Name: マウス骨髄造血幹・前駆細胞および間質ニッチ細胞のフローサイトメトリー解析 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-09-28T12:50:00.000+00:00
Duration: 8 min 34 s
Description: 学ぶマウス骨髄造血幹・前駆細胞と間質ニッチ細胞のフローサイトメトリー解析法。骨内膜と骨髄中心部の細胞を分離・染色し、造血微小環境の擾乱を研究するための重要なツールです。

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LMは、レディタタメモリアルトラストからの助成金によってサポートされました。JRは、Fundação para a Ciência e Tecnologia(FCT;FCTフェローシップUI / BD / 150833 / 2021)。MLは、FCTの博士号フェローシップ(FCTフェローシップ 2021.04773.BD)によってサポートされました。DDは、米国血液学会、パブラブ財団、FCT(EXPL/MED-ONC/0522/2021)、およびポルトガル血液学会からの助成金によって支援されました。i3sのTRACY施設のカタリーナ・メイレレス博士とエミリア・カルドーゾ博士の支援に感謝します。

<ol><li>Comazzetto, S., Shen, B., Morrison, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Niches+that+regulate+stem+cells+and+hematopoiesis+in+adult+bone+marrow%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Niches that regulate stem cells and hematopoiesis in adult bone marrow.</a> Developmental Cell. 56 (13), 1848-1860 (2021).</li>
<li>Purton, L. E., Scadden, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Limiting+factors+in+murine+hematopoietic+stem+cell+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Limiting factors in murine hematopoietic stem cell assays.</a> Cell Stem Cell. 1 (3), 263-270 (2007).</li>
<li>Kiel, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SLAM+family+receptors+distinguish+hematopoietic+stem+and+progenitor+cells+and+reveal+endothelial+niches+for+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">SLAM family receptors distinguish hematopoietic stem and progenitor cells and reveal endothelial niches for stem cells.</a> Cell. 121 (7), 1109-1121 (2005).</li>
<li>Asada, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+cytokine+contributions+of+perivascular+haematopoietic+stem+cell+niches%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Differential cytokine contributions of perivascular haematopoietic stem cell niches.</a> Nature Cell Biology. 19 (3), 214-223 (2017).</li>
<li>Mosteo, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dynamic+interface+between+the+bone+marrow+vascular+niche+and+hematopoietic+stem+cells+in+myeloid+malignancy%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">The dynamic interface between the bone marrow vascular niche and hematopoietic stem cells in myeloid malignancy.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 635189(2021).</li>
<li>Christodoulou, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live-animal+imaging+of+native+haematopoietic+stem+and+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Live-animal imaging of native haematopoietic stem and progenitor cells.</a> Nature. 578 (7794), 278-283 (2020).</li>
<li>Itkin, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+bone+marrow+blood+vessels+differentially+regulate+haematopoiesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Distinct bone marrow blood vessels differentially regulate haematopoiesis.</a> Nature. 532 (7599), 323-328 (2016).</li>
<li>Kusumbe, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-dependent+modulation+of+vascular+niches+for+haematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Age-dependent modulation of vascular niches for haematopoietic stem cells.</a> Nature. 532 (7599), 380-384 (2016).</li>
<li>Duarte, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+endosteal+vascular+niche+remodeling+rescues+hematopoietic+stem+cell+loss+in+AML%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Inhibition of endosteal vascular niche remodeling rescues hematopoietic stem cell loss in AML.</a> Cell Stem Cell. 22 (1), 64-77 (2018).</li>
<li>Busch, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fundamental+properties+of+unperturbed+haematopoiesis+from+stem+cells+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Fundamental properties of unperturbed haematopoiesis from stem cells in vivo.</a> Nature. 518 (7540), 542-546 (2015).</li>
<li>Laurenti, E., Gottgens, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+haematopoietic+stem+cells+to+complex+differentiation+landscapes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">From haematopoietic stem cells to complex differentiation landscapes.</a> Nature. 553 (7689), 418-426 (2018).</li>
<li>Pietras, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functionally+distinct+subsets+of+lineage-biased+multipotent+progenitors+control+blood+production+in+normal+and+regenerative+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Functionally distinct subsets of lineage-biased multipotent progenitors control blood production in normal and regenerative conditions.</a> Cell Stem Cell. 17 (1), 35-46 (2015).</li>
