インビトロで破骨細胞再吸収を可視化および定量するためのシンプルなピットアッセイプロトコル
June 16th, 2022
ここでは、リン酸カルシウムコーティング細胞培養プレートを用いた再吸収ピットアッセイのための簡単で効果的なアッセイ手順を提示する。
私たちのプロトコルは、破骨細胞再吸収アッセイのための簡単で信頼性の高い方法を説明しています。リン酸カルシウムコーティングされた細胞培養プレートの使用は、ラボで利用可能な材料を使用して容易に調製および視覚化することができる。不透明な骨や象牙質のスライスとは対照的に、リン酸カルシウムコーティングは、再吸収ピットと細胞を同時に視覚化することを可能にします。
このプロトコルでは、破骨細胞の分化にPBMCを使用します。しかし、骨髄由来単球またはRaw 264.7細胞のような他の細胞型にも適用することができる。まず平底96ウェル細胞培養プレートと予め調製したリン酸カルシウム溶液300マイクロリットルのピペットを各ウェルに取り込む。
その後、プレートを蓋で覆い、プレートを摂氏37度で3日間インキュベートする。3日後、予め石灰化した96ウェル細胞培養プレートから予備石灰化溶液を吸引し、各ウェルにリン酸カルシウム溶液300マイクロリットルを加える。プレートを蓋で覆い、摂氏37度で1日間インキュベートする。
その後、プレートを反転させて溶液を注ぎ出し、プレートを脱イオン水で3回徹底的に洗浄します。ヘアドライヤーまたは圧縮二酸化炭素または窒素ガスを使用してプレートを直ちに乾燥させ、均一な表面を維持します。さて、クリーンベンチの上の塗装板に紫外線を1時間照射します。
コーティングされたプレートをすぐに使用するか、パラフィルムでプレートを密封し、室温で保管してください。15ミリリットルの淡血を等量のPBSで希釈し、数回反転またはピペッティングして混合する。次いで、50ミリリットルの円錐形チューブに15ミリリットルの密度勾配溶液を採取し、チューブを傾け、15ミリリットルの密度勾配溶液上に30ミリリットルの希釈血液サンプルを慎重に重ねる。
その後、チューブをスイングバケットローターで810倍Gで休憩なく20°Cで20分間遠心分離します。次いで、単核球層を界面に乱れずに残して上層を吸引する。単核球細胞層を新しい50ミリリットルの円錐管に慎重に移す。
チューブをPBSで満たし、混合し、300倍Gで20°Cで10分間遠心分離する。PBMCsを1ミリリットル当たり20ナノグラムのマクロファージコロニー刺激因子を含む完全なα−MEMに再懸濁し、フラスコ内のPBMCsをセンチメートル平方あたり10〜5番目の細胞に2.5回播種する。リン酸カルシウムコーティングプレートを50マイクロリットルのウシ胎児血清とともに摂氏37度で1時間インキュベートする。
次に、フラスコをPBSで2回洗浄して破骨細胞前駆体を死細胞または非接着細胞から剥離し、次いで75平方センチメートルフラスコ当たり4ミリリットルのトリプシンを加える。30分後、4ミリリットルの完全α-MEMを加えて消化を止め、細胞スクレーパーを用いて細胞を慎重に剥離する。細胞を50ミリリットルのチューブに移し、計数チャンバを用いて細胞の総数を計数した。
チューブを350倍Gで7分間遠心分離して細胞をペレット化し、ペレットを蘇生させ、M-CSFおよびRANKLを含むアルファMEMを完成させて、1ミリリットルあたり10〜6個の細胞を1回得る。リン酸カルシウムコートプレートからウシ胎児血清を吸引し、1ウェルあたり200マイクロリットルの細胞懸濁液をピペットした。インキュベーション後、細胞をPBSで2回洗浄する。
細胞を4%パラホルムアルデヒドで10分間固定し、PBSで再度洗浄する。染色のために、固定細胞に透過処理緩衝液を加え、それらを5分間インキュベートする。アクチンフィラメントを染色するには、細胞を100マイクロリットルのAlexa Fluor 546標識ファロイジン溶液と共にPBS中で30分間インキュベートし、次いで染色溶液を吸引し、100マイクロリットルのヘキストを用いて核を10分間染色する。
リン酸カルシウムコーティングを100マイクロリットルの10マイクロモルカルセインおよびPBSで10分間染色する。PBSで3回洗浄した後、画像をキャプチャします。リン酸カルシウムコーティングのフォンコッサ染色のために、50マイクロリットルの5%硝酸銀および脱イオン水を各ウェルに加え、ウェルの底部のコーティングが茶色になるまでプレートを紫外線照射下で1時間インキュベートする。
96ウェルプレートの底部にあるリン酸カルシウムコーティングは、均一でよく接着しているように見えた。リン酸カルシウムコーティングプレート上のM−CSFおよびRANKLでの9日間の培養後、破骨細胞前駆体は再吸収ピットおよび大きな破骨細胞を形成した。ピット内に位置する多核破骨細胞は、高いTRAPレベルを発現した。
成熟破骨細胞は、3つ以上の核および別個のアクチン環の存在を示した。緑色のリン酸カルシウムコーティングは、黒い再吸収ピットの存在を示した。破骨細胞の数とサイズはROIマネージャーを使用して計算され、RANKLの非存在下で増殖した画像J.破骨細胞の前駆体の多角形選択ツールを使用して破骨細胞の数とサイズは再吸収ピットを形成できなかったが、M-CSFおよびRANKLは骨殻形成ピットの形成を促進した。
画像J.を用いてピット面積を定量化し、塗布板を気流で直ちに乾燥させることで、均一なリン酸カルシウム被膜を作るのに役立つ。さもなければ、それは井戸の真ん中でより厚いコーティングを形成する傾向があります。
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概要
この記事では、リン酸カルシウムコーティングされた細胞培養プレートを使用した破骨細胞の吸収アッセイを実施するための信頼性の高い方法を紹介します。このプロトコルにより、吸収ピットと細胞を同時に視覚化することができ、アッセイの有効性が向上します。
主要な研究構成要素
科学の分野
- 神経科学
- 細胞生物学
- 骨生物学
背景
- 破骨細胞の活性は骨吸収に不可欠です。
- 不透明な材料を使用する従来の方法では視覚化が制限されます。
- リン酸カルシウムコーティングにより細胞間相互作用のより明確な視覚化が可能になります。
- この方法は様々な細胞タイプに適応可能です。
研究の目的
- 破骨細胞の吸収のためのシンプルで効果的なアッセイを開発すること。
- 吸収ピットと細胞の視覚化を向上させること。
- 研究室で容易に実装できるプロトコルを提供すること。
使用された方法
- リン酸カルシウムコーティングされた細胞培養プレートの準備。
- 破骨細胞分化のためのPBMCの使用。
- 標準的な実験室材料を用いた吸収ピットの視覚化。
- この方法を骨髄由来単球などの他の細胞タイプに適用すること。
主要な結果
- リン酸カルシウムコーティングにより効果的な吸収の視覚化が可能になります。
- PBMCはこの方法を用いて破骨細胞に成功裏に分化します。
- 様々な細胞タイプに対するプロトコルの適応性が実証されました。
- 結果はアッセイの信頼性と簡素化の向上を示しています。
結論
- 開発されたアッセイは破骨細胞活性の研究に有用なツールです。
- リン酸カルシウムコーティングにより細胞プロセスの視覚化が向上します。
