Cell. 106 (2), 171-182 (2001).</li>
<li>Alberti, S., Halfmann, R., King, O., Kapila, A., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+systematic+survey+identifies+prions+and+illuminates+sequence+features+of+prionogenic+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A systematic survey identifies prions and illuminates sequence features of prionogenic proteins.</a> Cell. 137 (1), 146-158 (2009).</li>
<li>Chernoff, Y. O., Lindquist, S. L., Ono, B., Inge-Vechtomov, S. G., Liebman, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+the+chaperone+protein+Hsp104+in+propagation+of+the+yeast+prion-like+factor+%5Bpsi%2B%5D%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Role of the chaperone protein Hsp104 in propagation of the yeast prion-like factor [psi+].</a> Science. 268 (5212), 880-884 (1995).</li>
<li>Patino, M. M., Liu, J. J., Glover, J. R., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Support+for+the+prion+hypothesis+for+inheritance+of+a+phenotypic+trait+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Support for the prion hypothesis for inheritance of a phenotypic trait in yeast.</a> Science. 273 (5275), 622-626 (1996).</li>
<li>Wickner, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%5BURE3%5D+as+an+altered+URE2+protein%3A+evidence+for+a+prion+analog+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">[URE3] as an altered URE2 protein: evidence for a prion analog in Saccharomyces cerevisiae.</a> Science. 264 (5158), 566-569 (1994).</li>
<li>Sondheimer, N., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rnq1%3A+an+epigenetic+modifier+of+protein+function+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Rnq1: an epigenetic modifier of protein function in yeast.</a> Mol Cell. 5 (1), 163-172 (2000).</li>
<li>Balbirnie, M., Grothe, R., Eisenberg, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+amyloid-forming+peptide+from+the+yeast+prion+Sup35+reveals+a+dehydrated+beta-sheet+structure+for+amyloid%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">An amyloid-forming peptide from the yeast prion Sup35 reveals a dehydrated beta-sheet structure for amyloid.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 98 (5), 2375-2380 (2001).</li>
<li>Glover, J. R., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/9182769">Self-seeded fibers formed by Sup35, the protein determinant of [PSI+], a heritable prion-like factor of S. cerevisiae.</a> Cell. 89 (5), 811-819 (1997).</li>
<li>King, C. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prion-inducing+domain+2-114+of+yeast+Sup35+protein+transforms+in+vitro+into+amyloid-like+filaments%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Prion-inducing domain 2-114 of yeast Sup35 protein transforms in vitro into amyloid-like filaments.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (13), 6618-6622 (1997).</li>
<li>Shorter, J., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hsp104+catalyzes+formation+and+elimination+of+self-replicating+Sup35+prion+conformers%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Hsp104 catalyzes formation and elimination of self-replicating Sup35 prion conformers.</a> Science. 304 (5678), 1793-1797 (2004).</li>
<li>Ferreira, P. C., Ness, F., Edwards, S. R., Cox, B. S., Tuite, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+elimination+of+the+yeast+%5BPSI%2B%5D+prion+by+guanidine+hydrochloride+is+the+result+of+Hsp104+inactivation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The elimination of the yeast [PSI+] prion by guanidine hydrochloride is the result of Hsp104 inactivation.</a> Mol Microbiol. 40 (6), 1357-1369 (2001).</li>
<li>Caudron, F., Barral, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+super-assembly+of+Whi3+encodes+memory+of+deceptive+encounters+by+single+cells+during+yeast+courtship%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A super-assembly of Whi3 encodes memory of deceptive encounters by single cells during yeast courtship.</a> Cell. 155 (6), 1244-1257 (2013).</li>
<li>Wickner, R. B., Edskes, H. K., Shewmaker, F. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/16793280">How to find a prion: [URE3], [PSI+] and [beta].</a> Methods. 39 (1), 3-8 (2006).</li>
<li>Chernoff, Y. O., Derkach, I. L., Inge-Vechtomov, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multicopy+SUP35+gene+induces+de-novo+appearance+of+psi-like+factors+in+the+yeast+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Genet%22%5BJournal%5D)">Multicopy SUP35 gene induces de-novo appearance of psi-like factors in the yeast Saccharomyces cerevisiae.</a> Curr Genet. 24 (3), 268-270 (1993).</li>