<li>Challen, G. A., Pietras, E. M., Wallscheid, N. C., Signer, R. A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simplified+murine+multipotent+progenitor+isolation+scheme%3A+Establishing+a+consensus+approach+for+multipotent+progenitor+identification%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Hematology%22%5BJournal%5D)">Simplified murine multipotent progenitor isolation scheme: Establishing a consensus approach for multipotent progenitor identification.</a> Experimental Hematology. 104, 55-63 (2021).</li>
<li>Mayle, A., Luo, M., Jeong, M., Goodell, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometry+analysis+of+murine+hematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Flow cytometry analysis of murine hematopoietic stem cells.</a> Cytometry A. 83 (1), 27-37 (2013).</li>
<li>Kusumbe, A. P., Ramasamy, S. K., Adams, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coupling+of+angiogenesis+and+osteogenesis+by+a+specific+vessel+subtype+in+bone%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Coupling of angiogenesis and osteogenesis by a specific vessel subtype in bone.</a> Nature. 507 (7492), 323-328 (2014).</li>
<li>Hawkins, E. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+lymphocyte+proliferation%2C+survival+and+differentiation+using+CFSE+time-series+data%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Measuring lymphocyte proliferation, survival and differentiation using CFSE time-series data.</a> Nature Protocols. 2 (9), 2057-2067 (2007).</li>
<li>Akinduro, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proliferation+dynamics+of+acute+myeloid+leukaemia+and+haematopoietic+progenitors+competing+for+bone+marrow+space%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Proliferation dynamics of acute myeloid leukaemia and haematopoietic progenitors competing for bone marrow space.</a> Nature Communications. 9 (1), 519(2018).</li>
<li>Beerman, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functionally+distinct+hematopoietic+stem+cells+modulate+hematopoietic+lineage+potential+during+aging+by+a+mechanism+of+clonal+expansion%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Functionally distinct hematopoietic stem cells modulate hematopoietic lineage potential during aging by a mechanism of clonal expansion.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (12), 5465-5470 (2010).</li>
<li>Gomariz, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+spatial+analysis+of+haematopoiesis-regulating+stromal+cells+in+the+bone+marrow+microenvironment+by+3D+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Quantitative spatial analysis of haematopoiesis-regulating stromal cells in the bone marrow microenvironment by 3D microscopy.</a> Nature Communications. 9 (1), 2532(2018).</li>
<li>Xu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cell+factor+is+selectively+secreted+by+arterial+endothelial+cells+in+bone+marrow%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Stem cell factor is selectively secreted by arterial endothelial cells in bone marrow.</a> Nature Communications. 9 (1), 2449(2018).</li>
<li>Amend, S. R., Valkenburg, K. C., Pienta, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Murine+hind+limb+long+bone+dissection+and+bone+marrow+isolation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Murine hind limb long bone dissection and bone marrow isolation.</a> Journal of Visualized Experiments. (110), e53936(2016).</li>
<li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ephrin-B2+controls+VEGF-induced+angiogenesis+and+lymphangiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Ephrin-B2 controls VEGF-induced angiogenesis and lymphangiogenesis.</a> Nature. 465 (7297), 483-486 (2010).</li>
<li>DeFalco, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Virus-assisted+mapping+of+neural+inputs+to+a+feeding+center+in+the+hypothalamus%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Virus-assisted mapping of neural inputs to a feeding center in the hypothalamus.</a> Science. 291 (5513), 2608-2613 (2001).</li>
<li>Boyer, S. W., Schroeder, A. V., Smith-Berdan, S., Forsberg, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((All+hematopoietic+cells+develop+from+hematopoietic+stem+cells+through+Flk2%2FFlt3-positive+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">All hematopoietic cells develop from hematopoietic stem cells through Flk2/Flt3-positive progenitor cells.</a> Cell Stem Cell. 9 (1), 64-73 (2011).</li>
<li>Siegemund, S., Shepherd, J., Xiao, C., Sauer, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((hCD2-iCre+and+Vav-iCre+mediated+gene+recombination+patterns+in+murine+hematopoietic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">hCD2-iCre and Vav-iCre mediated gene recombination patterns in murine hematopoietic cells.</a> PLoS One. 10 (4), 0124661(2015).</li>
</ol>

