Name: 酵母細胞の酸化ストレスに対するタンパク質凝集の影響の評価 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-23T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 4 s
Description: 学ぶ フローサイトメトリーによるタンパク質凝集と酸化ストレスの定量解析法。Saccharomyces cerevisiaeを用いて、アミロイド形成タンパク質の細胞内凝集状態と酸化ストレスレベルの相関を評価し、神経変性疾患のメカニズム解明に貢献します。

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1酵母文化や蛋白発現。
注: a β 亜種展示位置 19 (Phe19) Aβ42 ペプチド (図 1 a) の 1 つ残基変異による異なる相対集計性癖。これらのペプチドの亜種は緑色蛍光タンパク質 (GFP) 集計記者 (図 1)29として機能するとタグ付けされます。
<ol><li>BY4741 親の背景 (マタ彼3Δ1ルー2Δ0に会った15Δ0 ura3Δ0)30酵母に 20 Aβ42 GFP 亜種のプラスミドを変換します。GSSGSSG リンカーによって GFP の融合 Aβ42 変異体の各プラスミドをエンコードします。プラスミッドは pESC(-URA) であり、選択可能なマーカー URA329を含んでいます。<ol>
<li>ウラシル (SC 浦) で以下のコンポーネントなし合成の完全なメディアの準備: 1.9 グラム/L の 20% (w/v) ブドウ糖の 100 mL と組み合わせて酵母窒素ウラシル、硫酸アンモニウム 5 g/L、900 mL ddH2O のも基本。</li>
		<li>変換後の酵母細胞のコロニーの SC 裏培 2% ブドウ糖 20 mL を入れ、210 rpm で攪拌下 30 ° C で一晩の文化を育てます。</li>
	</ol>
</li>
	<li>次の日、一晩かけて培養の 100 μ L 接種培 SC 裏の 5 mL に新しい酵母細胞文化を成長します。</li>
	<li>0.5 の590を OD、4 分間 3,000 x g で文化を遠心、上澄みを廃棄し、2% ラフィノース培 SC 裏の同じ容積の細胞を再懸濁します。</li>
	<li>210 rpm で 30 分間攪拌下 30 ° C で孵化させなさい。4 分間 3,000 x g で細胞を遠心分離し、上澄みを廃棄します。組換えタンパク質の発現を誘導するために 2% ガラクトースを含む新鮮な SC 裏中細胞を再懸濁します。</li>
	<li>SC 裏中 2% ガラクトースを含むタンパク質の発現を誘導する 16 時間後 4 分 3,000 × g で遠心分離によって滅菌遠心管の細胞の 1 つの mL を収穫します。 注: 最も関連性の違いは、(図 2 b) 細胞内遺伝子組換え蛋白質の分布を決定するための蛍光顕微鏡で目視できる Aβ42 GFP のバリエーションを表現する 16 h. による酵母細胞の誘導期後に発生します。</li>
</ol>2. 細胞染色
Note: 新鮮な非誘導細胞は FC 解析中に蛍光のしきい値を確立するネガティブ コントロールとして必要です。
<ol><li>16 h による酵母細胞を取るし、590 で彼らの光学密度を決定する nm (外径590).0.1 の外径590に滅菌リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) でそれらを希釈します。<ol>
<li>リン酸緩衝生理食塩水 x 1 を次のように準備: NaCl、KCl、Na2HPO4、1.44 g 0.2 g の 8 g を追加し、KH2PO4 ddH2o. の 800 mL の 0.24 g pH 7.4 に調整後最大 1 L ddH2O のソリューションを入力塩酸フィルター 0.2 μ m のフィルターを通してバッファー。</li>
	</ol>
</li>
	<li>適切にラベル付けされた管 (12 × 75 mm 丸底ポリスチレン) を表現する細胞懸濁液を転送し、光から身を守る。彼らは非誘導し、非染め色細胞と一緒に分析の流れの cytometer でロードする準備ができていることを確認します。</li>
	<li>最終濃度 5 μ M で各サンプルに酸化ストレスのプローブ (例えば、 CellROX 深い赤) を追加し、暗闇の中で 30 分間 30 ° C で細胞をインキュベートします。</li>
	<li>インキュベーション後、1x PBS で 3 回細胞を洗浄し、FC で分析する前にバッファーの同じボリュームにそれらを再懸濁します。</li>
</ol>3. フローのフローサイトメトリー解析
