ヒト化酵母モデルを用いたα-シヌクレインの毒性と凝集の研究法

これは、Rパス核の細胞表現型と特徴を監視するための簡単な方法です。また、Rパス核の安定性に影響を与える遺伝的要因を見つけるために、ゲノムワイドな研究でしばしば回収することができます。これは十分に確立された運動生物であるため、この技術は簡単で、ヒト細胞株または動物モデルを使用する場合と比較して多くの時間と労力を必要としません。

Rパス核の凝集はパーキンソン病と密接に関連しています。Rパス核の安定性に影響を与える可能性のあるタンパク質または化学物質は、このヒト化酵母モデルでテストできます。まず、3つのシングルコロニーをSD-URA寒天プレートにパッチして、α-シヌクレインプラスミドを含む細胞を選択します。

次に、1株あたり3パッチした酵母形質転換体を3ミリリットルのSRD-URAに接種し、プラスミドを含む酵母を選択的に増殖させ、Gal1プロモーター下でα-シヌクレインの誘導を阻害するための2%ラフィノースと0.1%グルコースを投与します。接種培養液を摂氏30度で、毎分200回転の撹拌下でインキュベートする。翌日、一晩培養した細胞を3ミリリットルの新鮮なSRD-URAに、600ナノメートルで0.2の光学密度に達するまで接種します。

その後、培養液を摂氏30度で6時間インキュベートし、毎分200回転で撹拌する。分光光度計を用いて600ナノメートルの光学密度を測定する。次に、96ウェルプレートのレーン1で滅菌蒸留水でサンプルを600ナノメートルで光学密度0.5に希釈し、各培養の細胞数を均等にします。

次の5つのレーンに160マイクロリットルの滅菌蒸留水を加えて酵母細胞の5倍段階希釈を実行し、各レーンで細胞を連続希釈するときに総容量40マイクロリットルを確保します。マルチチャンネルピペットを使用して各ウェルから10マイクロリットルを移し、コントロール用のSD-URA寒天プレートと毒性をモニタリングするためのSG-URA寒天プレート上のサンプルを見つけます。斑点を付けられたプレートを摂氏30度で逆さまに4日間インキュベートします。

4日目まで24時間ごとにプレートの画像を撮り、目で見つけた株間の成長差を比較することによってデータを分析します。1株あたり3つのパッチを当てた酵母形質転換体を3ミリリットルのSRD-URAに接種し、毎分200回転で攪拌しながら摂氏30度で一晩インキュベートします。翌日、600ナノメートルで一晩培養した細胞の光学密度を測定し、96ウェルプレートで合計200マイクロリットルの新鮮なSD-URAとSG-URAに細胞を接種します。

セルを含む最終体積を200マイクロリットルに調整し、初期セル光学密度を600ナノメートルで0.05に調整します。マイクロタイタープレートのプログラム設定を調整します。目標温度を摂氏30度、間隔時間を15分、振とう時間を890秒、振とう振幅を5ミリメートルに設定し、600ナノメートルの吸光度として測定します。

すべての菌株がマイクロプレートリーダーの固定相に到達するまで、プレートを2〜3日間インキュベートします。成長曲線をプロットしてデータを分析します。パッチを当てた酵母形質転換体を3ミリリットルのSRD-URAに植菌し、毎分200回転の撹拌下で摂氏30度で一晩培養します。

翌日、一晩培養した細胞を3ミリリットルの新鮮なSRD-URAに600ナノメートルで光学密度0.003に再接種し、光学密度が0.2に達するまで毎分200回転攪拌しながら摂氏30度で培養液をインキュベートします。次に、300マイクロリットルの20%ガラクトースを加え、毎分200回転で攪拌しながら摂氏30度でさらに6時間インキュベートします。800gで5分間遠心分離して1ミリリットルの細胞培養物を集め、上清を捨てる。

セルペレットを30マイクロリットルの蒸留水に穏やかに再懸濁します。スライドガラス上にアガロースゲルパッドを準備します。細胞を再懸濁し、5マイクロリットルの細胞再懸濁液をスライドガラス上にロードし、検査のためにカットアガロースパッドを使用して細胞を覆います。

100倍の対物レンズで顕微鏡イメージングを実行するには、プログラムを使用して画像を生成するためのスクリーンキャプチャオプションを使用し、明視野を選択して、液浸オイルを使用して100倍の対物レンズでセルに焦点を合わせます。GFP蛍光フィルターに切り替え、画像露光時間を50ミリ秒から300ミリ秒の間で調整して、信号対雑音比のバランスを取りながら鮮明な画像を実現します。画像ファイルを開き、画像解析ソフトウェアを使用して細胞内の病巣の数に基づいて細胞をカウントすることにより、データを解析します。

PRS426ベクターのGal1プロモーター下でのシヌクレインの発現は、ガラクトースを誘導剤として含む寒天プレート上で有意な増殖遅延を示した。シヌクレインの発現による増殖の違いは、液体培養でも観察されました。いずれの培養条件においても、野生型シヌクレインおよびE46KまたはA53T変異を有する変異体は、シヌクレイン毒性による増殖障害を示した。

しかしながら、凝集体を形成しないシヌクレインA30p変異体は、非毒性の表現型を示した。重篤な細胞毒性を示す株はシヌクレイン凝集体の病巣を示したが、A30p変異株では毒性の低い形態のシヌクレインは細胞全体に拡散した。再現性のある結果を得るには、特にシヌクレイン関連の表現型をモニタリングする場合は、各実験で同じ成長段階の細胞を使用することが重要です。

蛍光顕微鏡データで示したように、シヌクレインはより大きな凝集体を形成する可能性があります。したがって、遠心分離によって簡単に分画することができ、シヌクレイン特異的抗体を用いたウェスタンブロッティングによって定量することができる。この技術は、シヌクレインの凝集に影響を与える新規な遺伝的要因や化合物を見つけるためのハイスループットスクリーニングに適用できます。

したがって、パーキンソン病の新しい治療薬候補を見つけることが期待されています。