著者は、開示すべき利益相反はありません。

説明されているプロトコルはシンプルで簡単に実行できますが、特定の手順には特別な注意を払う必要があります。例えば、フラッシュされたBMを得る場合(ステップ5.2)、PBS 2%FBSを骨の中央部の内側に通すために示された量または回数は、内膜細胞集団によるフラッシュされたサンプルの重大な汚染をもたらす可能性があるため、超えてはなりません。
治験責任医師による実行を容易にするために、プロトコルを変更することができます。サンプル抽出(セクション2)では、脚や骨をPBS 2% FBSに4°Cで最大24時間保存してから、サンプルの処理と分析に進むことができます。ただし、この時間は可能な限り最小限に抑える必要があります。HSCの一次染色カクテル(ステップ3.10)および二次染色カクテル(ステップ3.11)とのインキュベーション中、RTで15分間のインキュベーションが示されますが、これを4°Cで30分間のインキュベーションと交換できます。
同じことが、間質一次染色カクテルとのインキュベーション(ステップ4.7)、間質二次染色溶液(ステップ4....

フローサイトメトリーは、免疫細胞および造血細胞の特性評価と前向き単離のための非常に貴重な方法です。また、さまざまな組織の間質および上皮集団の分析にもますます使用されています。造血幹細胞(HSC)は、自己複製と多能性というユニークな特性を持っています。成体哺乳類では、HSCは主に骨髄(BM)に存在し、周囲の微小環境またはニッチから静止および生存シグナルを受け取ります1。HSCは、機能アッセイ2に従って正式に定義されます。それにもかかわらず、いくつかの画期的な論文は、HSCを特定するためのフローサイトメトリーの有用性を示しています。限られた細胞表面マーカーを使用することにより、造血幹細胞が高度に濃縮されている造血集団を識別することが可能です3。したがって、フローサイトメトリーは幹細胞分野の中心的な方法です。これは、HSCに対する推定ニッチ細胞タイプおよびニッチ因子の影響を評価するために広く使用されています。フローサイトメトリーとイメージングおよび機能アッセイを組み合わせることにより、造血幹細胞が血管周囲間葉系幹細胞(MSC)および内皮細胞(EC)によって決定的にサポートされていることが示されています。BM MSCは異種グループであり、サイトカインの寄与が異なりますが4、レプチン受容体(LepR)+ MSCが重要なニッチ細胞であることは十分に確立されています1。BM ECも非常に不均一であり、正弦波、細動脈、およびH型/移行血管の一部である可能性があります5。さまざまな研究により、これらのさまざまなECの微妙な貢献が示されています。例えば、内膜正弦波ECは空間的に静止HSC6に近く、活性酸素種レベルが低い非移動性HSCは細動脈EC7の近くに位置しています。ニッチの内膜と中央の位置も非常に重要です。骨内膜H型血管は、加齢とともに失われる血管周囲間質細胞と関連しており、HSCの喪失につながります8。急性骨髄性白血病では、中枢ECが拡張し、内膜血管と内膜HSCが失われます9。
この分野のほとんどの研究は、造血自体と細胞のHSCの外因性調節に焦点を当てています。しかし、他の前駆細胞を調節するニッチ、すなわち多能性前駆細胞(MPP)をよりよく特徴付ける必要があることが、特にそれらが定常状態での造血の主な推進力であることを考慮すると、ますます認識されています10。固定された階層構造とは対照的に、最近の研究では、造血は、造血幹細胞が初期段階で偏ったMPPに分化する連続体であることが示されています11。MPPは異なる分類スキーム12にちなんで名付けられているが、国際実験血液学会(ISEH)による最近のコンセンサス論文は、MPPを初期のMPPとして、リンパ系(MPP-Ly)、巨核球および赤血球(MPP-Mk/E)、および骨髄系(MPP-G/M)バイアス13に従って識別することを提案した。フローサイトメトリーの使用は、これらの集団の調節におけるBMニッチの重要性をさらに研究する上で重要です。現在のフローサイトメトリー法では、可変ゲーティング戦略を使用してHSPCを区別し、一貫性のないマーカーを使用して間質細胞、つまりECを同定します。現在の方法の目標は、HSPC亜集団、ECの不均一なグループ、およびLepR+ MSCを同定するためのBM染色のシンプルで再現性のあるワークフローを提示することです。この手法は、以前に報告された方法(たとえば、参考文献14を参照)に匹敵するものの、2つの機能的骨髄領域、内膜および中枢BM 8,15、およびBM間質ニッチ細胞の表現型分析のための更新された実装が容易なプロトコルを提供すると考えています。

