Name: インビトロで破骨細胞再吸収を可視化および定量するためのシンプルなピットアッセイプロトコル (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-06-16T13:40:00.000+00:00
Duration: 7 min 3 s
Description: 学ぶ 破骨細胞再吸収アッセイの簡便なプロトコル。カルシウムリン酸塩被覆プレートを用いてPBMCからの破骨細胞分化と吸収ピットの可視化・定量を行う方法です。骨生物学研究に有用です。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

この研究は、中国奨学金評議会[CSC No. 201808440394]によって部分的に資金提供されました。W.C.はCSCから資金提供を受けた。

このプロトコルは、地元の倫理委員会(承認番号287/2020B02)によってレビューされ、承認されました。
リン酸カルシウム被覆細胞培養プレートの作製
<ol><li>カルシウム原液の調製(トリス緩衝液中で25 mM CaCl 2·2H2O、1.37 mM NaCl、15 mM MgCl2·6H2O)<ol>
<li>1.0 M トリス緩衝液を調製し、1 M HCl を使用して pH を 7.4 に調整します。</li>
		<li>マグネチックスターラー上にガラスビーカーを設置し、100mLの1.0Mトリス緩衝液を加える。</li>
		<li>0.368gのCaCl2・2H2O、8.0gのNaCl、0.305gのMgCl2・6H2Oの計量を行い、トリス緩衝液に1つずつ溶解する。</li>
		<li>1 M HClを使用してpHを7.4に調整し、室温で保存します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>リン酸塩原液の調製(11.H2O、トリス緩衝液中の42mMNaHCO3)<ol>
<li>マグネチックスターラー上にガラスビーカーを設置し、100mLの1.0Mトリス緩衝液を加える。</li>
		<li>Na2 HPO4· 0.158 gの重量を量る353 gのNaHCO3とH2Oをトリス緩衝液に1つずつ溶解させる。</li>
		<li>1 M HClを使用してpHを7.4に調整し、室温で保存します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>96ウェル細胞培養プレートの事前石灰化<ol>
<li>15 mLの1.0 M Tris緩衝液、7.5 mLのカルシウムストック(ステップ1.1.4)溶液、および7.5 mLのリン酸ストック溶液(ステップ1.2.3)を混合することによって、30 mLの作業溶液を調製する。溶液を0.2μmフィルターでろ過します。</li>
		<li>平底を有する96穴細胞培養プレートを作製した。300 μLのリン酸カルシウム溶液をピペット(ステップ1.3.1)を各ウェルに。プレートを蓋で覆い、プレートを37°Cで3日間インキュベートする。</li>
	</ol>
</li>
	<li>リン酸カルシウム溶液(2.25 mMNa2HPO4・2・2 mMH2O, 4 mM CaCl 2·2H 2 O, 0.14 M NaCl, 50 mM トリス塩基 (ddH 2O)<ol>
<li>磁気攪拌ビーズを備えたビーカー内の40mLの脱イオン水に2mLの1M HClを加え、0.016gのNa2HPO4·H2O、0.0295gのCaCl2・2H2O、0.409gのNaCl、および0.303gのトリス塩基を1つずつ。</li>
		<li>1 M HClを使用してpHを7.4に調整し、脱イオン水を加えて容量を50 mLに満たします。溶液を0.2μmフィルターでろ過します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>96穴細胞培養プレートの石灰化<ol>
<li>予め石灰化した96ウェル細胞培養プレートから予備石灰化溶液を吸引し、各ウェルに300μLのリン酸カルシウム溶液(ステップ1.4.2)を加える。プレートを蓋で覆い、37°Cで1日間インキュベートする。</li>
		<li>プレートを裏返して溶液を注ぎ、プレートをイオン交換水で3回徹底的に洗い流します。均一な表面を維持するために、ヘアドライヤーまたは圧縮CO2 またはN2 ガスを使用してプレートを直ちに乾燥させる。</li>
		<li>コーティングされたプレートをクリーンベンチでUV照射で1時間滅菌する。コーティングされたプレートをすぐに使用するか、プレートをパラフィルムで密封して室温で保管してください。</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. ヒト末梢血からのPBMCの単離
<ol><li>献血者から書面によるインフォームドコンセントを得た後、静脈から15mLの血液を採取する(倫理的投票:287/2020B02)。</li>
	<li>15mLの新鮮な血液を等量のPBSで希釈し、チューブを数回反転させるか、混合物をピペットに出し入れして混合する。</li>
	<li>チューブあたり15mLの密度勾配溶液(例えば、Ficoll、 材料表)を含む50mLの円錐管を調製する。チューブを傾け、30 mLの希釈血液サンプルを15 mLの密度勾配溶液の上に慎重に層状にします(希釈血液サンプル:密度勾配溶液、1:0.5-1比)。 注:サンプルを重ねるときは、密度勾配溶液を希釈血液サンプルと混合しないように注意してください。</li>
	<li>ブレーキなしのスイングバケットローターで20°Cで20分間、810 x g で遠心分離機。</li>
	<li>単核球細胞層(リンパ球、単球、および血小板)を相間において邪魔されずに残したまま上層を吸引する。</li>
	<li>単核球細胞層を新しい50mL円錐管に慎重に移す。</li>
	<li>チューブにPBSを充填し、混合し、遠心分離機を300 x g で20°Cで10分間使用します(この段階以降はブレーキを使用できます)。</li>
	<li>上澄み液を慎重に完全に取り除きます。細胞ペレットを50mLのPBSに再懸濁し、300 x g で20°Cで10分間遠心分離する。 上清を慎重に完全に取り除きます。</li>
	<li>血小板を除去するために、細胞ペレットを50mLのPBSに再懸濁し、200 x g で20°Cで10分間遠心分離する。 上清を慎重に完全に取り除きます。</li>
	<li>再懸濁細胞を細胞培養フラスコに移し、OC前駆細胞の増殖を行う。</li>
</ol>3. OC前駆細胞の拡大