注: は、GFP や酸化ストレス プローブ蛍光シグナルを検出するのに適切なレーザーとフィルターを FC セットアップを使用します。流れの cytometer GFP の検出のための 488 nm の青色レーザーと酸化ストレス プローブの蛍光性の検出の 635 nm の赤色レーザーを使用ことができます。GFP および酸化ストレス プローブの発光蛍光の買収がそれぞれ 530/30 nm BP フィルターと 660/20 BP フィルターで実行されます (表 1)。
<ol><li>新しいワークシート パネルを開くをクリックし、次の取得ドット プロットを作成します。<ol>
<li>散布プロット ツールをツールバーから選択し、作成プロット変数側散布領域 (SSC-A)、y 軸対前方の散布面積の x 軸上線形スケールで (FSC A) します。</li>
		<li>ツールバーから散布プロット ツールをクリックし、変数 FL1 エリア (FITC) x 軸対上にプロットを作成します。FL3 エリア (APC) y 軸に対数スケールで。</li>
	</ol>
</li>
	<li>楽器の設定アイコンをクリックします。[補正] タブをクリックし、すべての補正レベルを設定します。[取得] タブをクリックし、記録される 20,000 イベントの合計数を選択します。</li>
	<li>低流量を切り替える流量アイコンをクリックします。</li>
	<li>非誘導、無染色の細胞を実行を開始する [取得] タブをクリックし、人口は中央左の象限に分布するまでの前方の機器の設定および側方散乱で電圧を調整します。<ol>
<li>細胞の残骸を除くセル人口のまわりの領域 R1 を設定するポリゴンアイコンをクリックし、使用するこのゲート人口 P1 = R1 すべて蛍光ドット プロット、ヒストグラム表現 (図 3)。</li>
	</ol>
</li>
	<li>蛍光信号の PMT 電圧を調整するには、左下腹部に分布しているセルまで計測器の設定タブで、利得をチューニング、FL1 FL3 ドット プロットで無染色の細胞を実行します。</li>
	<li>GFP の蛍光を測定する誘導された細胞にサンプルを変更します。計測器の設定タブで、人口は右下の象限に分布するとき、FSC A対FL1 (FITC) のゲインを設定します。ゲート (ゲート P2) 肯定的な細胞集団を定義します。</li>
	<li>変更非誘導サンプル染色 FSC A対FL3 (APC) ドット プロット蛍光による酸化ストレスを表示するセルです。左上腹部にセル人口を分散までゲインを調整します。ゲート P3 で肯定的な細胞の集団。</li>
	<li>細胞蛍光を表すヒストグラムアイコンと 2 つのヒストグラム プロットを作る。蛍光強度を表す、FL1 (FITC) GFP 蛍光を表す x 軸にあり FL3 (APC) 蛍光性を表すは、y 軸に対数目盛で P2 と P3 の人口をそれぞれ適用を確認します。 メモ: ヒストグラムのオーバーレイは、バリエーション a β を発現する細胞の蛍光プロファイルの違いを説明するために良い方法です。</li>
</ol>4. 組換え蛋白質バイオアセッテイ
<ol><li>バイオマーカ発現量を調べるには、16 時間 6 分、4,000 x g で遠心分離によるイースト文化を収穫し、-80 ° C で細胞ペレットを格納<ol>
<li>PBS の 16 h の組換え蛋白を発現する収集した細胞を再懸濁します。20 の外径590に各 Aβ42 GFP 変異体の 200 μ L の細胞懸濁液を準備します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>総蛋白分画分析のため 20 分間 14,000 × g で遠心分離によって各変異体の 100 μ L を収穫し、酵母の換散バッファー Y の同じボリュームで細胞ペレットを再懸濁します-(50 mM トリス塩酸 pH 8.0、1 %dmso、200 mM の NaCl、1 mM EDTA を含む 10 mg/mL SB3 14 (myr あたりistyl スルホベタイン) を添加した 1 mM 特異フッ化物 (PMSF))。<ol>
<li>軽度の動揺の下で室温で 20 分間サンプルをインキュベートします。</li>
	</ol>
</li>
	<li>ブラッドフォードの試金を使用して蛋白質の抽出濃度を決定します。15% アクリルアミド SDS-PAGE の電気泳動のゲルや、100 V 60 分のポリフッ化ビニリデン (PVDF) 二フッ化膜にしみの各サンプルのタンパク質抽出物の最大 5 μ g をロードします。<ol>
<li>100 mg Coomassie ブリリアント ブルー G-250 の試薬 95% エタノール 50 mL に溶解し、85% (w/v) リン酸の 100 mL を追加ブラッドフォードを準備します。その後、染料が完全に解散したとき ddH21 L O との混合物を希釈し、使用直前のセルロース フィルター ペーパーを通してフィルターします。 注: ブラッドフォード試薬は茶色光する必要があります。</li>
		<li>ウシ血清アルブミン (BSA) ブラッドフォード試薬の 1,000 μ L 中のタンパク質の 5-100 μ g に至る標準を準備します。</li>