<li>Brown, J. C., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+heritable+switch+in+carbon+source+utilization+driven+by+an+unusual+yeast+prion%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">A heritable switch in carbon source utilization driven by an unusual yeast prion.</a> Genes Dev. 23 (19), 2320-2332 (2009).</li>
<li>Coustou, V., Deleu, C., Saupe, S., Begueret, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+protein+product+of+the+het-s+heterokaryon+incompatibility+gene+of+the+fungus+Podospora+anserina+behaves+as+a+prion+analog%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">The protein product of the het-s heterokaryon incompatibility gene of the fungus Podospora anserina behaves as a prion analog.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (18), 9773-9778 (1997).</li>
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<li>Chakrabortee, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrinsically+Disordered+Proteins+Drive+Emergence+and+Inheritance+of+Biological+Traits%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Intrinsically Disordered Proteins Drive Emergence and Inheritance of Biological Traits.</a> Cell. 167 (2), 369-381 (2016).</li>
<li>Hu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Approaching+a+complete+repository+of+sequence-verified+protein-encoding+clones+for+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Approaching a complete repository of sequence-verified protein-encoding clones for Saccharomyces cerevisiae.</a> Genome Res. 17 (4), 536-543 (2007).</li>
<li>Swain, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inferring+time+derivatives+including+cell+growth+rates+using+Gaussian+processes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Inferring time derivatives including cell growth rates using Gaussian processes.</a> Nat Commun. 7, 13766(2016).</li>
<li>Jarosz, D. F., Lancaster, A. K., Brown, J. C., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+evolutionarily+conserved+prion-like+element+converts+wild+fungi+from+metabolic+specialists+to+generalists%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">An evolutionarily conserved prion-like element converts wild fungi from metabolic specialists to generalists.</a> Cell. 158 (5), 1072-1082 (2014).</li>
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<li>Halfmann, R., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Screening+for+amyloid+aggregation+by+Semi-Denaturing+Detergent-Agarose+Gel+Electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Screening for amyloid aggregation by Semi-Denaturing Detergent-Agarose Gel Electrophoresis.</a> J Vis Exp. (17), (2008).</li>
<li>Rogoza, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-Mendelian+determinant+%5BISP%2B%5D+in+yeast+is+a+nuclear-residing+prion+form+of+the+global+transcriptional+regulator+Sfp1%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Non-Mendelian determinant [ISP+] in yeast is a nuclear-residing prion form of the global transcriptional regulator Sfp1.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (23), 10573-10577 (2010).</li>
<li>Shorter, J., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prions+as+adaptive+conduits+of+memory+and+inheritance%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Prions as adaptive conduits of memory and inheritance.</a> Nat Rev Genet. 6 (6), 435-450 (2005).</li>
<li>Tanaka, M., Chien, P., Naber, N., Cooke, R., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conformational+variations+in+an+infectious+protein+determine+prion+strain+differences%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Conformational variations in an infectious protein determine prion strain differences.</a> Nature. 428 (6980), 323-328 (2004).</li>
<li>Tanaka, M., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+efficient+protein+transformation+protocol+for+introducing+prions+into+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">An efficient protein transformation protocol for introducing prions into yeast.</a> Methods Enzymol. 412, 185-200 (2006).</li>
<li>Roberts, B. T., Wickner, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heritable+activity%3A+a+prion+that+propagates+by+covalent+autoactivation%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Heritable activity: a prion that propagates by covalent autoactivation.</a> Genes Dev. 17 (17), 2083-2087 (2003).</li>
<li>Ozbudak, E. M., Thattai, M., Lim, H. N., Shraiman, B. I., Van Oudenaarden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multistability+in+the+lactose+utilization+network+of+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Multistability in the lactose utilization network of Escherichia coli.</a> Nature. 427 (6976), 737-740 (2004).</li>
</ol>