<ol><li>20 ng/mL M-CSF を含む完全な α-MEM (FBS 10% FBS、1% Pen/Strep、1% アムホテリシン B) で PBMC を再懸濁します。PBMCを2.5 x 105セル/cm2の密度でシードする。通常、15〜20mLの淡血から単離された細胞は、1つの75cm2フラスコ(1.5〜2 x107細胞)に播種することができる。</li>
	<li>付着した細胞が所望のコンフルエントに達するまで、3日ごとに20ng/mL M-CSFを含む新鮮な完全α-MEMを細胞に供給する。典型的な収量は、細胞が95%コンフルエントである場合、1.5-2 x106 細胞/フラスコである。通常、拡張期間は6日間続きます。 注:前駆体の骨細胞形成能は、培養時間が長くなるにつれて低下する可能性があります。</li>
</ol>4. CaPコーティングプレートにおける骨細胞形成の誘導
<ol><li>細胞接着を容易にするために、CaP コーティングプレートを 50 μL の FBS と共に 37 °C のインキュベーター内で 1 時間インキュベートします。</li>
	<li>OC前駆体を剥離するには、フラスコをPBSで2回洗浄し、死細胞または非接着細胞を除去した。75cm2フラスコあたり4mLのトリプシン(材料表)を30分間加える。<ol>
<li>4 mL の完全α-MEM を加えて消化を止め、セルスクレーパーを使用して細胞を慎重に剥離し、細胞を 50 mL チューブに移します。</li>
		<li>ノイバウアーチャンバーまたは類似のものを用いて総細胞数を決定する。</li>
	</ol>
</li>
	<li>350 x gで7分間遠心分離することにより細胞をペレット化する。ペレットを20 ng/mL M-CSF および 20 ng/mL RANKL を含む十分な完全な α-MEM に再懸濁して、1 x106 cells/mL の濃度を得る。</li>
	<li>CaPコーティングされた96ウェルプレートおよびピペットからFBS溶液を吸引し、1ウェルあたり200μLの細胞懸濁液(2 x105 細胞/ウェル)を吸引する。</li>
	<li>OC前駆体を所望の期間、または実験計画に関連する所望の試薬と共にインキュベートする。通常、多数の大型および多核OCが6日後および再吸収ピットが形成されているときに観察され得る。3 日ごとに 20 ng/mL M-CSF および 20 ng/mL RANKL を含む新鮮な完全 α-MEM 培地で細胞を供給します。</li>
	<li>インキュベーションの最後に、PBSで細胞を2回洗浄し、4%パラホルムアルデヒドで10分間固定し、再びPBSで洗浄する。</li>
	<li>固定OCを蛍光染色に直接使用するか、4°Cで保存してください。</li>
</ol>5. OCおよびCaPコーティングの蛍光染色
<ol><li>固定した細胞を透過処理バッファー(PBS中の0.1% Triton)と共に5分間インキュベートする。</li>
	<li>アクチンフィラメントをPBS中のAlexaFluor 546標識ファロイジン溶液100 μLで30分間染色し、染色溶液を吸引する。100 μLのヘキスト33342染色液(PBS中10 μg/mL)を10分間加え、核を染色する。DAPI を使用することもできます。</li>
	<li>PBS中の10μMカルセイン100μLでCaPコーティングを10分間染色する。PBSで3回洗って画像を撮ります。</li>
	<li>蛍光イメージング後、同じプレートを用いて、フォン・コッサ染色により再吸収ピット面積を定量することができる。これを行うには、プレートを脱イオン水で2回洗ってください。</li>
</ol>6. 全吸収ピット面積の定量化
<ol><li>フォンコッサ染色でCaPコーティングを染色するには、ウェル底部のコーティングが茶色になるまで、ウェルあたり50μLの脱イオン水中で UV照射下で1時間インキュベートします。</li>
	<li>プレートをイオン交換水で3回洗い、明視野画像を撮影します。1.25倍の対物レンズなど、倍率の小さい対物レンズを使用すると、井戸全体を1つの画像に収めることができます。これにより、その後の画像解析が容易になります。井戸の全領域を捕捉するための代替方法を適用することができる。</li>
	<li>ImageJ でイメージファイルを開く: ファイル |オープン|画像|タイプ |8 ビット。[直線] を使用して、画像の右下隅にあるスケール ユニット を確認||の分析スケールを設定します。「既知の距離」ブランケットに長さを入力し、[ 長さの単位] に新しいスケール単位を入力して、[ グローバル] チェックボックスをオンにします。</li>
	<li>分析する測定パラメータのリスト: 分析|測定値を設定します。「測定値を設定」ウィンドウで、「面積」および「しきい値に制限」ボックスにチェック・マークを付けます。</li>
	<li>ピットの面積を測定する: 画像||を調整するしきい値。「しきい値」ウィンドウで、「 暗い背景」 にチェック・ボックスをオンにして、「 自動」をクリックします。ピットの領域が赤に変わります。「しきい値」ウィンドウを閉じ、「 |の分析」を選択します。測定します。結果ファイルを保存する: ファイル|名前を付けて保存します。</li>
</ol>7. OC数とサイズの定量化、および再吸収ピット面積の正規化
<ol><li>破骨細胞の蛍光画像をImageJで開き、スケール単位を確認します(ステップ6.3参照)。</li>
	<li>分析する測定パラメータのリスト: 分析|測定値を設定します。「測定値の設定」ウィンドウで、「 面積 」ボックスにチェック・マークを付けます。</li>
	<li>ROI マネージャとポリゴン選択を使用した OC の概要: |の分析ツールの|ROI マネージャー。ツールセットのポリゴン選択をクリックし、1つのOC(アクチンリングと≥3つの核を持つセル)の輪郭を描き、ROIマネージャウィンドウで [t]を追加 ]をクリックします。すべてのOCが含まれるまでアウトラインを繰り返します。</li>
	<li>OC の数とサイズを測定: ROI マネージャーですべての項目を選択し、[ 測定] をクリックします。結果ファイルを保存する: ファイル|名前を付けて保存します (図3E)。</li>
	<li>蛍光画像のピット面積を測定する。手順7.3で画像と相関する塗膜の蛍光画像を開き、スケール単位を確認します(手順6.3を参照)。<ol>
<li>分析する測定パラメータをリストします(ステップ6.4を参照)。 画像|の選択|を調整するしきい値。「しきい値」ウィンドウで、すべてのボックスのチェックを外し、「 自動」をクリックします。ピットの領域が赤に変わります。「 しきい値」 ウィンドウを閉じ、「 |の分析」を選択します。測定します。結果ファイルを保存します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>OC番号で正規化されたピット面積を計算します。</li>
</ol>

