Name: セルのパラフィン包埋ブロックの免疫細胞化学による培養細胞の蛋白質発現レベルの定量 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-20T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 6 s
Description: 学ぶパラフィン包埋細胞ブロックを用いた免疫細胞化学法で、HeLa細胞などの培養細胞における増殖マーカーの蛋白質発現レベルを定量的に解析する技術。この簡便な方法は形態情報を保持しながら臨床病理学研究に有用です。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

この作品は、国立がんセンター、韓国 (1510121) と国立研究財団、韓国 (no から k. かに研究助成金によって支えられた.NRF-2015R1A2A2A04007432)。

研究プロトコルは、制度見直し委員会の国立がんセンター、韓国 (NCCNCS-12-630) によって承認されました。
1. 試料 (30 分)
<ol><li>(CCL 2、ATCC) の HeLa 細胞の文化、100 mm ディッシュで 10 mL 完全 DMEM 培地 (10% 牛胎児血清, 1% ペン-連鎖球菌) を使用します。HeLa 細胞の血清飢餓を準備するには、前研究11で説明するよう、ウシ胎児血清なし DMEM で合流の HeLa 細胞を 48 時間インキュベートします。</li>
	<li>セルをデタッチするには、2 mL リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) で洗浄し、100 mm ディッシュあたり 2 mL 0.25 %edta トリプシンを追加します。その後、37 ° C で CO2インキュベーターで 2-3 分間インキュベートします。</li>
	<li>トリプシンを非アクティブ化する培養皿に完全 DMEM 培地 5 mL を追加し、剥離細胞を 15 mL チューブに転送します。その後、ペレットを形成する 10 分の 300 x g で細胞を遠心分離機します。</li>
	<li>、上清を除去し、10 分間 300 × g で遠心分離によって 2 mL 冷 PBS で 2 回ペレットを洗ってください。</li>
	<li>上清を除去した後細胞ペレットに 95% エタノール 1 mL を加えるし、ボルテックスによってエタノール細胞ペレットをミックスします。セル ブロック準備まで氷の上固定セルを保ちます。</li>
</ol>2. セル ブロック準備 (1 時間 30 分)
<ol><li>凍結血漿の準備のため因数、健康なドナーの血液からの EDTA 血漿の収集し、13,000 x g で 10 分間遠心上清のプラズマを収集する因数 200 400 μ におよび microfuge の管します。使用するまで-80 ° c 因数を格納します。凍結血漿因数が準備ができたら、それらを取得し、5 分の 37 ° C で培養によるプラズマを解凍します。</li>
	<li>10 分のための 700 x g で固定細胞を遠心分離し、上澄みを廃棄します。</li>
	<li>2 滴 (約 200 μ L) とプラズマ、トロンボプラスチン、2 滴と 2 滴を 0.025 M 塩化カルシウムの細胞ペレットをミックスします。その後、ピペッティングでそれらをミックスします。</li>
	<li>図 2 aに示すように、10 分間室温で細胞塊を形成する混合物を許可します。その後、注ぐと、ピペットで PBS を除去する 2 回 PBS のセル血栓を洗います。代表の白い細胞の塊を図 2 bに示します。</li>
	<li>ホルマリン、ろ紙の部分を湿らせ、事前に湿らせたろ紙を細胞の塊を包みます。図 2に示すように組織カセットにピンセットと凝血の混合物を配置します。</li>
	<li>ホルマリン固定のための 4 ° C で一晩緩衝ホルマリン (PBS で 10% ホルマリン) の 50 mL を含んでいるガラスの瓶に組織カセットの場所。</li>
</ol>3. ティッシュの処理、パラフィン包埋 (一晩)
<ol><li>ホルマリン固定細胞塊を含む組織カセットを読み込むティッシュ プロセッサで一晩11を前述のよう。ティッシュの処理は、水分除去とパラフィン埋め込む前に固定セルのエアコンです。研究組織を処理することがなく、処理手順を表 1に示すように、組織を実行します。</li>
	<li>(図 2 D) 溶融パラフィンにある金型そこに温水埋め込み駅と 60 分後にチェック入れます。</li>
	<li>組織カセットから形成された細胞の塊を取るし、金型内で溶融パラフィンに配置。</li>
	<li>セルを含む金型に蓋のない新しい組織カセット溶融パラフィンの途中で凝固し、組織カセットと金型により溶融パラフィンを注ぐ場所です。そして、30 ~ 60 秒間冷たい板で固めるパラフィンをもらいます。</li>
	<li>金型から組織カセットを区切ります。その後、パラフィン セル ブロックは各種の準備ができて。セルのパラフィン包埋ブロックの埋め込みセル血栓は、図 2Eの矢印によって示されます。</li>
</ol>4. 各種 (1 h) のスライドの準備
<ol><li>パラフィン セル ブロックのセル血栓のための領域を確認し、セル ブロックをミクロトームを使用して 3-4 μ m の厚さのスライスにカットします。図 2 fに示すように、ガラスのシラン コーティング スライドにパラフィン切片を置きます。</li>
	<li>場所セクションはセクションのスライドに付着する 30 分の 37 ° C のオーブンでスライドします。</li>
</ol>5. セル ブロック (6 h) の免疫細胞化学
注: 細胞セル ブロック セクションに染色、様々 なキットも使用できます (材料の表を参照してください)。すべてこのようなキットがある様々 な感度と特異性の変更に応じて。
<ol><li>デ paraffinize に 4 分間、キシレンの 50 mL のセクションを孵化させなさい。</li>
	<li>100% エタノールの脱水、2 分間で 2 回 95% エタノールと 2 分 80% エタノールでスライドを孵化させなさい。その後、10 分間流水でエタノールを削除します。</li>
	<li>抗原検索のため瓶含む 40 mL トリス EDTA 検索バッファーの pH 9.0 では、スライドの配置し、30 分間鍋で沸騰させます。</li>
	<li>洗浄は、流水の下で滑ると 4 ° c. で 10 分の 95% エタノールにそれらをインキュベートその後、簡単に識別のための Pap ペンをスライドに細胞染色領域をマークします。</li>
	<li>スライドを含む 0.2% 含有トリス緩衝生理食塩水で洗うトゥイーン 20 (TBS-T)、過酸化水素ブロックで孵化させなさいと (材料の表を参照してください)、残ペルオキシダーゼ活性を削除する 15 分の室温で。その後、TBS T 2 分の 3 倍にして、スライドを洗ってください。</li>
	<li>タンパク質のブロックの一次抗体を希釈して希釈した抗体溶液を準備 (材料の表を参照してください)。たとえば、一次抗体をすることができます CKAP2 希釈 1: 100、Ki 67 抗体レバレッジ。その後、1 h の希釈溶液 100 μ L のスライドを孵化させなさい。</li>
	<li>5 回 2 分の TBS T で洗浄後暗闇の中で部屋の温度で 15 分はキットの一次抗体エンハンサーでスライドをインキュベートします。</li>
	<li>4 回 2 分の TBS T で洗浄後 HRP ポリマー (と西洋ワサビペルオキシダーゼ標識二次抗体) の 2 滴を追加、スライド 30 分間室温で孵化させなさい。</li>
	<li>5 回 2 分の TBS T で洗浄後、ジアミノベンジジン (軽打) 溶液 100 μ L を追加 (材料の表を参照)、3 分間スライドを孵化させなさいと。</li>
	<li>TBS T で 2 回洗浄後ヘマトキシリン液 (ヘマトキシリンの 100 μ L と 600 μ L の蒸留水の混合物) を 100 μ l 添加し、1 分のスライドを孵化させなさい。</li>
	<li>TBS T のスライドを一度洗浄した後脱水 2 分の 95% エタノールでインキュベートし、一度、95% エタノールに浸漬 2 回 100% エタノールに浸漬します。その後、5 分間のガラスの瓶に 40 mL キシレンのスライドを孵化させなさい。</li>
	<li>スライドがキシレンから乾燥、それぞれ coverslips をマウントします。</li>
	<li>光顕微鏡を用いた染色パターンを観察します。</li>
</ol>