著者が明らかに何もありません。

最初の酵母プリオンは、彼らの異常な表現型と継承の複雑なパターンによって識別されました。これらのプリオンの特性は、アルゴリズムと計算ツール追加プリオン蛋白質のため画面を構築するそれから使用されました。ここで説明する方法は対照的は実験的一時的な過剰発現タンパク質の立体構造の状態でエンコードされた永続的な変更は安定を作成するに依存しています。ただし、任意の特定の蛋白質の過剰発現によるプリオン アセンブリを「シーディング」の効率が非常に低い場合、そのタンパク質はこのタイプの過剰発現画面で偽陰性として出現継続的に。この問題を解決する 1 つこのような変更は、将来的に蛋白の過剰発現に 2 ミクロン プラスミドを使用する実験でしょう。最後に、各誘導のプリオンは成長の表現型の独自のセットがすべての条件で明白な試金しません。したがって、さまざまな条件と用量テストの数は、ヒット数を制限します。
重要なは、すべての種類のタンパク質に基づく継承同様に回復されますこのメソッドを使用しています。タンパク質を効率的に毒性の有無で過剰に発現することはできません明らかに継続的に逃されます。"Mnemons、"などの...

生物学的システムはよくタンパク質豊富で過渡変動を経験します。これらは有機体のまたは将来の世代の表現型を形作る上で永続的な影響をあるかどうかは不明します。この生物の最も有名なインスタンスを含むタンパク質、プリオンは、ゲノム修正なしの遺伝性の特性の出現をドライブの珍しいクラス。代わりに、これらのプロの teinaceous とのfectious 粒子タンパク質構造1,2の自己永続的変更による表現型を送信します。この型を継承は、壊滅的な神経変性疾患の異常な継承のパターンの原因として発見されました。しかし、菌類から哺乳類3,4,5,6,7,8,9,10まで及ぶ有機体の研究は以来プリオンのような要素が適応値を与えることができること明らかに。それにもかかわらず、プリオンは、魅惑的で珍しい生物風変わりなしかしとして表示されています。
この相場の知恵は、継承の蛋白質ベースの特性は長い例の小さなセットによって制限されているので一部で開催されます。最近の組織的スクリーニングの努力は大幅燃料プリオンのような構造変換する能力を持ついくつかの新しいbona fideプリオン11およびほぼ 2 つのダース蛋白質ドメイン12を識別することによってこの画像を拡大しています。ただし、これらのアプローチは、一般的に強力なアミノ酸シーケンス バイアスを当てている、ので、発見されているプリオンは創立酵母プリオン [PSI+]13,14、[URE3]15[RNQ+]11,16の生化学的性質を共有します。これらが含まれます: 1) モジュラー ドメイン アスパラギン (N) とグルタミン (Q)、2)、アミロイド [プリオン+] 構造17,18,に19アセンブリの長い高分子の伸張に富んでいる、3) 完了 disaggregase 母から娘13,20,21に忠実な伝播のための Hsp104 関数に依存します。確かに、多くbona fideプリオンを含む [ガー+] [ヘット s]、元プリオン (PrPSc) にも、このような厳しい条件下では見逃されること。おそらくもっと重要なは、彼らことはできません蛋白質ベースの継承22の任意の新規メカニズムをキャプチャします。したがって、このような現象の真の生物学的幅は、はるか以前の仮定より自然で一般的な可能性があります。
この問題を調べるためには、高スループット、プロテオーム的戦略が採用されました。PrPSc[ガー+] を含む全てのプリオンの特徴 [ヘット-s] は、原因タンパク質の一過性発現が強くプリオン買収15,23,24,25,26の率を増加することとします。一過性個々 のタンパク質の発現を誘導することによって安定した蛋白質ベース、エピジェネティック状態を開始できる場合、体系的に全体にわたって酵母の ORFeome、お願い、この機能の利用をしました。その蛋白の過剰発現は、表現型27を変更できますをよく知られています。しかし、彼らの一時的な過剰世代初期の過剰発現後の数百の遺伝性は表現型の変化を生成するため、プリオン蛋白質は通常ありません。以前、ホリールード ゲノム28を変えないで表現型の風景を再配線することができる蛋白質の多数を識別するために、タンパク質ベース遺伝的要素の異常な継承のパターンだけでなく、この機能を利用しました。いくつかの特定蛋白質以前として知られていたプリオン、ほとんどなかった、タンパク質ベースの継承の新たな形態を明らかにするこのアプローチの力を強調します。