<ol><li>Jacome-Galarza, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+origin%2C+functional+maintenance+and+genetic+rescue+of+osteoclasts%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Developmental origin, functional maintenance and genetic rescue of osteoclasts.</a> Nature. 568 (7753), 541-545 (2019).</li>
<li>Moller, A. M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aging+and+menopause+reprogram+osteoclast+precursors+for+aggressive+bone+resorption%5BTitle%5D)+AND+%22Bone+Research%22%5BJournal%5D)">Aging and menopause reprogram osteoclast precursors for aggressive bone resorption.</a> Bone Research. 8 (1), 1-11 (2020).</li>
<li>Yokota, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+and+function+of+tumor+necrosis+factor+and+interleukin-6-induced+osteoclasts+in+rheumatoid+arthritis%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+Rheumatology%22%5BJournal%5D)">Characterization and function of tumor necrosis factor and interleukin-6-induced osteoclasts in rheumatoid arthritis.</a> Arthritis Rheumatology. 73 (7), 1145-1154 (2021).</li>
<li>Teng, Y. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+human+T-cell+immunity+and+osteoprotegerin+ligand+control+alveolar+bone+destruction+in+periodontal+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Functional human T-cell immunity and osteoprotegerin ligand control alveolar bone destruction in periodontal infection.</a> Journal of Clinical Investigation. 106 (6), 59-67 (2000).</li>
<li>Terpos, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Soluble+receptor+activator+of+nuclear+factor+kappaB+ligand-osteoprotegerin+ratio+predicts+survival+in+multiple+myeloma%3A+proposal+for+a+novel+prognostic+index%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Soluble receptor activator of nuclear factor kappaB ligand-osteoprotegerin ratio predicts survival in multiple myeloma: proposal for a novel prognostic index.</a> Blood. 102 (3), 1064-1069 (2003).</li>
<li>Morony, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteoprotegerin+inhibits+osteolysis+and+decreases+skeletal+tumor+burden+in+syngeneic+and+nude+mouse+models+of+experimental+bone+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Osteoprotegerin inhibits osteolysis and decreases skeletal tumor burden in syngeneic and nude mouse models of experimental bone metastasis.</a> Cancer Research. 61 (11), 4432-4436 (2001).</li>
<li>Sobacchi, C., Schulz, A., Coxon, F. P., Villa, A., Helfrich, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteopetrosis%3A+genetics%2C+treatment+and+new+insights+into+osteoclast+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Osteopetrosis: genetics, treatment and new insights into osteoclast function.</a> Nature Reviews Endocrinology. 9 (9), 522-536 (2013).</li>
<li>Amarasekara, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+osteoclast+differentiation+by+cytokine+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Immune+Network%22%5BJournal%5D)">Regulation of osteoclast differentiation by cytokine networks.</a> Immune Network. 18 (1), 8(2018).</li>
<li>Kim, J. M., Lin, C., Stavre, Z., Greenblatt, M. B., Shim, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteoblast-osteoclast+communication+and+bone+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Osteoblast-osteoclast communication and bone homeostasis.</a> Cells. 9 (9), (2020).</li>
<li>Teitelbaum, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bone+resorption+by+osteoclasts%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Bone resorption by osteoclasts.</a> Science. 289 (5484), 1504-1508 (2000).</li>
<li>Boyle, W. J., Simonet, W. S., Lacey, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteoclast+differentiation+and+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Osteoclast differentiation and activation.</a> Nature. 423 (6937), 337-342 (2003).</li>
<li>Baron, R., Neff, L., Louvard, D., Courtoy, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-mediated+extracellular+acidification+and+bone+resorption%3A+evidence+for+a+low+pH+in+resorbing+lacunae+and+localization+of+a+100-kD+lysosomal+membrane+protein+at+the+osteoclast+ruffled+border%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Cell-mediated extracellular acidification and bone resorption: evidence for a low pH in resorbing lacunae and localization of a 100-kD lysosomal membrane protein at the osteoclast ruffled border.</a> Journal of Cell Biology. 101 (6), 2210-2222 (1985).</li>
<li>Blair, H. C., Teitelbaum, S. L., Ghiselli, R., Gluck, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteoclastic+bone+resorption+by+a+polarized+vacuolar+proton+pump%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Osteoclastic bone resorption by a polarized vacuolar proton pump.</a> Science. 245 (4920), 855-857 (1989).</li>
<li>Zhu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteoclast-mediated+bone+resorption+is+controlled+by+a+compensatory+network+of+secreted+and+membrane-tethered+metalloproteinases%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Osteoclast-mediated bone resorption is controlled by a compensatory network of secreted and membrane-tethered metalloproteinases.</a> Science Translational Medicine. 12 (529), 6143(2020).</li>