<ol><li>Bhattacharyya, D., Hammond, A. T., Glick, B. S. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20419424">High-quality immunofluorescence of cultured cells.</a> Methods Mol Biol. 619, 403-410 (2010).</li>
<li>Brown, C. M. <a target="_blank" href="http://jcs.biologists.org/content/120/10/1703">Fluorescence microscopy - Avoiding the pit falls.</a> J Cell Sci. 120, 1703-1705 (2007).</li>
<li>Odell, I. D., Cook, D. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23299451">Immunofluorescence Techniques.</a> J Invest Dermatol. 133, e4(2013).</li>
<li>Kulkarni, M. B., Desai, S. B., Ajit, D., Chinoy, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+utility+of+the+thromboplastin-plasma+cell-block+technique+for+fine-needle+aspiration+and+serous+effusions%5BTitle%5D)+AND+%22Diagn+Cytopathol%22%5BJournal%5D)">The utility of the thromboplastin-plasma cell-block technique for fine-needle aspiration and serous effusions.</a> Diagn Cytopathol. 37 (2), 86-90 (2009).</li>
<li>Shivakumarswamy, U., Arakeri, S. U., Karigowdar, M. H., Yelikar, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diagnostic+utility+of+the+cell+block+method+versus+the+conventional+smear+study+in+pleural+fluid+cytology%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cytol%22%5BJournal%5D)">Diagnostic utility of the cell block method versus the conventional smear study in pleural fluid cytology.</a> J Cytol. 29 (1), 11-15 (2012).</li>
<li>Nathan, N. A., Narayan, E., Smith, M. M., Horn, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+block+cytology%3A+Improved+preparation+and+its+efficacy+in+diagnostic+cytology%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Clin+Pathol%22%5BJournal%5D)">Cell block cytology: Improved preparation and its efficacy in diagnostic cytology.</a> Am J Clin Pathol. 114 (4), 599-606 (2000).</li>
<li>Keyhani-Rofagha, S., Vesey-Shecket, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diagnostic+value%2C+feasibility%2C+and+validity+of+preparing+cell+blocks+from+fluid-based+gynecologic+cytology+specimens%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer%22%5BJournal%5D)">Diagnostic value, feasibility, and validity of preparing cell blocks from fluid-based gynecologic cytology specimens.</a> Cancer. 96, 204-209 (2002).</li>
<li>Young, N. A., Naryshkin, S., Katz, S. M. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/8390929">Diagnostic value of electron microscopy on paraffin-embedded cytologic material.</a> Diagn Cytopathol. 9, 282-290 (1993).</li>
<li>Jin, Y., Murakumo, Y., Ueno, K., Hashimoto, M., Watanabe, T., Shimoyama, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+mouse+cytoskeleton-associated+protein%2C+CKAP2%2C+with+microtubule-stabilizing+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Sci%22%5BJournal%5D)">Identification of a mouse cytoskeleton-associated protein, CKAP2, with microtubule-stabilizing properties.</a> Cancer Sci. 95 (10), 815-821 (2004).</li>
<li>Hong, K. U., Choi, Y. -B., Lee, J. -H., Kim, H. -J., Kwon, H. -R., Seong, Y. -S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transient+phosphorylation+of+tumor+associated+microtubule+associated+protein+%28TMAP%29%2Fcytoskeleton+associated+protein+2+%28CKAP2%29+at+Thr-596+during+early+phases+of+mitosis%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Mole+Med%22%5BJournal%5D)">Transient phosphorylation of tumor associated microtubule associated protein (TMAP)/cytoskeleton associated protein 2 (CKAP2) at Thr-596 during early phases of mitosis.</a> Exp Mole Med. 40, 377-386 (2008).</li>
<li>Sim, S. H., Bae, C. D., Kwon, Y., Hwang, H. -L., Poojan, S., Hong, H. -I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CKAP2+%28cytoskeleton-associated+protein2%29+is+a+new+prognostic+marker+in+HER2-negative+luminal+type+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">CKAP2 (cytoskeleton-associated protein2) is a new prognostic marker in HER2-negative luminal type breast cancer.</a> PLoS ONE. 12 (8), e0182107(2017).</li>
<li>Inwald, E. C., Klinkhammer-Schalke, M., Hofstadter, F., Zeman, F., Koller, M., Gerstenhauer, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ki-67+is+a+prognostic+parameter+in+breast+cancer+patients%3A+results+of+a+large+population-based+cohort+of+a+cancer+registry%5BTitle%5D)+AND+%22Breast+Cancer+Res+Treat%22%5BJournal%5D)">Ki-67 is a prognostic parameter in breast cancer patients: results of a large population-based cohort of a cancer registry.</a> Breast Cancer Res Treat. 139 (2), 539-552 (2013).</li>
<li>Katikireddy, K. R., O'Sullivan, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunohistochemical+and+immunofluorescence+procedures+for+protein+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Immunohistochemical and immunofluorescence procedures for protein analysis.</a> Methods Mol Biol. 784, 155-167 (2011).</li>
<li>Beutner, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunofluorescent+staining%3A+The+fluorescent+antibody+method%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol+Mol+Biol+Rev%22%5BJournal%5D)">Immunofluorescent staining: The fluorescent antibody method.</a> Microbiol Mol Biol Rev. 25 (1), 49-76 (1961).</li>
</ol>