		<li>1-10 μ L タンパク質のブラッドフォード試薬 1 ml を抽出し、5 分間室温で混合物をインキュベートを追加します。</li>
		<li>基準及び外径595タンパク質抽出試料の吸光度を測定します。</li>
		<li>分析に標準対で得られた吸光度値でプロットを作る。蛋白質の μ g。標準曲線に基づいて、あればボリュームと、希釈を考慮したタンパク質の量から元のサンプルの濃度を決定します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>0.1% 含有トリス緩衝生理食塩水 (TBS) x 1 と膜をすすぎトゥイーン 20 (TTBS) とブロック 1 x TTBS で 5% (w/v) 脱脂乾燥したミルクを使用しては。<ol>
<li>10 x TBS の 1 L を準備、基本トリスの 24 g と H2Oddの 900 mL の塩化ナトリウムの 88 g を溶解、7.6 に pH を調整します。DdH2O 1 L の最終巻を追加します。1 x ソリューションの ddH2o. の 9 の部分と 10 x の在庫の 1 部分をミックスします。</li>
	</ol>
</li>
	<li>一次 β-アミロイド抗体希釈 6E10 縮尺で 1 h の膜をインキュベートし、二次抗体のヤギと室温で 1 時間抗マウス IgG HRP 共役希釈 1:10, 000。</li>
	<li>Luminata 蛍光試薬 1 mL を使用して膜を開発して手順 5.2 デンシトメトリー分析によってバンドを定量化します。</li>
</ol>5. データの解析
<ol><li>FC によって得られたデータを解析する (MFI) 平均蛍光強度を表示するテーブルを作成して、対応する標準のエラーおよび/または GFP 蛍光および酸化ストレス レベルの差異 (CV) の係数と平均蛍光。<ol>
<li>インスペクターのタブと各チャネルに必要な統計データをカスタマイズするのには [統計] アイコンをクリックします。 注: 蛋白質の変形を比較すると、折り畳み式の背景または解像度指標 (RD) に蛍光値データに変換します。 <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/57470/57470eq1.jpg"> この指標で平均サンプル問題サンプルの平均蛍光、平均のコントロールは、コントロールとして使用するセルの平均蛍光あり SD は平均蛍光の標準偏差。RD 要因は MFI 値よりもより正確な指標だけでなくサンプルもデータの広がりのためのアカウントの違いを計算します。時間をかけて行ったさまざまな実験からのデータを比較する場合、この計算は具体的に関連します。RDs が計算されると、統計的検定の使用は蛋白質の変形の観察の違いの重要性を確認することをお勧め。</li>
	</ol>
</li>
	<li>タンパク質バイオアセッテイ用ウエスタンブロット ImageJ ソフトウェアを使用して組換え蛋白質のレベルを定量化します。<ol>
<li>デンシトメトリーの分析の前に開発された膜のオリジナルの raw 画像を JPEG ファイル形式とグレースケール モードに変換します。</li>
		<li>平均グレー値を [分析] メニューの設定測定セクションを調整します。</li>
		<li>ImageJ から長方形ツールをクリックし、バンドのデンシトメトリーの分析のための一貫性のあるサイズの利益 (率 ROI) の領域を定義します。作成された長方形フレーム内膜イメージの各バンドのセンターし、Ctrl + M (測定コマンド) を使用して 1 つずつ測定値を記録します。</li>
		<li>同じ ROI 領域を適用すること、各バンドに隣接したローカルのバック グラウンドを測定します。測定後、各バンドは個別から対応するローカル背景を減算します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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<li>Carija, A., Navarro, S., de Groot, N. S., Ventura, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+aggregation+into+insoluble+deposits+protects+from+oxidative+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Redox+Biology%22%5BJournal%5D)">Protein aggregation into insoluble deposits protects from oxidative stress.</a> Redox Biology. 12, 699-711 (2017).</li>
</ol>