<li>Gowen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cathepsin+K+knockout+mice+develop+osteopetrosis+due+to+a+deficit+in+matrix+degradation+but+not+demineralization%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Bone+and+Mineral+Research%22%5BJournal%5D)">Cathepsin K knockout mice develop osteopetrosis due to a deficit in matrix degradation but not demineralization.</a> The Journal of Bone and Mineral Research. 14 (10), 1654-1663 (1999).</li>
<li>Abu-Amer, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IL-4+abrogates+osteoclastogenesis+through+STAT6-dependent+inhibition+of+NF-kappaB%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">IL-4 abrogates osteoclastogenesis through STAT6-dependent inhibition of NF-kappaB.</a> Journal of Clinical Investigation. 107 (11), 1375-1385 (2001).</li>
<li>Patntirapong, S., Habibovic, P., Hauschka, P. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+soluble+cobalt+and+cobalt+incorporated+into+calcium+phosphate+layers+on+osteoclast+differentiation+and+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Effects of soluble cobalt and cobalt incorporated into calcium phosphate layers on osteoclast differentiation and activation.</a> Biomaterials. 30 (4), 548-555 (2009).</li>
<li>Sorensen, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+osteoclasts+derived+from+CD14%2B+monocytes+isolated+from+peripheral+blood%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Bone+and+Mineral+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Characterization of osteoclasts derived from CD14+ monocytes isolated from peripheral blood.</a> The Journal of Bone and Mineral Metabolism. 25 (1), 36-45 (2007).</li>
<li>Kumar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synergistic+effect+of+biphasic+calcium+phosphate+and+platelet-rich+fibrin+attenuate+markers+for+inflammation+and+osteoclast+differentiation+by+suppressing+NF-kappaB%2FMAPK+signaling+pathway+in+chronic+periodontitis%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules%22%5BJournal%5D)">Synergistic effect of biphasic calcium phosphate and platelet-rich fibrin attenuate markers for inflammation and osteoclast differentiation by suppressing NF-kappaB/MAPK signaling pathway in chronic periodontitis.</a> Molecules. 26 (21), 6578(2021).</li>
<li>Henriksen, K., Karsdal, M. A., Taylor, A., Tosh, D., Coxon, F. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+human+osteoclasts+from+peripheral+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Generation of human osteoclasts from peripheral blood.</a> Methods in Molecular Biology. 816, 159-175 (2012).</li>
<li>Maria, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reproducible+quantification+of+osteoclastic+activity%3A+characterization+of+a+biomimetic+calcium+phosphate+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Materials+Research+Part+B%3A+Applied+Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Reproducible quantification of osteoclastic activity: characterization of a biomimetic calcium phosphate assay.</a> Journal of Biomedical Materials Research Part B: Applied Biomaterials. 102 (5), 903-912 (2014).</li>
<li>Kong, L., Smith, W., Hao, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overview+of+RAW264.7+for+osteoclastogensis+study%3A+Phenotype+and+stimuli%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+and+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Overview of RAW264.7 for osteoclastogensis study: Phenotype and stimuli.</a> Journal of Cellular and Molecular Medicine. 23 (5), 3077-3087 (2019).</li>
<li>Li, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systemic+tumor+necrosis+factor+alpha+mediates+an+increase+in+peripheral+CD11bhigh+osteoclast+precursors+in+tumor+necrosis+factor+alpha-transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+%26+Rheumatology%22%5BJournal%5D)">Systemic tumor necrosis factor alpha mediates an increase in peripheral CD11bhigh osteoclast precursors in tumor necrosis factor alpha-transgenic mice.</a> Arthritis & Rheumatology. 50 (1), 265-276 (2004).</li>
<li>Arai, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Commitment+and+differentiation+of+osteoclast+precursor+cells+by+the+sequential+expression+of+c-Fms+and+receptor+activator+of+nuclear+factor+kappaB+%28RANK%29+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Commitment and differentiation of osteoclast precursor cells by the sequential expression of c-Fms and receptor activator of nuclear factor kappaB (RANK) receptors.</a> Journal of Experimental Medicine. 190 (12), 1741-1754 (1999).</li>
<li>Xing, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NF-kappaB+p50+and+p52+expression+is+not+required+for+RANK-expressing+osteoclast+progenitor+formation+but+is+essential+for+RANK-+and+cytokine-mediated+osteoclastogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Bone+and+Mineral+Research%22%5BJournal%5D)">NF-kappaB p50 and p52 expression is not required for RANK-expressing osteoclast progenitor formation but is essential for RANK- and cytokine-mediated osteoclastogenesis.</a> The Journal of Bone and Mineral Research. 17 (7), 1200-1210 (2002).</li>
<li>Miyamoto, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bifurcation+of+osteoclasts+and+dendritic+cells+from+common+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Bifurcation of osteoclasts and dendritic cells from common progenitors.</a> Blood. 98 (8), 2544-2554 (2001).</li>
</ol>