ないすべての著者は、利害の対立を宣言しています。

固定細胞の免疫蛍光染色は現在形態情報1を維持しながら細胞におけるタンパク質発現量の定量のための選択の方法です。ただし、セルのパラフィン包埋ブロックの免疫細胞化学は優秀な代わりをすることができます。このプロトコルでセルのパラフィン包埋ブロックの試みとの準備のための詳細な手順が記載されているし、細胞研究のアプリケーションも容易に可能だと思います。
免疫細胞化学には、免疫蛍光染色にいくつかの利点があります。新鮮な培養細胞が必要ですが通常細胞の免疫蛍光染色、パラフィン セル ブロックはいくつかの年13の部屋の温度で保つことができます。さらに、セル ブロックで各種生体4日常的免疫組織化学で使用される同じ抗体を用いて細胞内発現パターンを探索できます。さらに、蛋白質のレベルや、事前培養細胞様々 な薬や様々 な文化の条件11の下で翻訳後修飾の変化を調べることができます。
免疫組織化学染色の利点と対照をなしてセルのパラフィン包埋ブロックの作成は時間がかかり、高価な14です。また、ほとんど研究所この手法で経験が不足して、このような状況の下で技術的なエラーが多い。最も一般的なエラーは、細胞形態の貧しい人々 の保存と貧しいまたは不規則な免疫パラフィン セル ブロック セクションに染色します。これらは、ほとんどの人は、最高のセル条件でセル ブロックを作ったり、細胞塊を形成する十分なソリューションを使用して回避できます。
現在のプロトコルの例として HeLa 細胞のセル ブロックを調製し、, 2 つの増殖マーカー、CKAP2 および以前に報告した11として、ki-67 の免疫細胞化学的染色を行った。各種、メディア牛胎児血清とのインキュベーション操られていた細胞と血清飢餓の影響はみられなかった。スライドあたり 4-5 μ m 厚のセル ブロック セクションのみを使用してセル ブロックから多くのスライドを用意できますので抗体の多数のこれらの準備されたパラフィン埋め込まれたセルのブロックを用いることができます。したがって、表現パターンの 2 つの条件に対応するは、いくつかの異なる抗体を評価できます。CKAP2 のパターンを染色と癌組織がすでにある Ki 67 報告9,10、11,12, 免疫組織化学染色の結果が簡単に評価される、ため、染色パターン免疫組織化学からのそれらにかなり類似していた。
結論としては、免疫染色パラフィン セルブロックの蛍光汚損; に優れた代替手段をすることができます。さらに、それ容易かつ確実に使用できますで形態情報を維持しながら細胞株における発現に関する基礎的研究。

