酵母細胞の酸化ストレスに対するタンパク質凝集の影響の評価

この手順の全体的な目標は、パン酵母Saccharomyces cerevisiaeを使用して、細胞内タンパク質凝集体の形成とそれらが細胞酸化ストレスに与える影響との関係を決定することです。この方法は、神経変性疾患や非神経障害性アミロイドーシスなど、タンパク質のミスフォールディングや凝集性疾患の分野における重要な疑問に答えるのに役立ちます。この手法の主な利点は、シンプルで高速であり、大規模な酵母集団における細胞の酸化ストレス損傷を定量化できることです。

この方法により、アミロイド新生タンパク質の細胞内可溶性または凝集状態と酵母の酸化ストレスレベルとの相関関係についての洞察を得ることができます。さらに、組換えタンパク質を発現する他のモデル生物にも適用できます。フローサイトメトリー解析のデモンストレーションを行うのは、UABのフローサイトメトリー施設の技術者であるManuela Costa

この研究では、ガラクトース誘導性プロモーターの制御下でGFPに融合したA-β-42のプラスミドコードで形質転換したS.cerevisiaeを使用して、さまざまなA-β-42ペプチド変異体の細胞内凝集状態を追跡します。形質転換した酵母細胞のコロニーを1つ選択し、20ミリリットルのSCから2%グルコースを含むウラ培地を除いたものに接種します。一晩攪拌しながら摂氏30度で培養物を育てます。

翌日、100マイクロリットルの一晩培養物を5ミリリットルの新鮮なSCマイナスウラ培地に接種し、細胞を摂氏30度で2〜3時間増殖させます。培養物が590ナノメートルまたは0.5のOD 590の光学密度にあるとき、4分間3, 000倍gで培養物を遠心分離し、上清を廃棄し、2%ラフィノースを含む新鮮なSCマイナスウラ培地の5ミリリットルで細胞を再懸濁します。細胞を摂氏30度で30分間攪拌しながらインキュベー

30分後、細胞を3, 000倍gで4分間遠心分離し、上清を廃棄し、2%ガラクトースを含む新鮮なSCマイナスUra培地に細胞を再懸濁して組換えタンパク質発現を誘導する。細胞をインキュベーターに16時間戻します。16時間後、培養物の1ミリリットルのアリコートを滅菌微量遠心チューブに移し、3, 000倍gで4分間遠心分離することにより、細胞を回収します。

この手順は、16時間誘導酵母細胞のOD 590を決定することから開始します。次に、滅菌PBSで細胞をOD 59000000.1に希釈します。発現細胞懸濁液を適切に標識した丸底ポリスチレンチューブに移し、光から保護します。

フローサイトメトリー解析のネガティブコントロールとして非誘導細胞を調製します。酸化ストレスプローブを最終濃度5マイクロモルで各サンプルに加えます。サンプルをアルミホイルで覆い、摂氏30度で30分間インキュベートします。

インキュベーションが完了したら、細胞をスピンダウンし、上清を取り除き、細胞ペレットをPBSに再懸濁します。この方法で細胞をPBSで3回洗浄します。3回目の洗浄後、細胞を同じ容量のPBSに再懸濁します。

未染色の細胞がフローサイトメトリー解析に含まれていることを確認してください。適切なレーザーとフィルターを使用してフローサイトメトリー解析を行い、GFPと酸化ストレスプローブの蛍光シグナルを検出します。まず、[新しいワークシートを開く] パネルをクリックし、実験に名前を付けます。

ツールバーから散布図ツールを選択し、変数の Y 軸に Side Scatter Area を、X 軸に線形スケールの Forward Scatter Area を変数としてプロットを作成します。[散布図ツール] をクリックし、X 軸に変数 FITC Area と Y 軸に対数スケールの APC Area 変数を持つプロットを作成します。[Instrument Setting] アイコンをクリックし、[Compensation] タブですべての補正レベルをゼロに設定します。