著者らは開示するものは何もありません。

ここでは、PBMCsから インビトロで 誘導および拡張されたOCsを用いた破骨細胞再吸収アッセイのための簡単で信頼性の高い方法を説明する。使用されるCaPコーティング細胞培養プレートは、ラボで利用可能な材料を使用して簡単に調製および視覚化することができます。このプロトコールで採用された未選別PBMCに加えて、マウス単球細胞21 および骨髄マクロファージ細胞17 から生成されたOCも、ピットアッセイのために同様の合成基質上で培養されており、したがって、これらの細胞源は、対応する文献を参照してこのアプローチに移動することができる。
このプロトコルでは、高価な市販のアッセイプレートの代わりに、ラボ内で作製された単純なCaPコーティングを使用しました。骨スライスと象牙質スライスは、再吸収ピットアッセイのための2つの一般的で手頃な価格の再吸収可能な材料ですが、入手可能性と複雑な調製は大きな欠点です。簡単に調製できる合成基材として、CaPコーティングは2つの元の材料よりも便利で容易...

<a href="https://app.jove.com/t/6601">This corrects</a> the article <a href="https://dx.doi.org/10.3791/64016">10.3791/64016</a>

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/64016">A Simple Pit Assay Protocol to Visualize and Quantify Osteoclastic Resorption In Vitro</a>. The Protocol section was&#160;updated.

Erratum: A Simple Pit Assay Protocol to Visualize and Quantify Osteoclastic Resorption In Vitro