ほとんどの実験室は、通常はセルのパラフィン包埋ブロックは使用されません。むしろ、培養細胞を固定、パラフィン埋め込まれていない細胞は細胞内局在の研究で用いられます。これらの培養細胞を固定、発色ではなく蛍光を使用されています。したがって、免疫蛍光染色細胞文化1を用いた研究ではタンパク質の発現レベルの決定のための選択の方法は、現在。ただし、免疫蛍光染色のために準備されたスライドは、平面顕微鏡2の下で示されたものと違う画像を表示可能性があります蛍光顕微鏡下でのみ観察できます。また、免疫蛍光染色用のスライドの保存は、明るい光からの保護を必要とする、蛍光信号のイメージング蛍光信号3の損失のための繰り返された露出と弱くなります。セルのパラフィン包埋ブロックの免疫細胞化学からの結果は免疫組織のパラフィン包埋4からのそれらにかなり類似と臨床情報に簡単に変換できます。したがって、各種の優れた代替手段となります。ただし、セル ブロック準備されていない人気のある基礎研究所で。このプロトコルでは、その後、セル ブロック作製、免疫染色は、細胞培養研究の分野でこのメソッドの使用を促進するために提供されます。
セル ブロック作製の試みとユニークな方法は、彼らはすでに基礎研究4,5に臨床診断から適用されています。メソッドをされている様々 なセル ブロック準備報告4,6トロンボプラスチン プラズマ法はシンプルでコスト効率の高い、容易に適応可能であります。したがって、トロンボプラスチン プラズマ法4,5,6,7,本稿で提示されたプロトコルの8はセルのパラフィン包埋ブロックの作成に使用されます。
本研究ではトロンボプラスチン プラズマ細胞ブロックおよび 2 つの増殖マーカーを用いた免疫細胞化学法の準備の詳細な手順を示した。1 つのマーカーは最近分裂マーカー9,10,11; として報告されている細胞骨格関連タンパク質 2 (CKAP2)もう一つは Ki 67、最も有名な増殖マーカー12であります。代表的な方式を図 1に示します。