<table><tbody><tr><td>Alexa Fluor 647 抗マウス CD54/ICAM-1 抗体</td><td>BioLegend</td><td>116114</td><td></td></tr><tr><td>APC ストレプトアビジン</td><td>BioLegend</td><td>405207</td><td></td></tr><tr><td>APC/Cyanine7 抗マウス CD117 (c-kit) 抗体</td><td>BioLegend</td><td>105826</td><td></td></tr><tr><td>APC/Cyanine7 抗マウス CD45 抗体</td><td>BioLegend</td><td>103116</td><td></td></tr><tr><td>APC/Cyanine7 抗マウス TER-119/赤血球抗体</td><td>BioLegend</td><td>116223</td><td></td></tr><tr><td>ビオチン抗マウスCD3&epsilon; 抗体</td><td>BioLegend</td><td>100304</td><td></td></tr><tr><td>ビオチン抗マウスCD4抗体</td><td>BioLegend</td><td>100404</td><td></td></tr><tr><td>ビオチン抗マウスCD8a抗体</td><td>BioLegend</td><td>100704</td><td></td></tr><tr><td>ビオチン抗マウスLy-6G/Ly-6C(Gr-1)抗体</td><td>BioLegend</td><td>108404</td><td></td></tr><tr><td>ビオチン抗マウスTER-119/赤血球抗体</td><td>BioLegend</td><td>116204</td><td></td></tr><tr><td>ビオチン抗マウス/ヒトCD11b抗体</td><td>BioLegend</td><td>101204</td><td></td></tr><tr><td>ビオチン抗マウス/ヒトCD45R/B220抗体</td><td>BioLegend</td><td>103204</td><td></td></tr><tr><td>Brilliant Violet 510 抗マウスCD150(SLAM)抗体</td><td>BioLegend</td><td>115929</td><td></td></tr><tr><td>Calibrite 2 Color Beads</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td>349502</tr><tr><td>コラゲナーゼ IV</td><td>メルク ライフサイエンス</td><td>C1889</td><td></td></tr><tr><td>ディスパーゼ II</td><td>メルク ライフサイエンス</td><td>D4693</td><td></td></tr><tr><td>ウシ胎児血清、認定済み、熱不活化、EU 承認済み、南米原産</td><td>サーモフィッシャー サイエンティフィ</td>ック <td>10500064</td><td></td></tr><tr><td>ハンクス平衡塩溶液 (HBSS)</td><td>サーモフィッシャー サイエンティフィ</td>ック <td>14175095</td><td></td></tr><tr><td>マウスレプチンRビオチン化抗体</td><td>R&D systems</td><td>BAF497</td><td></td></tr><tr><td>NucBlue Fixed Cell Reagent (DAPI)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>R37606</td><td>DAPI reagent</td></tr><tr><td>PE anti-mouse endomucin antibody</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>12-5851-82</td><td></td></tr><tr><td>PE anti-mouse Flk2 (CD135)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>12-1351-82</td><td></td></tr><tr><td>PE/Cyanine7 anti-mouse CD31 antibody</td><td>BioLegend</td><td>102524</td><td></td></tr><tr><td>PE/Cyanine7 抗マウス CD48 抗体</td><td>BioLegend</td><td>103424</td><td></td></tr><tr><td>PerCP 抗マウス Ly-6A/E (Sca-1) 抗体</td><td>BioLegend</td><td>108122</td><td></td></tr><tr><td>リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) 錠剤</td><td>メルク ライフサイエンス</td><td>P4417</td><td></td></tr><tr><td>精製抗マウス CD16/32 抗体</td><td>BioLegend</td><td>101302</td><td></td></tr><tr><td>RBC 溶解バッファー 10x</td><td>BioLegend</td><td>420302</td><td></td></tr><tr><td>ゾンビバイオレット フィックスブル バイアビリティ ダイ</td><td>バイオレジェンド</td><td>423114</td><td>蛍光染料</td></tr></tbody></table>

マウス骨髄造血幹・前駆細胞および間質ニッチ細胞のフローサイトメトリー解析

Flow Cytometry Analysis of Murine Bone Marrow Hematopoietic Stem and Progenitor Cells and Stromal Niche Cells