破骨細胞(OC)は、造血幹細胞(HSC)に由来する組織特異的マクロファージであり、骨芽細胞1とともに骨リモデリングにおいて極めて重要な役割を果たしている。骨を全身的または局所的に破壊する性ホルモン誘発性、免疫学的、および悪性骨障害は、閉経関連骨粗鬆症2、関節リウマチ3、歯周病4、骨髄腫骨疾患5、および骨溶解性骨転移6を含む過剰な破骨活動によるものである。対照的に、OC形成および機能の欠陥もまた、骨ペトロシス7を引き起こし得る。HSCは、マクロファージコロニー刺激因子(M-CSF、遺伝子記号ACP5)刺激下でOC前駆細胞に分化する。M−CSFおよびNF−κBリガンドの受容体アクチベーター(RANKL、遺伝子記号TNFSF11)の両方の存在下で、OC前駆細胞はさらに単核OCに分化し、続いて融合して多核OC8、9、10になる。サイトカインM-CSFおよびRANKLはいずれも、カルシトニン受容体(CT)、核因子κBの受容体活性化剤(RANK)、プロトンポンプV-ATPase、塩化物チャネル7αサブユニット(CIC-7)、インテグリンβ3、酒石酸耐性酸性ホスファターゼ(TRAP、遺伝子記号ACP5)、リソソームシステインプロテアーゼカテプシンK(CTSK)、およびマトリックスメタロペプチダーゼ9(MMP9)などの破骨細胞形成マーカーの誘導に不可欠かつ十分である。活性化されたOCは、フリル状の境界11、12を有するアクチンリングの形成を介して骨表面上にシーリングゾーンを形成する。シーリングゾーン内では、OCはプロトンポンプV-ATPase12、13、MMP914、およびCTSK 15を介してプロトンを分泌することによって再吸収を媒介し、ラクナの形成につながる。
インビトロ実験の場合、OC前駆細胞は、マウスの大腿骨および脛骨16,17からの骨髄マクロファージの拡張、ならびに血液試料およびバフィーコート18,19,20からのヒト末梢血単核球(PBMC)の単離によって、または不死化マウス単球細胞RAW 264.7 21,22の分化によって得ることができる。
本プロトコールにおいて、我々は、初代PBMCに由来するOCsを用いたCaPコーティング細胞培養プレートにおける破骨細胞再吸収アッセイを記載する。ここで用いたCaP被覆細胞培養プレート法は、Patntirapongら17 およびMaria et al.21によって以前に記載された方法から採用され、洗練されている。OC前駆体を得るために、PBMCsを密度勾配遠心分離によって単離し、先に記載したように20に拡大する。

<table><tbody><tr><td>AgNO3</td><td>SERVA Electrophoresis GmbH</td><td>35110</td><td>硝酸銀</td></tr><tr><td>a-MEM</td><td>Gibco</td><td>32561-029</td><td>MEM α、GlutaMAX、ヌクレオシドなし</td></tr><tr><td>アムホテリシンB</td><td>バイオクロム</td><td>03-028-1B</td><td>アムホテリシン B 溶液</td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>21097-50G</td><td>塩化カルシウム二水和物</td></tr><tr><td>Calcein</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C0875</td><td>Calcein</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F7524</td><td>ウシ胎児血清</td></tr><tr><td>Ficoll</td><td>Cytiva</td><td>17144002</td><td>Ficoll Paque Plus</td></tr><tr><td>Fixation buffer</td><td>Biolegend</td><td>420801</td><td>パラホルムアルデヒド</td></tr><tr><td>HCl</td><td>Merk</td><td>1.09057.1000</td><td>塩酸</td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Promokine</td><td>PK-CA707-40046</td><td>Hoechst 33342</td></tr><tr><td>M-CSF</td><td>PeproTech</td><td>300-25</td><td>組換えヒト M-CSF</td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7791-18-6</td><td>塩化マグネシウム</td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>AppliChem GmbH</td><td>A2943,0250</td><td>二ナトリウムリン酸水素無水</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Merk</td><td>S7653-250G</td><td>塩化ナトリウム</td></tr><tr><td>NaHCO3</sub</td><td>>Merk</td><td>K15322429</td><td>ソーダ</td></tr><tr><td>PBS</td><td>ロンザ</td><td>17-512F</td>の重炭酸塩 <td>ダルベッコのリン酸塩緩衝生理食塩水(1X)、カルシウムとマグネシウムを含まないDBPS</td></tr><tr><td>ペン-連鎖球菌</td><td>ロンザ</td><td>DE17-602E</td><td>ペニシリン-ストレプトマイシン混合物</td></tr><tr><td>ファロイジン-アレクサフロー546</td><td>Invitrogen</td><td>A22283</td><td>アレクサフロー546ファロイジン</td></tr><tr><td>RANKL</td><td>PeproTech</td><td>310-01</td><td>組換えヒト sRANK リガンド (E.coli 由来)</td></tr> <tr><td>Tris</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>93362</td><td>Tris(ヒドロキシメチル)アミノメサン</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td>アルキルフェニル ポリエチレングリコール</td></tr><tr><td>TrypLE Express</td><td>Gibco</td><td></td><td>12605010 組換え細胞解離酵素</td></tr></tbody></table>

インビトロで破骨細胞再吸収を可視化および定量するためのシンプルなピットアッセイプロトコル

A Simple Pit Assay Protocol to Visualize and Quantify Osteoclastic Resorption In Vitro

成熟破骨細胞は、酸および酵素の分泌を介して骨を分解することができる多核細胞である。それらは様々な疾患(例えば、骨粗鬆症および骨癌)において重要な役割を果たし、したがって重要な研究対象である。 インビトロで、それらの活性は、再吸収ピットの形成によって分析することができる。このプロトコールでは、容易に可視化および定量化できるリン酸カルシウム(CaP)コーティング細胞培養プレートを用いた簡易ピットアッセイ法について記載する。ヒト末梢血単核球由来の破骨細胞前駆体(PBMC)を、破骨細胞形成刺激の存在下でコーティングプレート上で培養した。9日間のインキュベーション後、破骨細胞を固定し、蛍光イメージングのために染色し、一方、CaPコーティングをカルセインによって対比染色した。再吸収領域を定量化するために、プレート上のCaPコーティングを5%AgNO3 で染色し、明視野画像によって可視化した。再吸収ピット面積をImageJを用いて定量した。