<table><tbody><tr><td>HeLa細胞</td><td>ATCC</td><td>HeLa (ATCC&nbsp;CCL-2)</td><td></td></tr><tr><td>Ki-67 抗体</td><td>サーモフィッシャー・サイエンティフィック</td><td>RM-9106-S1</td><td></td></tr><tr><td>パラフィン</td><td>ライカ</td><td>39601006</td><td></td></tr><tr><td>キシレン</td><td>フィッシャー SCientific</td><td>1330-20-7,100-41-4</td><td></td></tr><tr><td>エテノール</td><td>GD Chem</td><td>DJ16016</td><td></td></tr><tr><td>ヘマトキシリン</td><td>アジレント</td><td>10118581</td><td></td></tr><tr><td>DAB クォントキット</td><td>サーモフィッシャーScientific</td><td>TA-125-QHDX, QHCX 170405</td><td></td></tr><tr><td>Ultravision LP detection Kit</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>PBQ141209, LPB141209,</td><td>LPH141210 免疫細胞化学用キット; タンパク質ブロックを含む</td></tr><tr><td>TintoRetriever 圧力鍋</td><td>バイオ SB Corporation</td><td>BSB 7008</td><td></td></tr><tr><td>Tris-buffered saline</td><td>iNtRON Biotechnology</td><td>IBS-BT008</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>USBCorporation</td><td>115106</td><td></td></tr><tr><td>Thromboplastin</td><td>Neoplastin Cl Plus</td><td>NC0591432</td><td></td></tr><tr><td>Tris-EDTA retrival Buffer</td><td>Dignostic Biosystem</td><td>E625-A</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin EDTA</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25200056</td><td></td></tr><tr><td>Fetal&nbsp;ウシ血清 (FBS)</td><td>Hyclone Laboratories Inc</td><td>SH30910.03</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Hyclone Laboratories Inc</td><td>SH30243.01</td><td></td></tr><tr><td>Antibiotic-Antimycotic, 100X</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Specialty 15240062</td><td></td></tr><tr><td>Ultra vision 過酸化物ブロック H2O2</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>02Q141212</td><td></td></tr><tr><td>封入剤</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>363313</td><td></td></tr><tr><td>パップペン</td><td>ベクターラボラトリーズ</td><td>H-4000</td><td></td></tr><tr><td>濾紙</td><td>GEヘルスケアライフサイエンス</td><td>1001-0155</td><td></td></tr><tr><td>塩化カルシウム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>21115-100ml</td><td></td></tr><tr><td>リン酸緩衝生理食塩水</td><td>PAAラボラトリーズ</td><td>H21-002</td><td></td></tr><tr><td>ホルマリン</td><td>大中</td><td>50-00-0</td><td></td></tr><tr><td>15 ml チューブ</td><td>SPL Life Sciences</td><td>50015</td><td></td></tr><tr><td>組織処理カセット</td><td>Simport</td><td>M492-5</td><td></td></tr><tr><td>100 mm 培養皿</td><td>BD Biosciences</td><td>08-772E</td><td></td></tr><tr><td>ガラス スライド</td><td>武藤 純薬品</td><td>140712</td><td></td></tr><tr><td>カバー ガラス</td><td>マリエンフェルト</td><td>2262817</td><td></td></tr><tr><td>ガラス Zar</td><td>Hyunil Lab-Mate</td><td>HIP-1027</td><td></td></tr><tr><td>遠心分離機</td><td>エッペンドルフ</td><td>5810R</td><td></td></tr><tr><td>クラス II 層流フード</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>1300 シリーズ A2</td><td></td></tr><tr><td>CO2 インキュベーター</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>シリーズ A2</td><td></td></tr><tr><td>ティッシュプロセッサー</td><td>ライカバイオシステム</td><td>TP1020</td><td></td></tr><tr><td>ミクロトーム</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>HM340E</td><td></td></tr><tr><td>顕微鏡</td><td>オリンパス</td><td>CX-21</td><td></td></tr><tr><td>パラフィン包埋ステーション</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>EC 350-1, EC 350-2</td><td></td></tr><tr><td>組織切片浴 (丸型)</td><td>CellPath</td><td>HCP-JAW-0100-00AEU</td><td></td></tr><tr><td>ヒュームフード</td><td>漢陽科学機器有限公司</td><td>FH-150</td><td></td></tr></tbody></table>

セルのパラフィン包埋ブロックの免疫細胞化学による培養細胞の蛋白質発現レベルの定量

Determination of Protein Expression Level in Cultured Cells by Immunocytochemistry on Paraffin-embedded Cell Blocks

免疫蛍光染色は、現在バイオマーカ発現量の定量のための選択の方法細胞培養系における形態情報も必要です。免疫細胞のパラフィン包埋ブロック、ここに提示された染色プロトコルはパラフィン埋め込まれた固定細胞の免疫蛍光染色に優れた代替手段です。このプロトコルではトロンボプラスチン プラズマ法を用いた HeLa 細胞からパラフィンのセルブロックが準備され、免疫細胞化学 2 つの増殖マーカー、CKAP2 および ki-67 の評価を行った。核と HeLa 細胞の細胞質の形態セル ブロックのスライドでよく保存されていた。同時に、各種の CKAP2 および ki-67 染色パターン パラフィン癌組織免疫組織化学的に非常に類似していた。無血清条件下で HeLa 細胞の前培養を含む変更された細胞培養条件と建築情報を維持しながら効果を評価でした。結論としては、セルのパラフィン包埋ブロックの免疫細胞化学は免疫蛍光染色に優れた代替手段です。