病気の広い範囲は、携帯電話預金6,7,8,33への誤って折りたたまれたタンパク質の蓄積にリンクされます。アカウント タンパク質濃度を考慮していない、計算のアプローチを使用してこれらの病気の発症を引き起こす分子メカニズムを解明するため多くの努力がなされたまたは体外に近づくと、タンパク質濃度反応中に一定している残る。細胞内タンパク質が常に合成し、混雑と非均質環境で劣化します。これは頻繁にアミロイド蛋白質のインシリコ、 in vitroとin vivoの集計プロパティの不一致を説明します。
複数の理由は酵母などのシンプルな携帯電話モデル集計を勉強する合理的な選択より生物学的文脈で神経変性疾患関連タンパク質の毒性を関連付けられているがあります。例えば、彼らは私たちに...

プロテオステイシスはセルのフィットネスと老化のプロセスの基本的な決定要因です。ネットワーク、正しいリフォールディング conformers の誤って折りたたまれたタンパク質のシャペロンおよびその対象となるタンパク質がいくつか保存されているメカニズム1 を確保することを目的と高度な品質管理によって細胞の蛋白質の恒常性を維持します。 ,2,3,4,5。多数の調査では、発症および人間の病気の広い範囲とのプロテオステイシス、タンパクにつながる障害の進行の間のリンクをサポートします。例えば、タンパク質の堆積物の存在の多くの神経変性疾患、アルツハイマー病、パーキンソン病などとハンチントン病6,7、8、病理学的特徴であります。prionogenic 病と非変性アミロイドーシス9。それは、凝集反応の初期のオリゴマーと protofibrillar のアセンブリが混雑した細胞環境の10の他の蛋白質と異常な相互作用を確立する細胞毒性の主な成分エリシターであることが示唆されています。また、その毒性効果11,12を伝播する、細胞間タンパク質介在物 (PI) を送信できます。したがって、それは、PI の形成可能性があります確かに危険な集約された種の存在を処理または主要な副作用のない蓄積があるなどこのセルに特定の場所に制限する解毒機構を構成するかもしれない13,14。
標準的な体外生化学的アプローチは、凝集反応およびそのプロパティ15,16種に重要な洞察を提供しています。しかし、これらの試金で使用される条件は、細胞内で発生する明確に異なると、したがって、その生理学的な妥当性を質問します。タンパク質品質管理、オートファジーは、細胞の酸化還元状態の17,18真核生物19,20,21 の規制など携帯電話経路の注目すべき保全のため ,22,23, 出芽酵母酵母(出芽酵母) 蛋白質の集合の分子決定要因を研究する特権を持つ単純な細胞モデルとして浮上しています。関連する生物学的環境24,25,26で関連付けられた細胞毒性影響。
タンパク質凝集傾向は、本質的に主なシーケンスでエンコード機能です。識別と集計推進の力の評価に基づくアミロイド様構造の形成を予測できるため、ポリペプチド27の地域。しかし、タンパク質の体外集計プロパティを予測するバイオインフォマティクス アルゴリズムの成功にもかかわらずこれらの性癖が生体内で細胞毒性影響に変換する方法を予測には程遠いです。体系的に特定の蛋白質の集合の状態とその関連付けられている細胞の損傷間のリンクに対応する研究はこの計算の制限を回避するために役立つことがあります。この接続は、単一の残渣でのみが異なるが、凝集体内性癖28の連続した範囲を表示するアミロイド β ペプチド Aβ42 の亜種の大規模なセットを利用して、本研究で扱われます。特に、酵母細胞の凝集を起こしやすい蛋白質によって誘発される酸化的損傷の会計構造の種を識別するために FC ベースのアプローチを説明します。方法論は、シンプルさ、高処理能力と正確な定量的測定など多くの利点を提供します。このアプローチでは、PI プレイ酸化ストレスに対する保護の役割を確認可能。