細胞培養プレートの底部へのリン酸カルシウムコーティングを、3日間の事前石灰化工程と1日間の石灰化工程とを含む2つのコーティング工程で行った。 図1に示すように、96穴プレートの底部に均一に分布したリン酸カルシウムが得られた。このコーティングは、洗浄工程を行った後に底部に非常によく付着した。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64016/64016fig01.jpg"> 図1:96ウェル細胞培養プレート上のリン酸カルシウムコーティングの代表的な明視野画像。 コーティングは、3日間の事前石灰化工程と1日間の石灰化工程とを含む2つのコーティング工程で行った。スケール バーは 200 μm を表します。 <a href="https://www.jove.com/f...

ここでは、リン酸カルシウムコーティング細胞培養プレートを用いた再吸収ピットアッセイのための簡単で効果的なアッセイ手順を提示する。

Mature osteoclasts are multinucleated cells that can degrade bone through the secretion of acids and enzymes. They play a crucial role in various diseases ...

私たちのプロトコルは、破骨細胞再吸収アッセイのための簡単で信頼性の高い方法を説明しています。リン酸カルシウムコーティングされた細胞培養プレートの使用は、ラボで利用可能な材料を使用して容易に調製および視覚化することができる。不透明な骨や象牙質のスライスとは対照的に、リン酸カルシウムコーティングは、再吸収ピットと細胞を同時に視覚化することを可能にします。このプロトコルでは、破骨細胞の分化にPBMCを使用します。しかし、骨髄由来単球またはRaw 264.7細胞のような他の細胞型にも適用することができる。まず平底96ウェル細胞培養プレートと予め調製したリン酸カルシウム溶液300マイクロリットルのピペットを各ウェルに取り込む。その後、プレートを蓋で覆い、プレートを摂氏37度で3日間インキュベートする。3日後、予め石灰化した96ウェル細胞培養プレートから予備石灰化溶液を吸引し、各ウェルにリン酸カルシウム溶液300マイクロリットルを加える。プレートを蓋で覆い、摂氏37度で1日間インキュベートする。その後、プレートを反転させて溶液を注ぎ出し、プレートを脱イオン水で3回徹底的に洗浄します。ヘアドライヤーまたは圧縮二酸化炭素または窒素ガスを使用してプレートを直ちに乾燥させ、均一な表面を維持します。さて、クリーンベンチの上の塗装板に紫外線を1時間照射します。コーティングされたプレートをすぐに使用するか、パラフィルムでプレートを密封し、室温で保管してください。15ミリリットルの淡血を等量のPBSで希釈し、数回反転またはピペッティングして混合する。次いで、50ミリリットルの円錐形チューブに15ミリリットルの密度勾配溶液を採取し、チューブを傾け、15ミリリットルの密度勾配溶液上に30ミリリットルの希釈血液サンプルを慎重に重ねる。その後、チューブをスイングバケットローターで810倍Gで休憩なく20°Cで20分間遠心分離します。次いで、単核球層を界面に乱れずに残して上層を吸引する。単核球細胞層を新しい50ミリリットルの円錐管に慎重に移す。チューブをPBSで満たし、混合し、300倍Gで20°Cで10分間遠心分離する。PBMCsを1ミリリットル当たり20ナノグラムのマクロファージコロニー刺激因子を含む完全なα−MEMに再懸濁し、フラスコ内のPBMCsをセンチメートル平方あたり10〜5番目の細胞に2.5回播種する。リン酸カルシウムコーティングプレートを50マイクロリットルのウシ胎児血清とともに摂氏37度で1時間インキュベートする。次に、フラスコをPBSで2回洗浄して破骨細胞前駆体を死細胞または非接着細胞から剥離し、次いで75平方センチメートルフラスコ当たり4ミリリットルのトリプシンを加える。30分後、4ミリリットルの完全α-MEMを加えて消化を止め、細胞スクレーパーを用いて細胞を慎重に剥離する。細胞を50ミリリットルのチューブに移し、計数チャンバを用いて細胞の総数を計数した。チューブを350倍Gで7分間遠心分離して細胞をペレット化し、ペレットを蘇生させ、M-CSFおよびRANKLを含むアルファMEMを完成させて、1ミリリットルあたり10〜6個の細胞を1回得る。リン酸カルシウムコートプレートからウシ胎児血清を吸引し、1ウェルあたり200マイクロリットルの細胞懸濁液をピペットした。インキュベーション後、細胞をPBSで2回洗浄する。細胞を4%パラホルムアルデヒドで10分間固定し、PBSで再度洗浄する。染色のために、固定細胞に透過処理緩衝液を加え、それらを5分間インキュベートする。アクチンフィラメントを染色するには、細胞を100マイクロリットルのAlexa Fluor 546標識ファロイジン溶液と共にPBS中で30分間インキュベートし、次いで染色溶液を吸引し、100マイクロリットルのヘキストを用いて核を10分間染色する。リン酸カルシウムコーティングを100マイクロリットルの10マイクロモルカルセインおよびPBSで10分間染色する。PBSで3回洗浄した後、画像をキャプチャします。リン酸カルシウムコーティングのフォンコッサ染色のために、50マイクロリットルの5%硝酸銀および脱イオン水を各ウェルに加え、ウェルの底部のコーティングが茶色になるまでプレートを紫外線照射下で1時間インキュベートする。96ウェルプレートの底部にあるリン酸カルシウムコーティングは、均一でよく接着しているように見えた。リン酸カルシウムコーティングプレート上のM−CSFおよびRANKLでの9日間の培養後、破骨細胞前駆体は再吸収ピットおよび大きな破骨細胞を形成した。ピット内に位置する多核破骨細胞は、高いTRAPレベルを発現した。成熟破骨細胞は、3つ以上の核および別個のアクチン環の存在を示した。緑色のリン酸カルシウムコーティングは、黒い再吸収ピットの存在を示した。破骨細胞の数とサイズはROIマネージャーを使用して計算され、RANKLの非存在下で増殖した画像J.破骨細胞の前駆体の多角形選択ツールを使用して破骨細胞の数とサイズは再吸収ピットを形成できなかったが、M-CSFおよびRANKLは骨殻形成ピットの形成を促進した。画像J.を用いてピット面積を定量化し、塗布板を気流で直ちに乾燥させることで、均一なリン酸カルシウム被膜を作るのに役立つ。さもなければ、それは井戸の真ん中でより厚いコーティングを形成する傾向があります。