ヘマトキシリンとエオシン染色スライド (図 3 a, B) セルのパラフィン包埋ブロックから、核のほとんどは、細胞の細胞質はそのままに、形態の保存が現在のプロトコル (優れていることを示唆しています。図 3 a)。免疫組織化学的染色で以前に報告された10として CKAP2 陽性だった観察、凝縮したクロマチン、有糸分裂紡錘体、細胞質 (図 4)。Ki 67 染色細胞核として期待される (図 4) 観察されました。だけ凝縮したクロマチン染色 CKAP2 と細胞分裂期細胞をした (図 4 a, Bの矢印を参照)。多くの CKAP2 陽性細胞は完全培地 (図 4 a) で孵化後に用意されていた非常に mitotic の HeLa 細胞で示されていた。比較では、血清飢餓 HeLa 細胞 (図 4 b) にほとんどの CKAP2 陽性細胞が 。高い細胞分裂の HeLa 細胞のほとんどが Ki 67 陽性 (図 4)。一方、血清飢餓 HeLa 細胞における Ki 67 陽性率は残った ~ 50% (図 4) と高かった。これらの結果は非常に匹敵する、以前レポート11、 CKAP2、Ki 67 よりも、がん細胞の増殖のマーカーをより信頼性の高いことを示唆しています。
不完全に準備されたセル ブロックで、細胞質から核を分離もあり、その結果、貧しい人々 の形態保存。冷蔵庫の固定セルの長いよりも一晩培養などの悪い結果が生じる。もう一つの重要な問題は、セルが優秀な形態にかかわらず、免疫細胞化学でよく汚れていないことです。この問題はセル血栓が小さい場合より頻繁に発生します。通常、染色強度は図 3 b; で示すように、正規細胞の塊が大きい、不規則な染色の可能性はきわめて低い。したがって、このプロトコルで我々 は大きな細胞塊を形成するためにプラズマ、トロンボプラスチン、塩化カルシウムのボリュームを増加しました。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57369/57369fig1.jpg"> 図 1: セル ブロック準備方式。<a href="/files/ftp_upload/57369/57369fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57369/57369fig2.jpg"> 図 2: パラフィン セル ブロック準備の図。(管 A) トロンボプラスチン プラズマ細胞塊。(PBS 洗浄後 TP B) 細胞の塊。湿らせたろ紙上 (C) 細胞の塊。(溶融ワックス D) 組織埋め込み駅。金型 (矢印) は、凝固用溶融ワックスを保持しています。(E) パラフィン包埋細胞塊 (矢印) は、パラフィンまたはセルのパラフィン包埋ブロックに埋め込まれています。(F) 薄いパラフィン被覆スライドの中央部について<a href="/files/ftp_upload/57369/57369fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57369/57369fig3.jpg"> 図 3: セル ブロック作製とヘマトキシリンとエオシン染色による品質確認します。(A) ヘマトキシリン--エオシン-染色セルブロック パラフィン埋め込まれたセクションの HeLa 細胞のイメージ。(セルブロック パラフィン埋め込まれたセクションを準備が不十分で各種 Ki 67 B) 不規則な染色します。スケール バーは、100 (A) と (B) 200 μ m です。<a href="/files/ftp_upload/57369/57369fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57369/57369fig4.jpg"> 図 4: 免疫組織化学的染色 HeLa 細胞の細胞のパラフィン包埋ブロックします。(A) CKAP2 高分裂条件下で染色します。(B) CKAP2 血清飢餓条件下で染色します。(C) Ki 67 高分裂条件下で染色します。(D) Ki 67 血清飢餓条件下で染色します。100 μ m スケール バーが表示されます。矢印は、CKAP2 陽性細胞を示します。<a href="/files/ftp_upload/57369/57369fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>プロシージャ</td>
			<td>手順</td>
			<td>ソリューション</td>
			<td>時間/温度</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="4">脱水症状</td>
			<td>1</td>
			<td>70% アルコール</td>
			<td>15 分/RT</td>
		</tr>
<tr>
<td>2</td>
			<td>80% アルコール</td>
			<td>15 分/RT</td>
		</tr>
<tr>
<td>3</td>
			<td>95% アルコール</td>
			<td>15 分/RT</td>
		</tr>
<tr>
<td>4</td>
			<td>100% アルコール</td>
			<td>15 分/RT</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="4">クリア</td>
			<td>1</td>
			<td>キシレン</td>
			<td>60 分/4 ° C</td>
		</tr>
<tr>
<td>2</td>
			<td>キシレン</td>
			<td>10 分/RT</td>
		</tr>
<tr>
<td>3</td>
			<td>キシレン</td>
			<td>10 分/RT</td>
		</tr>
<tr>
<td>4</td>
			<td>キシレン</td>
			<td>10 分/RT</td>
		</tr>
<tr>
<td>* RT、室内温度</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
</tbody></table>表 1。組織の処理手順。

現在、固定細胞の免疫蛍光染色バイオマーカ発現量の定量法選択時は形態情報も必要です。ここに提示されたこのプロトコルは、セルのパラフィン包埋ブロックの免疫細胞化学の別の方法を提供します。

Immunofluorescent staining is currently the method of choice for determination of protein expression levels in cell-culture systems when morphological ...