<table><tbody><tr><td>酵母細胞 BY4741&nbsp;</td><td>ATCC</td><td>201388</td><td>遺伝子型: MATa his3&Delta;1 leu2&デルタ;0 met15&Delta;0 ura3&Delta;0</td></tr><tr><td>pESC(-Ura)プラスミド&nbsp;</td><td>Agilent Genomics</td><td>217454</td><td>Galプロモーターを使用した酵母発現プラスミド。選択可能なマーカー URA3</td></tr><tr><td>酵母合成ドロップアウト 培地サプリメント</td><td>シグマ</td><td>Y1501</td><td></td></tr><tr><td>粉末 酵母 アミノ酸を含まない窒素塩基</td><td>シグマ</td><td>Y0626</td><td>粉末</td></tr><tr><td>ラフィノース</td><td>シグマ</td><td>R7630</td><td>粉末</td></tr><tr><td>グルコース</td><td>ΣG7021</td><td></td><td></td></tr><tr><td>粉末 ガラクトース</td><td>シグマ</td><td>G0750</td><td></td></tr><tr><td>粉末リン酸塩緩衝生理食塩水(PBS)</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>BP3991&nbsp;</td><td>ソリューション10X</td></tr><tr><td>CellROX Deep Red試薬&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>C10422</td><td>フリーラジカル細胞透過型蛍光センサー、還元状態では非蛍光性、活性酸素種(ROS)による酸化により明るい蛍光を呈し、最大吸収/蛍光は644/665 nmです。&nbsp;</td></tr><tr><td>Y-PERタンパク質抽出試薬&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>78990</td><td>液体細胞溶解バッファー</td></tr><tr><td>アクリルアミド/ビスアクリルアミド</td><td>Sigma</td><td>A6050</td><td>溶液</td></tr><tr><td>Bradford 色素試薬</td><td>Bio-Rad&nbsp;</td><td>5000205</td><td>タンパク質濃度をワンステップで測定するための色素試薬</td></tr><tr><td>&β;-アミロイド抗体6E10&nbsp;</td><td>BioLegend</td><td>803001</td><td>マウス IgG1.エピトープは、ベータアミロイド(EFRHDS)のアミノ酸3-8内にあります。</td></tr><tr><td>ヤギ抗マウスIgG-HRPコンジュゲート&nbsp;</td><td>バイオ・ラッド</td><td>1721011</td><td></td></tr><tr><td>Membrane Immobilon-P, PVDF</td><td>Millipore</td><td>IPVH00010</td><td></td></tr><tr><td>Luminata forte</td><td>Merk</td><td>WBLUF0100</td><td>プレミックス済みで、すぐに使用できる化学発光 HRP 検出試薬</td></tr><tr><td>フェニルメタンスルホニルフッ化物溶液 (PMSF)</td><td>Sigma</td><td>93482</td><td>プロテアーゼ阻害剤。エタノール</td></tr><tr><td>FACSCantoフローサイトメーター</td>に0.1Mで溶解&nbsp;<td>BDバイオサイエンス</td><td>657338</td><td>488&nbspを装備GFPの検出用のnm青色レーザー、および635&nbsp;nm 赤色レーザー / 530/30 nm BP フィルターおよび 660/20 BP フィルター</td></tr><tr><td>ミニトランスブロット電気泳動 転写細胞</td><td>バイオ・ラッド</td><td>1703930</td><td>タンパク質転移システム</td></tr><tr><td>ミニプロティアン テトラハンドキャストシステム</td><td>バイオ・ラッド</td><td>1658000FC</td><td>電気泳動システム</td></tr></tbody></table>