<table><tbody><tr><td>グアニジン塩酸塩</td><td>Sigma</td><td>Cat#G3272-25G</td><td>化学</td></tr><tr><td>塩化マンガン</td><td>Sigma</td><td>Cat#M8054-100G</td><td>化学</td></tr><tr><td>エチジウムブロマイド</td><td>ΣE1510</td><td>化学</td><td></td></tr><tr><td>5-フルオロロ酸</td><td>Σ</td><td>Cat#F5013-50MG</td><td>化学</td></tr><tr><td>BY4741 MATa (his3&Delta;1 leu2&デルタ;0 LYS2 met15&Delta;0 ura3&Delta;0)</td><td>Winston et al., 1995;Brachmann et al., 1998</td><td>N/A</td><td>酵母株</td></tr><tr><td>BY4741 MAT&alpha;(彼の3&Delta;1 leu2&デルタ;0 lys2&デルタ;0 MET15 ura3&Delta;0)</td><td>Winston et al., 1995;Brachmann et al., 1998</td><td>N/A</td><td>酵母株</td></tr><tr><td>Hsp70 (K69M)&nbsp;</td><td>Jarosz et al., 2014b</td><td>N/A</td><td>Plasmid</td></tr><tr><td>FLEXGene library</td><td>Hu et al., 2007</td><td>N/A</td><td>Plasmid library</td></tr><tr><td>Dextrose (glucose)</td><td>Fisher Scientific</td><td>D16-3</td><td>メディアコンポーネント</td></tr><tr><td>Raffinose</td><td>Sigma</td><td>R0250-25G</td><td>メディアコンポーネント</td></tr><tr><td>Galactose</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP656-500</td><td>メディアコンポーネント</td></tr><tr><td>CSM</td><td>Sunriseサイエンス</td><td>1001-100</td><td>メディアコンポーネント</td></tr><tr><td>CSM-URA</td><td>サンライズサイエンス</td><td>1004-100</td><td>メディアコンポーネント</td></tr><tr><td>CSM-LYS</td><td>サンライズサイエンス</td><td>1032-100</td><td>メディアコンポーネント</td></tr><tr><td>CSM-MET</td><td>サンライズサイエンス</td><td>1019-100</td><td>メディアコンポーネント</td></tr><tr><td>CSM-LYS-MET</td><td>サンライズサイエンス</td><td>1035-100</td><td>メディアコンポーネント</td></tr><tr><td>酵母エキス</td><td>フィッシャー科学的な</td><td>BP1422-2</td><td>培地成分</td></tr><tr><td>ペプトン</td><td>研究製品 国際</td><td>P20240-5000</td><td>培地成分</td></tr><tr><td>バクトペプトン</td><td>BD</td><td>211677</td><td>培地成分</td></tr><tr><td>グリセロール</td><td>EMD ミリポア</td><td>GX0185-2</td><td>培地成分</td></tr><tr><td>酵母 窒素塩基 w/o アミノ酸</td><td>BD</td><td>291920</td><td>培地成分</td></tr><tr><td>寒天</td><td>IBI Scientific</td><td>IB49172</td><td>メディアコンポーネント</td></tr><tr><td>硫酸アデニン</td><td>Σ</td><td>A3159-25G</td><td>メディアコンポーネント</td></tr><tr><td>酢酸カリウム</td><td>Σ</td><td>P1190-500G</td><td>メディアコンポーネント</td></tr><tr><td>ウラシル</td><td>シグマ</td><td>U0750-100G</td><td>メディアコンポーネント</td></tr><tr><td>ヒスチジン</td><td>シグマ</td><td>H8000-100G</td><td>メディアコンポーネント</td></tr><tr><td>ロイシン</td><td>シグマ</td><td>L8000-25G</td><td>メディアコンポーネント</td></tr><tr><td>リジン</td><td>シグマ</td><td>L5501-25G</td><td>メディアコンポーネント</td></tr><tr><td>RNase I&nbsp;</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>EN0601</td><td>酵素</td></tr><tr><td>ビオチン化DNase</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>AM1906</td><td>酵素</td></tr><tr><td>ザイモリアーゼ100T(酵母溶解酵素)</td><td>サンライズサイエンス</td><td>N0766555</td><td>酵素</td></tr><tr><td>マイクロプレートリーダー</td><td>BioTek</td><td>Synergy H1</td><td>機器</td></tr><tr><td>マイクロプレートスタッカー</td><td>BioTek</td><td>BioStack3</td><td>機器</td></tr><tr><td>プレートフィラー</td><td>BiotTek</td><td>EL406</td><td>Equipment</td></tr><tr><td>リキッドハンドリングロボット</td><td>Beckman Coulter</td><td>Biomek FX</td><td>Equipment</td></tr></tbody></table>