この手順の全体的な目標は、トロンボプラスチン-形質細胞ブロック包埋組織塊の免疫細胞化学的および組織学的分析により、目的の増殖マーカーの発現を分析することです。この方法は、組織による細胞ブロッキングの臨床病理に関する重要な質問に答えるのに役立ちます。パラフィン包埋細胞ブロックの免疫細胞化学的分析のためのこの代替法の主な利点は、手順の技術的な単純さです。100 mmのHeLa細胞培養ディッシュがコンフルエントに達したら、上清を10 mmLのFBSなしのHeLa細胞培養培地に交換し、ディッシュを細胞培養インキュベーターに戻します。48時間後、2ミリリットルのPBSで細胞を洗浄し、続いて0.25%EDTAとトリプシンの2ミリリットルで摂氏37度と5%二酸化炭素で2〜3分間インキュベートします。細胞が分離したら、5ミリリットルの完全培地で反応を停止し、細胞溶液を15ミリリットルの円錐管に移します。遠心分離により細胞を回収し、その後、洗浄ごとに2ミリリットルの冷たいPBSで2回の洗浄を行います。2回目の洗浄後、上清を1ミリリットルの95%エタノールと交換し、ペレットをボルテックスして混合します。次に、固定セルを氷の上に置きます。パラフィン細胞ブロックを調製するには、健康なドナーの血液からEDTA血漿を採取した後、サンプルを遠心分離し、200〜400マイクロリットルの上清血漿アリコートを個々のマイクロチューブに移します。次に、約200マイクロリットルの血漿、約200マイクロリットルのトロンボプラスチン、および約200マイクロリットルの025モル塩化カルシウムを固定HeLa細胞に加えます。混合物を室温で10分間細胞塊を形成するのを待ってから、1ミリリットルのPBSで血栓を2回洗浄し、2回目の洗浄後にホルマリン湿らせた濾紙の個々の部分に血栓を完全にデカントします。血栓を濾紙で包み、ピンセットを使用して、ホルマリンを湿らせた他の4枚の紙の中央にある個々の組織カセットに布を置きます。次に、ティッシュカセットを50ミリリットルの緩衝ホルマリンが入ったガラス瓶に入れ、摂氏4度でホルマリンを一晩固定します。翌朝、カセットをティッシュプロセッサーにロードして、一晩で水分を除去し、細胞を固定します。処理手順が終了する少なくとも1時間前に、パラフィンを溶かすために加熱された包埋ステーションをオンにします。包埋ステーションと血栓の準備ができたら、金型に溶融パラフィンが存在することを確認し、形成された細胞塊をパラフィンに移します。蓋のない新しいティッシュカセットを金型に入れ、カセットをさらに溶融パラフィンで覆います。パラフィンをコールドプレートで30〜60秒間固化させます。次に、ティッシュカセットを金型から分離します。免疫細胞化学分析用の切片を調製するには、細胞塊を1つのパラフィン細胞ブロックに位置させ、ミクロトームを使用してブロックを3〜4マイクロメートルの厚さのスライスに切断します。パラフィン切片を生理食塩水でコーティングされたスライドガラスに置き、スライドを摂氏37度のオーブンに30分間入れます。切片がスライドに付着したら、スライドを15ミリリットルのキシレンで4分間脱パラフィンし、続いて2分間連続した下降エタノールインキュベーションで切片を脱水します。80%エタノールインキュベーション後、切片を流水で10分間すすぎ、40ミリリットルのトリス-EDTA回収バッファーが入ったジャーでスライドを30分間煮沸します。インキュベーションの最後に、回収した抗原スライドを流水で洗浄し、続いて95%エタノールで摂氏4度で10分間インキュベートします。自然乾燥後、疎水性ペンを使用して、各スライドの細胞染色領域を囲みます。スライドをTBS-Tで洗浄した後、過酸化水素ブロックで室温で15分間インキュベートし、残ったペルオキシダーゼ活性を除去します。スライドをTBS-Tで3回、各洗浄で2分間洗浄し、次に目的の免疫細胞化学染色キットからの一次抗体混合物100マイクロリットルで切片を標識し、続いてTBS-Tを2分間5回洗浄します。最後の洗浄後、スライドをキットの一次抗体エンハンサーで室温の暗所で15分間インキュベートします。インキュベーションの最後に、切片をTBS-Tで4回洗浄し、最後の洗浄後に西洋ワサビペルオキシダーゼで標識した約200マイクロリットルの二次抗体を加えて、室温で30分間インキュベーションします。強化された切片を新鮮なTBS-Tで5回洗浄し、続いて切片あたり100マイクロリットルのジアミノベンジジン溶液を3分間加えます。スライドをTBS-Tで2回洗浄し、切片に100マイクロリットルのヘマトキシリン溶液を1分間ラベル付けします。次に、スライドをTBS-Tでもう一度洗浄し、スライドを95%エタノールで2分間インキュベートした後、新鮮な95%エタノールに1回浸し、100%エタノールに2回浸します。エタノール脱水切片をガラス瓶内のキシレン40ミリリットルに5分間インキュベートし、スライドを風乾させます。次に、各スライドにカバースリップを取り付け、光学顕微鏡でサンプルを観察します。パラフィン包埋組織のヘマトキシリンおよびエオシン染色は、今示したように、主にタクト核および細胞質で明らかになり、この方法による細胞サンプルの優れた形態学的保存を示唆している。しかし、調製が不十分な細胞ブロックは、サンプルが適切に染色されていても、形態が悪く、不規則な標識を示します。細胞骨格関連タンパク質2は、通常、凝縮したクロマチン、有糸分裂紡錘体、および細胞質内で観察されます。凝縮したクロマチンに細胞骨格が結合したタンパク質2が染色された細胞のみが有糸分裂細胞であり、血清飢餓状態のHeLa細胞培養集団には細胞骨格が結合したタンパク質2陽性の細胞はほとんど見つかりません。高度に有糸分裂するHeLa細胞のほとんどはKi-67陽性でもあり、細胞核にはKi-67の染色が見られます。血清飢餓状態のHeLa細胞の約半分だけがこの増殖マーカーを発現しています。このテクニックは、一度習得すれば、適切に実行すれば6時間で完了することができます。この手順を試みるときは、細胞を適切な密度に希釈して良好な血栓を作ることを覚えておくことが重要です。この手順に続いて、固定細胞のフローサイトメトリー分析などの他の方法を実行して、同期中の細胞周期期に関する追加の質問に答えることができます。その開発後、この技術は、培養細胞の形態学的情報を保持しながら細胞株の発現プロファイリングを探求するという肝臓病理学の分野における未来への道を開きました。このビデオを見れば、免疫細胞化学の実施方法と、培養細胞からの血漿トロンボプラスチンブロックの調製方法について十分に理解できるはずです。キシレンのような危険な試薬の取り扱いは非常に危険であり、この手順を実行する際には手袋や白衣の着用などの予防措置を常に講じる必要があることを忘れないでください。