酵母細胞の酸化ストレスに対するタンパク質凝集の影響の評価

Evaluation of the Impact of Protein Aggregation on Cellular Oxidative Stress in Yeast

タンパク質のフォールディングとアミロイドの立体構造に集約は、発症といくつかの神経変性疾患の進行に関連しています。しかし、少し情報はまだどのように不溶性タンパク質について集計はその毒性で生体を発揮します。細菌や酵母などの単純な原核生物と真核生物のモデル生物は、細胞内アミロイド線維形成、集計の伝達、および毒性の背後にあるメカニズムの私達の現在の理解に大きく貢献しています。このプロトコルでは、酵母の使用は、タンパク質凝集体の形成と細胞の酸化ストレスに与える影響との関係を分析するモデルとして記述されます。メソッドは、フローサイトメトリー (FC) を使用して、式から生じる細胞の酸化損傷の定量化とアミロイド蛋白質の細胞内の可溶性/集計状態の検出を兼ね備えています。この方法は、簡単、迅速、かつ定量的です。研究は、彼らのそれぞれの組み込み集計性癖とアミロイド β ペプチド亜種の大規模なセットによって引き起こされる細胞の酸化ストレスを関連付けることによってテクニックを示しています。

このプロトコルでは、Phe19 がすべて天然蛋白質構成アミノ酸28変異されてどこ Aβ42 ペプチドの 20 個の商品のコレクションを使用する方法について説明します。これらの蛋白質の集計の理論的な性癖は、2 つの異なるバイオ情報アルゴリズム (AGGRESCAN とタンゴ31,32) を使用して分析できます。両方のケースでこの分析を配し、一般的なルールとして疎水性残基と最低最高値荷電と極ものに集約傾向の進歩的なグラデーションをレンダリングします (図 1 b、 1 C)。
実験的 Aβ42 のバリエーションの細胞内凝集状態を追跡するため記述されている実験のプラスミド、Aβ42 のエンコーディングと...

蛋白質の集合は、細胞の酸化ストレスを引き出します。このプロトコルでは、アミロイド蛋白質の細胞内の状態およびフローサイトメトリーを使用して、それらに関連付けられている酸化ストレスを監視する方法について説明します。アミロイド β ペプチドの水溶性で集計しやすい亜種の挙動を調べるためのアプローチが使用されます。

Protein misfolding and aggregation into amyloid conformations have been related to the onset and progression of several neurodegenerative diseases. ...