出芽酵母におけるタンパク質ベース継承の高速スクリーニング

High-throughput Screening for Protein-based Inheritance in S. cerevisiae

将来の世代にアクセス可能な生物学的情報のエンコードは、DNA シーケンスの変更を介して達成される一般に。(シーケンスではなく) 蛋白質立体構造でエンコードされた長寿命の継承は、パラダイム シフトしますが、珍しいとして表示されている長い。などのエピジェネティックな要素の最高の特徴の例は、プリオンは、新しい表現型の遺伝的症状をドライブすることができます自己組織化挙動を所有しています。多くの典型的なプリオンは印象的な豊富な N/Q シーケンス バイアスを表示し、アミロイドの折りにアセンブルします。これらの珍しい特徴は、新しいプリオン蛋白質を識別するほとんどのスクリーニングの努力を知らせています。ただし、(創設のプリオン、PrPScを含む)、少なくとも 3 つの知られているプリオンは、これらの生化学的な特徴を港ないです。したがってプローブ質量作用のプロパティに基づいて蛋白質ベースの継承の範囲に代替法を開発した: プリオン蛋白質の一時的な過剰発現する彼らは自己テンプレート構造を取得頻度が増加します。本稿では、蛋白質ベースの継承を引き出す酵母 ORFeome の能力を分析するためのメソッドについて説明します。この戦略を使用して、我々 は以前ことを発見した &gt; イースト蛋白質の 1% は長寿命、安定した遺伝の突然変異よりも頻繁に起こったされ生物学的形質の出現を燃料でした。全体 ORFeomes 全体または特定の遺伝子ネットワークまたは環境刺激の標的スクリーニング パラダイムとして、高スループットでこの方法を採用できます。同様に前方遺伝的画面多数発達とシグナル伝達経路を定義する、これらの技術は生物学的過程での蛋白質ベースの継承の影響を調査するための方法論を提供します。

タンパク質の過剰発現は、細胞表現型を劇的に変化させることが知られている27。実際、初期のスクリーニング手法により、わずか10種類のストレス因子を用いただけで、酵母ORFeomeのクローンの過剰発現から数百もの新しい表現型が再現性高く得られた。しかし、上述のアッセイを用いることで、このような過剰発現後に細胞が長期的に安定した表現型を保持しているかどうかを評価することが可能となる。このような状態をコードできるタンパク質の一つにPsp1がある。Psp1は機能未知のタンパク質であり、複製機構の変異体（e.g., pol alpha34）を抑制することができる。 PSP1 ORFの過剰発現は、さまざまなストレス因子において細胞表現型を調節した。驚くべきことに、ある表現型（塩化マンガンに対する耐性）は、過剰発現が停止した後（i.e., Psp1の誘導を直接経験したことはないが、その祖先が経験した後代の細胞）においても、数百世代にわたって...

このプロトコルでは、出芽酵母でタンパク質に基づく継承のため画面の機能的に高スループット方法論について説明します。

The encoding of biological information that is accessible to future generations is generally achieved via changes to the DNA sequence. Long-lived ...

このハイスループット酵母フェノタイピングの全体的な目的は、タンパク質ベースの遺伝の代替指標として、過去の発現による持続的な表現型記憶を誘発するタンパク質をスクリーニングすることです。この手法は、どの程度の数のタンパク質がこの種の遺伝を誘発し得るかなど、酵母プリオン分野における重要な疑問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、多くのタンパク質やパスウェイをバイアスなくスクリーニングできることです。テキストプロトコルに記載されている通り、96ウェルプレートを用いて適切な酵母細胞を30 °Cで培養し、本手順を開始します。培養液を視覚的に確認し、各ウェルの底に細胞が目視で確認できるほど飽和していることを確認してください。液体分注ロボットを使用して、1ウェルあたり45 µLの適切な培地を含む384ウェルプレートを調製します。まず、384ウェルプレートの各ウェルにScal-URAを分注します。次に、2枚目のプレートの各ウェルに、Scal-URAと目的のストレス因子を分注します。本実験では、ストレス因子として20 millimolarの塩化マンガンを使用します。3枚目のプレートには、プラスミドの発現を誘導しないSD-URAと塩化マンガンを分注します。培養液を含む96ウェルプレートを液体ハンドリングロボットにセットし、96ウェルプレートの各ウェルから1 µLずつ、異なる培地を満たした384ウェルプレートの4つの独立したウェルに1〜4のアレイで接種します。細胞を含むプレートを直ちにマイクロプレートスタッカーに配置し、室温および大気中CO2濃度の条件下で保持します。プロトコルを72時間の連続ループに設定し、マイクロプレートリーダーを用いて600 nmにおける光学密度を測定します。増殖測定後、タンパク質の過剰発現が起こったSCal-URA誘導培養液を、1ウェルあたり1 µLずつ、プラスミドのタンパク質発現を許容しないST-URA培地を1ウェルあたり45 µL含む新しい384ウェルプレートに分注します。並行して、ストレス因子存在下のST-URAで培養した培養液からも、ST-URAを1ウェルあたり45 µL含む2つ目の384ウェルプレートに同様の接種を行います。プレートを加湿チャンバーに入れ、30 °Cで48時間、飽和状態まで培養します。48時間後、これらのプレートを用いて、ST-URAを1ウェルあたり45 µLずつ分注した384ウェルプレートに、1ウェルあたり1 µLずつ再接種します。次に、同じソースプレートから別の384ウェルプレート（ストレッサーを含むST-URAを1ウェルあたり45 µLずつ分注したもの）へ、1ウェルあたり1 µLずつ別途再接種を行います。細胞が入ったプレートを直ちに室温および大気中の二酸化炭素条件下にあるマイクロスタッカーに設置し、マイクロプレートリー