骨髄(BM)は、新しい血球が生成されるプロセスである造血が主に発生する骨内にある軟組織です。そのため、造血幹および前駆細胞(HSPC)と、HSPCの維持と調節に寄与する間質細胞が含まれています。 血液学的およびその他のBM障害は、造血細胞に直接および/またはBMニッチの変化を介して影響を与えることにより、造血を破壊します。ここでは、フローサイトメトリーによるマウスBM HSPCと間質ニッチ集団の表現型解析を通じて、健康と悪性腫瘍における造血を研究する方法について説明します。私たちの方法は、内膜および中枢BM画分でBM細胞を濃縮するために必要なステップ、およびHSPC調節に関与する2つの主要なニッチ細胞タイプ、内皮細胞および間葉系幹細胞を特定するための適切なゲーティング戦略を詳述しています。ここで提案される表現型解析は、マウス変異体、疾患モデル、および機能アッセイと組み合わせて、HSPCコンパートメントおよびそのニッチを特徴付けることができる。

健康な若年成人C57Bl/6マウスにおけるHSCおよびMPPのフローサイトメトリー分析の代表的なプロットを 図1に示します。ゲーティング戦略は、ISEH13によって提案された最新の調和命名法に従います。感染やがんなどの摂動の影響を解析する場合、正常ゲートの基準としてコントロールマウスを使用することが重要です。蛍光マイナス1(FMO)コントロールは、ゲートの境界を描写するのに特に有用であり得るが、FMOに基づいて盲目的にゲート制限を設定すると、標的細胞が省略されたり、非標的細胞が含まれる場合があることに留意すべきである。例えば、CD48セットの強度が低いほど、静止長期HSC17に対する濃縮度が高くなる。さらに、特定の集団の異なる特性は、特定のマーカーの強度に依存する。例えば、より高いCD150レベルを発現するHSCは、より骨髄偏り18である。
合計4匹の動物に適用した造血細胞集団の解...

ここでは、マウス骨髄細胞を表現型造血幹および前駆細胞に単離および染色するための簡単なプロトコルと、支持するニッチ内皮および間葉系幹細胞について説明します。内膜および中枢骨髄領域に位置する細胞を濃縮する方法も含まれる。

The bone marrow (BM) is the soft tissue found within bones where hematopoiesis, the process by which new blood cells are generated, primarily occurs. As ...