この手順の全体的な目標は、パン酵母Saccharomyces cerevisiaeを使用して、細胞内タンパク質凝集体の形成とそれらが細胞酸化ストレスに与える影響との関係を決定することです。この方法は、神経変性疾患や非神経障害性アミロイドーシスなど、タンパク質のミスフォールディングや凝集性疾患の分野における重要な疑問に答えるのに役立ちます。この手法の主な利点は、シンプルで高速であり、大規模な酵母集団における細胞の酸化ストレス損傷を定量化できることです。この方法により、アミロイド新生タンパク質の細胞内可溶性または凝集状態と酵母の酸化ストレスレベルとの相関関係についての洞察を得ることができます。さらに、組換えタンパク質を発現する他のモデル生物にも適用できます。フローサイトメトリー解析のデモンストレーションを行うのは、UABのフローサイトメトリー施設の技術者であるManuela Costa氏です。この研究では、ガラクトース誘導性プロモーターの制御下でGFPに融合したA-β-42のプラスミドコードで形質転換したS.cerevisiaeを使用して、さまざまなA-β-42ペプチド変異体の細胞内凝集状態を追跡します。形質転換した酵母細胞のコロニーを1つ選択し、20ミリリットルのSCから2%グルコースを含むウラ培地を除いたものに接種します。一晩攪拌しながら摂氏30度で培養物を育てます。翌日、100マイクロリットルの一晩培養物を5ミリリットルの新鮮なSCマイナスウラ培地に接種し、細胞を摂氏30度で2〜3時間増殖させます。培養物が590ナノメートルまたは0.5のOD 590の光学密度にあるとき、4分間3, 000倍gで培養物を遠心分離し、上清を廃棄し、2%ラフィノースを含む新鮮なSCマイナスウラ培地の5ミリリットルで細胞を再懸濁します。細胞を摂氏30度で30分間攪拌しながらインキュベートします。30分後、細胞を3, 000倍gで4分間遠心分離し、上清を廃棄し、2%ガラクトースを含む新鮮なSCマイナスUra培地に細胞を再懸濁して組換えタンパク質発現を誘導する。細胞をインキュベーターに16時間戻します。16時間後、培養物の1ミリリットルのアリコートを滅菌微量遠心チューブに移し、3, 000倍gで4分間遠心分離することにより、細胞を回収します。この手順は、16時間誘導酵母細胞のOD 590を決定することから開始します。次に、滅菌PBSで細胞をOD 59000000.1に希釈します。発現細胞懸濁液を適切に標識した丸底ポリスチレンチューブに移し、光から保護します。フローサイトメトリー解析のネガティブコントロールとして非誘導細胞を調製します。酸化ストレスプローブを最終濃度5マイクロモルで各サンプルに加えます。サンプルをアルミホイルで覆い、摂氏30度で30分間インキュベートします。インキュベーションが完了したら、細胞をスピンダウンし、上清を取り除き、細胞ペレットをPBSに再懸濁します。この方法で細胞をPBSで3回洗浄します。3回目の洗浄後、細胞を同じ容量のPBSに再懸濁します。未染色の細胞がフローサイトメトリー解析に含まれていることを確認してください。適切なレーザーとフィルターを使用してフローサイトメトリー解析を行い、GFPと酸化ストレスプローブの蛍光シグナルを検出します。まず、[新しいワークシートを開く] パネルをクリックし、実験に名前を付けます。ツールバーから散布図ツールを選択し、変数の Y 軸に Side Scatter Area を、X 軸に線形スケールの Forward Scatter Area を変数としてプロットを作成します。[散布図ツール] をクリックし、X 軸に変数 FITC Area と Y 軸に対数スケールの APC Area 変数を持つプロットを作成します。[Instrument Setting] アイコンをクリックし、[Compensation] タブですべての補正レベルをゼロに設定します。次に、[取得]タブをクリックし、低流量で記録する合計20, 000イベントを選択します。1つの蛍光色素の蛍光発光シグナルは別の検出器で検出できるため、すべての検出器で各蛍光色素の最小シグナルを単一色制御で均一化する補償処理を行うことが重要です。チューブ001の名前をネガティブコントロールに変更し、[取得]タブをクリックして、誘導されていない未染色細胞の実行を開始します。前方散乱光と側方散乱光の[Instrument Settings]で、母集団が中央の左象限に分布するまで電圧を調整します。