a-simple-pit-assay-protocol-to-visualize-quantify-osteoclastic

Research

JoVE Journal

Medicine

医学

このビデオでは、破骨細胞内のTRAP含有顆粒の存在を検出する酒石酸耐性酸性ホスファターゼ染色技術を実演しています。この技術は、破骨細胞の細胞質にマゼンタ色の色素顆粒沈着物を形成し、倒立顕微鏡で見えるようにします。...

酒石酸耐性酸性ホスファターゼ染色:TRAP酵素含有培養破骨細胞を検出するためのin vitro技術

このビデオでは、ヒト末梢血単核細胞由来破骨細胞で培養したリン酸カルシウムコーティング細胞培養プレート上のin...

Resorption Pit Assay:リン酸カルシウムコーティング培養プレートを使用して成熟破骨細胞のカルシウム吸収活性を定量化するIn Vitro技術

このビデオでは、アニオン性色素であるAlizarin Red...

In vitro石灰化アッセイ:Alizarin Red S染色および抽出による骨移植代替物上の骨芽細胞カルシウム沈着物を定量するための比色法

破骨細胞は、体内の主要な骨吸収細胞である。大量に破骨細胞を単離する能力は、破骨細胞の生物学の理解における大きな進歩をもたらした。このプロトコルでは、培養し、インビトロで破骨細胞活性を定量化する、単離するための方法を記載する。...

マウス骨髄からの破骨細胞の導出

本稿では、マウスの骨髄から破骨細胞形成の複雑な 1 ラパマイシンの哺乳類/機構のターゲットの役割を研究する分離と培養破骨細胞の in...

RANKL による破骨細胞文化アッセイのマウス骨髄破骨細胞形成における mTORC1 の役割を調査するには

ウランは、骨代謝に影響を与える知られています。ここでは、担当骨細胞破骨細胞の機能や分化、生存率に及ぼす天然ウランの影響の調査を目的としたプロトコルを提案する.

培養破骨細胞形成に天然ウランの影響を分析するための方法

この記事で分離し、マウス長管骨から骨髄間質細胞と造血幹細胞を区別する手法を提案します。2...

分離、カルチャ、および骨髄間質細胞とマウスから破骨細胞前駆細胞の分化

大きな骨病変を修復するために設計された、新しいバイオマテリアルの数は骨の治癒を高め、骨移植に関連する合併症を克服することを目的と継続的に拡大しています。骨修復のためのバイオマテリアルの前臨床生体適合性テストのための学際的な戦略を紹介します。...

骨再生のための生体材料の生物学的互換性プロファイル

破骨細胞は、造血幹細胞の単球-マクロファージ系統に由来する組織特異的なマクロファージ polykaryons...

ラット骨髄からの破骨細胞前駆体の分離・精製・分化

破骨細胞は、体内の重要な骨吸収細胞です。このプロトコルは、ヒト末梢血単球からの破骨細胞の in vitro...

機能性破骨細胞のヒト末梢血CD14+ 単球との鑑別

学ぶ 破骨細胞再吸収アッセイの簡便なプロトコル。カルシウムリン酸塩被覆プレートを用いてPBMCからの破骨細胞分化と吸収ピットの可視化・定量を行う方法です。骨生物学研究に有用です。

インビトロで破骨細胞再吸収を可視化および定量するためのシンプルなピットアッセイプロトコル

さらに動画を探す