次に、[取得]タブをクリックし、低流量で記録する合計20, 000イベントを選択します。1つの蛍光色素の蛍光発光シグナルは別の検出器で検出できるため、すべての検出器で各蛍光色素の最小シグナルを単一色制御で均一化する補償処理を行うことが重要です。チューブ001の名前をネガティブコントロールに変更し、[取得]タブをクリックして、誘導されていない未染色細胞の実行を開始します。

前方散乱光と側方散乱光の[Instrument Settings]で、母集団が中央の左象限に分布するまで電圧を調整します。[ポリゴン] アイコンをクリックして、細胞破片を除いた細胞集団の周囲に領域 R1 を設定し、このゲート化された集団 P1 をすべての蛍光ドット プロットとヒストグラム表現で R1 と等しくします。蛍光シグナルのPMT電圧を調整するには、FL1からFL3のドットプロットで未染色の細胞を実行し、[Instrument Setting]タブでゲインを調整して、細胞が左下の象限に分布するまで待ちます。

散布図ツールを使用して、x 軸に変数 FITC-A と FSC-A のドット プロットを作成し、x 軸に変数 APC-A と FSC-A の変数を持つ 2 番目のドット プロットを作成します。次に、サンプルを誘導細胞に変更してGFP蛍光を測定します。「Instrument Setting」タブで、母集団が右下の象限に分布している場合のFSC-AとFITCのゲインを設定します。

ゲートを使用してGFP陽性細胞集団を定義します。サンプルを非誘導染色細胞に変更します。FSC-A対APC-Aのドットプロット上の蛍光による酸化ストレスの表示。

細胞集団が左上の象限に分布するまでゲインを調整します。P3で陽性細胞集団をゲートします。ヒストグラムアイコンを使用して、細胞の蛍光を表す2つのヒストグラムプロットを作成します。1つはFITC用、もう1つはAPC蛍光用です。平均蛍光強度と蛍光中央値、それに対応する標準誤差、および/またはGFP蛍光および酸化ストレスレベルの分散係数を表示するテーブルを作成します。

「報酬」タブをクリックし、すべての報酬レベルをゼロに設定します。「Acquisition」タブをクリックし、記録するイベントの総数を20, 000個選択します。サンプルの 3 つの新しいチューブを準備し、それらに非誘導、誘導可溶性、および誘導凝集体という名前を付けます。

プリセット設定でサンプルからデータを取得します。新しいシートを開き、変数FITC-AおよびAPC-Aのドットプロットを作成してデータを解析し、CellROX染色の陽性細胞をゲート化します。各サンプルについて、FITC チャネルと APC チャネルの平均蛍光と標準誤差を含む統計表を作成します。

また、凝集タンパク質の計数後にFACSソーターを用いて細胞を選別することも可能です。16時間の誘導期間後にA-β-42変異体を発現する酵母細胞を蛍光顕微鏡で可視化し、細胞内の組換えタンパク質の分布を決定します。これらの画像は、選択されたA-β-42 GFPバリアントの代表です。

タンパク質封入体(PI)の形成は、分析されたコレクションの20の変異体のうち10で確認されました。この棒グラフは、各バリアントの合計500個の蛍光細胞から生物学的複製に計算された、異なる数のPIを含む細胞の割合を示しています。予測された凝集特性とin vivo凝集特性との間には優れた一致が観察されました。

細胞抽出物中のタンパク質発現レベルは、A-β特異的抗体を用いて定量しました。一般的な傾向として、緑色で着色されたPI形成A-β-42変異体は、赤で着色されたサイトゾルに拡散して分布しているものよりも低いレベルで存在します。A-β-42変異体間の重要な違いは、酸化ストレスプローブの蛍光、タンパク質レベル、およびGFP蛍光特性が、AGGRESCANまたはTANGOバイオインフォマティクスアルゴリズムによって予測されたPIを形成する能力と固有の凝集傾向に関連して表された場合に観察されました。

PI形成バリアントは緑色で、非PI形成バリアントは赤色で示しています。この手順に続いて、ヨウ化プロピジウムやアネキシンV染色などの他の方法も実行して、細胞内発現タンパク質バリアントが細胞のアポトーシスや細胞毒性に与える影響を決定するなどの追加の質問に答えることができます。