[ポリゴン] アイコンをクリックして、細胞破片を除いた細胞集団の周囲に領域 R1 を設定し、このゲート化された集団 P1 をすべての蛍光ドット プロットとヒストグラム表現で R1 と等しくします。蛍光シグナルのPMT電圧を調整するには、FL1からFL3のドットプロットで未染色の細胞を実行し、[Instrument Setting]タブでゲインを調整して、細胞が左下の象限に分布するまで待ちます。散布図ツールを使用して、x 軸に変数 FITC-A と FSC-A のドット プロットを作成し、x 軸に変数 APC-A と FSC-A の変数を持つ 2 番目のドット プロットを作成します。次に、サンプルを誘導細胞に変更してGFP蛍光を測定します。「Instrument Setting」タブで、母集団が右下の象限に分布している場合のFSC-AとFITCのゲインを設定します。ゲートを使用してGFP陽性細胞集団を定義します。サンプルを非誘導染色細胞に変更します。FSC-A対APC-Aのドットプロット上の蛍光による酸化ストレスの表示。細胞集団が左上の象限に分布するまでゲインを調整します。P3で陽性細胞集団をゲートします。ヒストグラムアイコンを使用して、細胞の蛍光を表す2つのヒストグラムプロットを作成します。1つはFITC用、もう1つはAPC蛍光用です。平均蛍光強度と蛍光中央値、それに対応する標準誤差、および/またはGFP蛍光および酸化ストレスレベルの分散係数を表示するテーブルを作成します。「報酬」タブをクリックし、すべての報酬レベルをゼロに設定します。「Acquisition」タブをクリックし、記録するイベントの総数を20, 000個選択します。サンプルの 3 つの新しいチューブを準備し、それらに非誘導、誘導可溶性、および誘導凝集体という名前を付けます。プリセット設定でサンプルからデータを取得します。新しいシートを開き、変数FITC-AおよびAPC-Aのドットプロットを作成してデータを解析し、CellROX染色の陽性細胞をゲート化します。各サンプルについて、FITC チャネルと APC チャネルの平均蛍光と標準誤差を含む統計表を作成します。また、凝集タンパク質の計数後にFACSソーターを用いて細胞を選別することも可能です。16時間の誘導期間後にA-β-42変異体を発現する酵母細胞を蛍光顕微鏡で可視化し、細胞内の組換えタンパク質の分布を決定します。これらの画像は、選択されたA-β-42 GFPバリアントの代表です。タンパク質封入体(PI)の形成は、分析されたコレクションの20の変異体のうち10で確認されました。この棒グラフは、各バリアントの合計500個の蛍光細胞から生物学的複製に計算された、異なる数のPIを含む細胞の割合を示しています。予測された凝集特性とin vivo凝集特性との間には優れた一致が観察されました。細胞抽出物中のタンパク質発現レベルは、A-β特異的抗体を用いて定量しました。一般的な傾向として、緑色で着色されたPI形成A-β-42変異体は、赤で着色されたサイトゾルに拡散して分布しているものよりも低いレベルで存在します。A-β-42変異体間の重要な違いは、酸化ストレスプローブの蛍光、タンパク質レベル、およびGFP蛍光特性が、AGGRESCANまたはTANGOバイオインフォマティクスアルゴリズムによって予測されたPIを形成する能力と固有の凝集傾向に関連して表された場合に観察されました。PI形成バリアントは緑色で、非PI形成バリアントは赤色で示しています。この手順に続いて、ヨウ化プロピジウムやアネキシンV染色などの他の方法も実行して、細胞内発現タンパク質バリアントが細胞のアポトーシスや細胞毒性に与える影響を決定するなどの追加の質問に答えることができます。

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Research

JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

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酵母細胞の酸化ストレスに対するタンパク質凝集の影響の評価

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