記載されたプロトコルは、骨髄造血幹および前駆細胞ならびに骨髄間質細胞の表現型分析を可能にする。さまざまな環境でこれらの集団への摂動を研究するために使用できます。他の前述の方法と比較して、この技術は、造血細胞、特に2つの機能的骨髄領域、内膜および中枢骨髄、ならびに骨髄間質細胞の表現型分析を可能にする。まず、腹を上にして安楽死させた動物をペトリ皿に置き、70%エタノールをスプレーします。はさみを使用して腹部の上に切り込みを入れ、皮膚を足首まで引き離します。片方の足をつかみ、その底を切ってハサミを使って動物から切り離します。次に、足首を切って脚から足を外し、氷冷PBS 2%FBSに脚を置きます。次に、ピンセットを使用して腰の骨をつかみ、その後ろを切り、ハサミを使用して動物から分離します。股関節の骨を氷冷PBS 2%FBSに入れます。脚と腰の骨をペトリ皿に入れた後、滅菌メスを使用して骨をきれいにします。次に、メスで膝を切って脛骨と大腿骨を分離し、きれいな骨を氷冷PBS 2%FBSに入れます。大腿骨または脛骨を氷冷PBS 2%FBSで乳鉢に入れ、乳棒を使用して乳鉢の壁にそっと押し付けて骨を押しつぶします。次に、得られた細胞懸濁液を10ミリリットルのピペットを用いて上下にピペットで固定し、ホモジナイズし、チューブの上部に載置した40マイクロメートルのセルストレーナーを通して50ミリリットルのチューブに移した。さらにPBS 2%FBSで乳鉢をすすぎ、同じ50マイクロメートルのセルストレーナーを通して同じ40ミリリットルのチューブに溶液を移します。50ミリリットルのチューブを500 Gで摂氏4度で5分間遠心分離します。上清を捨てた後、数回上下にピペッティングして室温で5ミリリットルのRBC溶解バッファーに細胞ペレットを再懸濁する。室温で2分間インキュベートした後、15ミリリットルのPBS 2%FBSを添加し、50ミリリットルのチューブを遠心分離します。細胞ペレットが赤みを帯びていないように見える場合は、上清を廃棄し、ペレットを200マイクロリットルのPBS 2%FBSに再懸濁し、細胞懸濁液を96ウェルV底板のウェルに移して染色します。前に示したように骨を粉砕した後、はさみを使用してP1000ピペットの先端を切り取り、それを使用して乳鉢のすべての内容物を50ミリリットルのチューブに移します。次に、50ミリリットルのチューブを500 Gで摂氏4度で5分間遠心分離します。上清を捨てた後、ペレットを3ミリリットルのコラゲナーゼIVおよびこのディスパーゼII溶液に再懸濁する。チューブを摂氏37度で40分間インキュベートします。チューブをPBS 2%FBSで25ミリリットルに補充し、ボルテックスを加えて混合します。次に、内容物を100マイクロメートルのセルストレーナーを通して新しい50ミリリットルのチューブに移します。次に、古い50ミリリットルのチューブに15ミリリットルのPBS 2%FBSを追加し、100マイクロメートルのセルストレーナーを介して溶液を新しい50ミリリットルのチューブに移します。遠心分離後、上清を廃棄し、ピペットで数回上下にピペッティングすることにより、細胞ペレットを5ミリリットルのRBC溶解バッファーに再懸濁します。室温で2分間インキュベートした後、15ミリリットルのPBS 2%FBSを加える。ここでも、チューブを遠心分離し、上清を廃棄した後に細胞ペレットが赤みを帯びていないように見える場合は、ペレットを200マイクロリットルのPBS 2%FBSに再懸濁し、細胞懸濁液を染色のために96ウェルV底板のウェルに移します。次に、プレートを500 Gで摂氏4度で3分間遠心分離します。大腿骨をペトリ皿の上に置き、滅菌メスを使用して骨の端を切ります。次に、100マイクロリットルのPBS 2%FBSを、死虫のない0.5ミリリットルのインスリンシリンジを使用して骨の内側に両側から1回通過させ、1ミリリットルのPBS 2%FBSを含むマイクロ遠心チューブに溶液を回収することにより、骨の中央部を洗い流します。続いて、細胞懸濁液を、4ミリリットルのPBS 2%FBSを含むフラッシュ骨髄とラベル付けされた50ミリリットルのチューブに移す。乳棒を使用して乳鉢の壁にそっと押し付けて、氷冷PBS 2%FBSで乳鉢で骨の端を押しつぶします。細胞懸濁液が均質化されたら、40マイクロメートルの細胞ストレーナーを通して骨髄の破砕物とラベル付けされた50ミリリットルのチューブに移します。最後に、さらにPBS 2%FBSで乳鉢をすすぎ、溶液を同じチューブに移します。造血幹細胞および多能性前駆細胞のフローサイトメトリー解析を、健康な若年成人C57BL6Jマウスの全骨髄において行った。全骨髄中の間質細胞、内皮細胞、間葉系幹細胞の解析では、レプチン受容体の発現に基づいて間葉系幹細胞を容易に同定することができ、CD31およびSCA-1の発現に基づいて内皮細胞を同定することができる。ICAM1に基づく細動脈内皮細胞と類洞内皮細胞の識別を示す全骨髄中の内皮細胞のフローサイトメトリー分析。中枢および内皮骨髄組織における動脈および類洞骨髄内皮細胞の定量化は、動脈骨髄内皮細胞が内膜領域でより豊富であるのに対し、類洞は中枢骨髄領域でより頻繁であることを示しています。紅潮した骨髄を得るとき、PBS 2%FBSを骨の中央部の内側に通すために示された量または回数を超えてはならない。記載された方法を表現型的に分析された細胞集団の機能的アッセイと組み合わせることは、研究された条件下で起こるこれらの集団への潜在的な摂動についてのさらなる貴重な情報を提供するであろう。記載されたプロトコルは、内膜および中枢骨髄における造血細胞の表現型分析を可能にし、研究者がこれらの骨髄位置で特異的に発生する可能性のある造血への摂動を調査することを可能にする。

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生物学

フローサイトメトリーにおける骨髄造血前駆細胞の分布と同様に効率的に分離するために高度に精製された造血幹細胞（HSC）を分析する方法が記載されている。アイソレーション·プロシージャは、本質的には、c-Kit...

