セルのパラフィン包埋ブロックの免疫細胞化学による培養細胞の蛋白質発現レベルの定量

この手順の全体的な目標は、トロンボプラスチン-形質細胞ブロック包埋組織塊の免疫細胞化学的および組織学的分析により、目的の増殖マーカーの発現を分析することです。この方法は、組織による細胞ブロッキングの臨床病理に関する重要な質問に答えるのに役立ちます。パラフィン包埋細胞ブロックの免疫細胞化学的分析のためのこの代替法の主な利点は、手順の技術的な単純さです。

100 mmのHeLa細胞培養ディッシュがコンフルエントに達したら、上清を10 mmLのFBSなしのHeLa細胞培養培地に交換し、ディッシュを細胞培養インキュベーターに戻します。48時間後、2ミリリットルのPBSで細胞を洗浄し、続いて0.25%EDTAとトリプシンの2ミリリットルで摂氏37度と5%二酸化炭素で2〜3分間インキュベートします。細胞が分離したら、5ミリリットルの完全培地で反応を停止し、細胞溶液を15ミリリットルの円錐管に移します。

遠心分離により細胞を回収し、その後、洗浄ごとに2ミリリットルの冷たいPBSで2回の洗浄を行います。2回目の洗浄後、上清を1ミリリットルの95%エタノールと交換し、ペレットをボルテックスして混合します。次に、固定セルを氷の上に置きます。

パラフィン細胞ブロックを調製するには、健康なドナーの血液からEDTA血漿を採取した後、サンプルを遠心分離し、200〜400マイクロリットルの上清血漿アリコートを個々のマイクロチューブに移します。次に、約200マイクロリットルの血漿、約200マイクロリットルのトロンボプラスチン、および約200マイクロリットルの025モル塩化カルシウムを固定HeLa細胞に加えます。混合物を室温で10分間細胞塊を形成するのを待ってから、1ミリリットルのPBSで血栓を2回洗浄し、2回目の洗浄後にホルマリン湿らせた濾紙の個々の部分に血栓を完全にデカントします。

血栓を濾紙で包み、ピンセットを使用して、ホルマリンを湿らせた他の4枚の紙の中央にある個々の組織カセットに布を置きます。次に、ティッシュカセットを50ミリリットルの緩衝ホルマリンが入ったガラス瓶に入れ、摂氏4度でホルマリンを一晩固定します。翌朝、カセットをティッシュプロセッサーにロードして、一晩で水分を除去し、細胞を固定します。

処理手順が終了する少なくとも1時間前に、パラフィンを溶かすために加熱された包埋ステーションをオンにします。包埋ステーションと血栓の準備ができたら、金型に溶融パラフィンが存在することを確認し、形成された細胞塊をパラフィンに移します。蓋のない新しいティッシュカセットを金型に入れ、カセットをさらに溶融パラフィンで覆います。

パラフィンをコールドプレートで30〜60秒間固化させます。次に、ティッシュカセットを金型から分離します。免疫細胞化学分析用の切片を調製するには、細胞塊を1つのパラフィン細胞ブロックに位置させ、ミクロトームを使用してブロックを3〜4マイクロメートルの厚さのスライスに切断します。

パラフィン切片を生理食塩水でコーティングされたスライドガラスに置き、スライドを摂氏37度のオーブンに30分間入れます。切片がスライドに付着したら、スライドを15ミリリットルのキシレンで4分間脱パラフィンし、続いて2分間連続した下降エタノールインキュベーションで切片を脱水します。80%エタノールインキュベーション後、切片を流水で10分間すすぎ、40ミリリットルのトリス-EDTA回収バッファーが入ったジャーでスライドを30分間煮沸します。

インキュベーションの最後に、回収した抗原スライドを流水で洗浄し、続いて95%エタノールで摂氏4度で10分間インキュベートします。自然乾燥後、疎水性ペンを使用して、各スライドの細胞染色領域を囲みます。スライドをTBS-Tで洗浄した後、過酸化水素ブロックで室温で15分間インキュベートし、残ったペルオキシダーゼ活性を除去します。

スライドをTBS-Tで3回、各洗浄で2分間洗浄し、次に目的の免疫細胞化学染色キットからの一次抗体混合物100マイクロリットルで切片を標識し、続いてTBS-Tを2分間5回洗浄します。最後の洗浄後、スライドをキットの一次抗体エンハンサーで室温の暗所で15分間インキュベートします。インキュベーションの最後に、切片をTBS-Tで4回洗浄し、最後の洗浄後に西洋ワサビペルオキシダーゼで標識した約200マイクロリットルの二次抗体を加えて、室温で30分間インキュベーションします。

強化された切片を新鮮なTBS-Tで5回洗浄し、続いて切片あたり100マイクロリットルのジアミノベンジジン溶液を3分間加えます。スライドをTBS-Tで2回洗浄し、切片に100マイクロリットルのヘマトキシリン溶液を1分間ラベル付けします。次に、スライドをTBS-Tでもう一度洗浄し、スライドを95%エタノールで2分間インキュベートした後、新鮮な95%エタノールに1回浸し、100%エタノールに2回浸します。

エタノール脱水切片をガラス瓶内のキシレン40ミリリットルに5分間インキュベートし、スライドを風乾させます。次に、各スライドにカバースリップを取り付け、光学顕微鏡でサンプルを観察します。パラフィン包埋組織のヘマトキシリンおよびエオシン染色は、今示したように、主にタクト核および細胞質で明らかになり、この方法による細胞サンプルの優れた形態学的保存を示唆している。

しかし、調製が不十分な細胞ブロックは、サンプルが適切に染色されていても、形態が悪く、不規則な標識を示します。細胞骨格関連タンパク質2は、通常、凝縮したクロマチン、有糸分裂紡錘体、および細胞質内で観察されます。凝縮したクロマチンに細胞骨格が結合したタンパク質2が染色された細胞のみが有糸分裂細胞であり、血清飢餓状態のHeLa細胞培養集団には細胞骨格が結合したタンパク質2陽性の細胞はほとんど見つかりません。

高度に有糸分裂するHeLa細胞のほとんどはKi-67陽性でもあり、細胞核にはKi-67の染色が見られます。血清飢餓状態のHeLa細胞の約半分だけがこの増殖マーカーを発現しています。このテクニックは、一度習得すれば、適切に実行すれば6時間で完了することができます。

この手順を試みるときは、細胞を適切な密度に希釈して良好な血栓を作ることを覚えておくことが重要です。この手順に続いて、固定細胞のフローサイトメトリー分析などの他の方法を実行して、同期中の細胞周期期に関する追加の質問に答えることができます。その開発後、この技術は、培養細胞の形態学的情報を保持しながら細胞株の発現プロファイリングを探求するという肝臓病理学の分野における未来への道を開きました。

このビデオを見れば、免疫細胞化学の実施方法と、培養細胞からの血漿トロンボプラスチンブロックの調製方法について十分に理解できるはずです。キシレンのような危険な試薬の取り扱いは非常に危険であり、この手順を実行する際には手袋や白衣の着用などの予防措置を常に講じる必要があることを忘れないでください。