determination-protein-expression-level-cultured-cells

Research

JoVE Journal

Cancer Research

がん研究

ここでは定量的免疫蛍光法、画像解析、および不均質性の統計的尺度を用いて腫瘍材料の組織切片の分子多様性を定量化する方法を説明します。方法は、臨床バイオマーカーの開発と分析に使用することを目的としています。...

定量的免疫蛍光法を用いて腫瘍におけるタンパク質発現の不均一性のマッピング

このビデオは、単純ヘルペスウイルス-1感染における感染細胞タンパク質0、ICP0の輸送を監視する方法を示しています。de...

感染細胞におけるウイルスタンパク質の局在化のための免疫蛍光法

ここでは、タンパク質の蛍光強度を適切な内部標準の蛍光強度に正規化することにより、中心体におけるタンパク質のレベルの変化を測定するための新しい定量的蛍光アッセイが開発されています。...

中心体におけるタンパク質レベルの変化を測定するための定量的免疫蛍光アッセイ

免疫組織化学は、タンパク質の局在と組織内での発現を評価するための強力な実験室技術です。現在の半自動定量法は主観性を招き、再現性のない結果をもたらすことがよくあります。ここでは、マルチスペクトルイメージングを用いたマルチプレックス免疫組織化学の方法と、タンパク質の発現と共局在の客観的定量方法について説明します。...

多重化された免疫組織化学染色およびマルチスペクトルイメージングを用いたタンパク質発現と共局在の定量

継承された不整脈は、しばしば、一つ以上のイオンチャネルの表面の配信を変更する突然変異によって引き起こされます。ここでは、TSA-201細胞で発現された組換えイオンチャネルの相対的な合計および細胞表面タンパク質発現の定量化を提供するために、フローサイトメトリーアッセイを適合させます。...

フローサイトメトリーを用いた組換えイオンチャネルの相対的な細胞表面および合計式の決意

ホルマリン固定のパラフィン埋め込まれた (FFPE) 組織サンプルに興味の蛋白質を定量化するための手段として画像解析と相まって蛍光組織学を検証する定量的免疫ブロットの使用について述べる。ルーチン生検試料中のバイオ マーカー...

ルーチン組織試料中のバイオ マーカー タンパク質を定量化するため, 蛍光抗体法を検証するための標準として細胞の定量的免疫ブロット

3 D 文化として成長した神経幹細胞は神経膠腫の生物学を勉強するための強力なツールを構成します。パラフィン包埋による神経膠腫細胞の 3次元構造を維持しながら免疫を実行するプロトコルをご紹介します。このメソッドは、幹細胞性など神経分化神経膠腫 neurosphere...

パラフィン埋め込まれた 3 D 神経膠腫 Neurosphere 文化に免疫組織化学による神経膠腫におけるバイオ マーカーの評価

ここには、免疫組織化学のためのホルマリン固定パラフィン包埋細胞ペレットコントロールを生成するためのプロトコルが示されています。...

ホルマリン固定パラフィン包埋細胞ペレット免疫組織化学制御のための標準化された処理(英語)

このプロトコルは、 ショウジョウバエの眼/触角成虫（EAD）に蛍光マークされ、遺伝的に定義されたクローンの腫瘍を生成する方法を示します。なお、第3齢幼虫とどのように遺伝子発現の変化と腫瘍侵襲性を可視化し、定量化するためにそれらを処理するからEADと脳を分析する方法について説明します。...

ザ<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;成虫盤腫瘍モデル：遺伝的モザイクを用いた遺伝子発現と腫瘍侵襲性の可視化と定量化

多パラメータ蛍光免疫組織化学を用いて、腫瘍微小環境における免疫細胞集団の数、相対分布、および局在を評価することができる。この文献は、口腔咽頭癌におけるT細胞亜集団を分析するためのこの技術の使用を記載している。...

ホルマリン固定パラフィン包埋ヒト卵黄扁平上皮癌試料におけるT細胞亜集団の四色蛍光免疫組織化学

学ぶパラフィン包埋細胞ブロックを用いた免疫細胞化学法で、HeLa細胞などの培養細胞における増殖マーカーの蛋白質発現レベルを定量的に解析する技術。この簡便な方法は形態情報を保持しながら臨床病理学研究に有用です。

セルのパラフィン包埋ブロックの免疫細胞化学による培養細胞の蛋白質発現レベルの定量

さらに動画を探す