high-throughput-screening-for-protein-based-inheritance-s

Research

JoVE Journal

Biology

生物学

GFP融合タンパク質は、広く共焦点顕微鏡による細胞小器官を可視化するために使用されます。しかし、細胞小器官の形態に影響を与える変異のスクリーニングは通常、個々の変異誘発を必要とし、時間のかかる作業です。ここで、我々は同時に、酵母のほぼ5000の非必須遺伝子のオルガネラ-...

グローバルS. cerevisiaeの細胞小器官の形態を研究するためにハイスループット法

ここではでプラスミド過剰発現の画面を説明...

ハイスループット酵母プラスミドの過剰発現の画面

我々は包括的、公平なゲノムワイドな遺伝子薬剤と遺伝子 -...

バーコード酵母ライブラリーの競争力のあるゲノム画面

ほぼ全Sを含むタンパク質マイクロアレイを用いて、 セレビシエプロテオームは、並行して、タンパク質-タンパク質相互作用の何千もの迅速公正な尋問のためにプローブされます。この方法は、タンパク質 - 小分子、翻訳後修飾、およびハイスループットの他のアッセイに利用することができます。...

タンパク質 - タンパク質相互作用を検出するために、高密度機能タンパク質マイクロアレイのプロービング

ここでは、出芽酵母における化学遺伝学的相互作用を定義するための費用対効果の高い方法を提示します。このアプローチは、酵母分子生物学の基本的な技術に基づいて構築されており、化学物質の小規模から中規模のコレクションやその他の培地環境の機構的調査に適しています。...

における化学遺伝の相互作用の迅速な同定<em&gt;サッカロマイセス·セレビシエ</em

私たちは、Saccharomyces cerevisiaeの指向性進化キャンペーンのための突然変異体ライブラリを構築し、スクリーニングするための詳細なプロトコルを提示します。...

指向進化方法で<em&gt;サッカロマイセス・セレビシエ</em&gt;：変異体ライブラリーの作成およびスクリーニング

酵母の過剰発現の交尾ベース ライブラリ スクリーニング

酵母分裂簡便なサプレッサー スクリーンのプロトコルを提案します。この方法は、効率的な変異原無料、頻繁に単一の genomic 位置で起こる突然変異の選択です。...

分裂酵母分裂酵母のディープ シーケンス アシスト、自発的な抑制画面

微生物工学の「設計構築テスト」サイクルのボトルネックは、株の機能画面を実行できる速度です。液滴ベースのRNAシーケンシングを利用した実験ごとに数百~数千個の酵母細胞に適用される菌株スクリーニングのハイスループット法について述べています。...

液滴ベースのRNAシーケンシングによるハイスループット酵母株フェノタイピング

この研究は、 シゾサッカロミセス・ポンベにおけるマルチコピーサプレッサー遺伝子スクリーニングのプロトコルについて説明しています。このスクリーニングでは、ゲノムワイドなプラスミドライブラリを使用して、クエリ変異株に関連する機能喪失表現型のサプレッサークローンを特定します。 ell1...

シゾサッカロミセス・ポンベにおけるマルチコピーサプレッサー同定のための遺伝子スクリーニング

このプロトコールは、目的の抗原に結合するタンパク質変異体を濃縮するための酵母表面ディスプレイ選択キャンペーンを実施するための重要なステップを説明しています。...

酵母表面ディスプレイによるタンパク質工学

学ぶ出芽酵母におけるタンパク質ベース継承の高速スクリーニング手法。S. cerevisiaeを用いて持続的な表現型記憶を誘導するタンパク質を同定し、プリオン生物学の理解に貢献する効率的なアプローチを解説します。

出芽酵母におけるタンパク質ベース継承の高速スクリーニング

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