- この方法は骨生物学におけるさらなる研究を促進する可能性があります。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Quantitative visualization of osteoclastic resorption is critical for target validation and mechanistic de-risking in bone disease research. This pit assay protocol enables standardized, reproducible measurement of osteoclast function, supporting predictive confidence in early discovery and preclinical workflows. The method's adaptability and quantitative outputs facilitate risk-adjusted portfolio decisions in bone biology and related therapeutic areas.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct interrogation of osteoclast-mediated bone resorption for functional target validation.
- Supports mechanistic de-risking by quantifying cellular responses to osteoclastogenic stimuli.
- Facilitates predictive confidence in pathway modulation relevant to bone disease models.
Screening & Assay Development
- Provides a standardized, reproducible platform for evaluating osteoclast activity across compounds or genetic perturbations.
- Delivers quantitative, image-based outputs suitable for assay development and optimization.
- Supports scalability and platform reuse by employing accessible materials and imaging tools.
Translational & Preclinical Research
- Aligns in vitro osteoclast function with disease-relevant bone resorption endpoints.
- Enables continuity from discovery through preclinical validation by supporting quantitative biomarker development.
- Reduces translational risk by providing robust, reproducible functional readouts.
Pipeline & Workflow Integration
This assay positions within the discovery-to-preclinical continuum, enabling hypothesis testing, lead identification, and translational validation for bone-targeted programs.
- Discovery Biology: Supports hypothesis-driven testing of osteoclast function and pathway engagement.
- Screening: Provides reproducible, quantitative readouts for compound or genetic screening.
- Analytics: Enables measurement of resorption pit area and osteoclast number using standardized image analysis.
- Translational Research: Bridges in vitro findings to preclinical bone resorption models when aligned with disease endpoints.
- Enterprise Reuse: Adaptable to multiple cell sources and scalable for broader portfolio applications.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in osteoclast biology.
- Operational Value: Standardizes assay setup and quantification for reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions and capital allocation by providing robust functional data.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of bone-targeted assets and mechanistic programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in cell culture, osteoclast differentiation, and quantitative image analysis.
- Needs access to fluorescence and brightfield imaging platforms and image analysis software (e.g., ImageJ).
- Demands cross-team standardization of assay setup and quantification protocols.
- Adaptable to various cell sources, including PBMCs, bone marrow monocytes, and Raw 264.7 cells.
- Uniformity of calcium phosphate coating and drying technique is critical for assay consistency.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:51
Calcification of 96-Well Cell Culture Plates
1:54
Isolation of Peripheral Blood Mononuclear Cells (PBMCs)
2:49
Expansion of Osteoclasts Progenitors and Induction of Osteoclastogenesis
4:19
Fluorescence Staining of Osteoclasts and Calcium Phosphate Coating
5:17
Results: Analysis of Mature Osteoclast Cultured on Calcium Phosphate Coated Wells
6:38
Conclusion