マウス造血幹細胞およびリネージュコミット前駆細胞の表現型の解析と分離

骨髄の組織学的データを定量的に分析する戦略が提示されます。組織切片中の蛍光標識細胞の共焦点顕微鏡検査により、2次元画像が得られ、自動的に解析されます。異なる細胞タイプの共局在解析をシミュレーション画像からのデータと比較し、細胞相互作用に関する定量的な情報を提供します。...

造血細胞の自動定量化 - 脱灰骨の組織学的画像における間質細胞の相互作用

識別し、並べ替え (MAC および FACS) 蛍光と磁気の組み合わせを使ってマウスの骨髄から骨髄前駆細胞の 6 のサブセットを分離する方法を示します。このプロトコルは、体外培養の試金 (セルロースまたは液体文化)、養子の転送実験生体内RNA ・...

寡能性と系列拘束されたマウスの骨髄から骨髄前駆細胞の分離と同定

急性骨髄性白血病(AML)のマウスモデルから、マウスの健康な造血幹細胞および前駆細胞(HSPC)におけるミトコンドリア活性酸素種(ROS)を検出するために多パラメータフローサイトメトリーを用いる方法について説明する。MLL-AF9.

マウス造血幹細胞および前駆細胞およびMLL-AF9駆動白血病におけるミトコンドリア活性酸素種のフローサイトメトリック解析

ここでは、好中球系統細胞の高次元質量細胞法(Time-Of-Flight、CyTOFによるサイトメトリー)分析のために、マウスまたはヒトから単離された新鮮な骨髄(BM)を処理するプロトコルを提示する。...

好中球系統細胞の質量細胞法解析に対する全骨髄の調製

ここでは、フローサイトメトリーによる腹膜、脾臓、および骨髄組織におけるマウス免疫B細胞区画の不均一性の単純な分析について説明する。プロトコルは、他のマウス組織に適応し、拡張することができます。...

マウスB細胞の発達におけるフロー細胞量測定

ここでは、初期バースト形成ユニット赤血球(BFU-e)およびコロニー形成ユニット赤血球(CFU-e)前駆細胞を新鮮なマウス骨髄および脾臓から直接前向きに単離するための新しいフローサイトメトリー法について説明します。単一細胞トランスクリプトームデータに基づいて開発されたこのプロトコルは、組織のすべての赤血球前駆細胞を高純度で分離した最初のプロトコルです。...

フローサイトメトリーによるマウス組織からのバースト形成ユニットおよびコロニー形成ユニット赤血球前駆細胞の同定と単離(英語)

ここでは、細胞分裂の数、表面細胞の表現型、および細胞の親族関係を同時に測定できるフローサイトメトリーベースの技術を紹介します。これらのプロパティは、順列ベースのフレームワークを使用して統計的にテストできます。...

フローサイトメトリー による 造血幹細胞と前駆細胞の血縁関係、分裂数、表現型の同時評価

ここでは、骨髄異形成症候群および急性骨髄性白血病のマウスモデルから骨髄微小環境集団を分離および特徴付けるための詳細なプロトコルが提示されます。この技術は、疾患の進行に伴う内皮細胞や間葉系間質細胞を含む非造血骨髄ニッチの変化を特定します。...

骨髄異形成症候群および急性骨髄性白血病における骨髄微小環境集団の同定

ここでは、マウスの骨、骨髄、胸腺、およびヒト胸腺組織から間質細胞を単離することを可能にするプロトコルを紹介します。...

造血器官からの間質細胞の単離

本プロトコルは、マウス由来の非常に均質な骨髄間葉系幹細胞(BMSC)を精製、増殖、および特徴付けるための費用対効果の高い方法を説明しています。このアプローチにより、高い増殖と分化の可能性のある大量のBMSCの取得が容易になり、マウスモデルをサポートし、前臨床研究を前進させることができます。...

マウス由来骨髄間葉系幹細胞の精製、増殖、およびフローサイトメトリーに基づく表現型解析

学ぶマウス骨髄造血幹・前駆細胞と間質ニッチ細胞のフローサイトメトリー解析法。骨内膜と骨髄中心部の細胞を分離・染色し、造血微小環境の擾乱を研究するための重要なツールです。

マウス骨髄造血幹・前駆細胞および間質ニッチ細胞のフローサイトメトリー解析

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