ヒト増殖電位幹細胞からのナチュラルキラー細胞の作製
2023年1月13日
本プロトコルは、3Dおよび2D培養条件の両方で、軽度の細胞毒性を有するCD3−/CD45+CD56+細胞をヒト拡大電位幹細胞(hEPSC)から分化させる方法を示しています。これにより、複雑な微小環境を破壊することなく、日常的な表現型検証が可能になります。
重要性について言えば、拡張可能なソースからNK細胞を生成することは、癌免疫療法などのアプリケーションにとって重要です。この技術の利点は、通常のIP細胞の代わりに、より広い分化能を有する拡張潜在幹細胞を使用できることです。hEPSCの分化前のために、細胞が維持されていたhEPSC培地を除去し、1ミリリットルのDFK培地を添加する。
摂氏37度と5%の二酸化炭素で2〜3日間インキュベートします。胚様体の形成を確認するには、使用済みのDFK培地を除去した後、1ミリリットルのPBSで細胞を1回洗浄します。500マイクロリットルの0.05%トリプシンを加え、形態に基づいて、プレートを摂氏37度と5%二酸化炭素で3〜7分間インキュベートします。
トリプシンが除去されたら、2ミリリットルのDFK培地で細胞を回収した。細胞を300 Gで室温で3分間スピンダウンします。上清を除去した後、DFK培地1ミリリットルとY-276321マイクロリットルを加え、フリックして細胞を再懸濁する。
血球計算盤を使用して細胞をカウントし、細胞懸濁液をDFK培地およびY-27632で希釈して、培地25マイクロリットルあたり4, 000細胞を得る。10センチのペトリ皿のキャップに30〜40滴の細胞懸濁液を置き、液滴の蒸発を防ぐためにPBSを下の皿に注ぎます。キャップをそっとひっくり返して皿を覆い、摂氏37度と5%の二酸化炭素で3日間インキュベートします。
液滴から胚様体を採取するには、PBSを含む1ミリリットルのピペットを使用して、少量のPBSを液滴にポンプで送り込み、胚様体を含む培地を吸引します。次に、これらの胚様体を15ミリリットルのチューブに移し、室温で100Gで1分間回転させます。上清を除去した後、1ミリリットルの培地を加える A.採取した胚様体を非付着性の24ウェルプレートに移し、0日目と考えます。
胚様体の中胚葉パターン化を行うには、プレートを摂氏37度で5%二酸化炭素で3日間インキュベートします。2日目に、500マイクロリットルの使用済み培地Aを同じ容量の新しい培地Aと交換します。胚様体の血液内皮指定を行うには、ウェルから700マイクロリットルの培地Aを取り出し、同量の培地B.Cultureを7日間加え、2日ごとにハーフ培地を交換します。
パターン化された胚様体を空気/液体界面に移すには、プレートを少し傾けて胚様体が底部に凝集し、1ミリリットルのピペットを使用して、培地Bをできるだけ除去します。次に、残りの培地を吸引してピペットで胚体をピックアップし、24ウェルプレートのトランスウェルに移し、リンパ系前駆細胞の増殖を行うには、トランスウェルの下部コンパートメントに500マイクロリットルのNK-1培地を追加し、14日間培養し、1日おきに培地交換を行います。プレートをコーティングするには、コーティング材料をPBSで希釈し、12ウェルプレートの各ウェルに1ミリリットルの希釈コーティング溶液を加え、プレートの開口部をラッピングフィルムで覆います。
プレートを摂氏4度で一晩インキュベートします。200マイクロリットルのPBSをトランスウェルに加え、約5〜6回ゆっくりとピペットで上下させて、オルガノイドから放出された細胞を回収します。採取した細胞懸濁液を2ミリリットルのチューブに移し、室温で5分間500Gで細胞をスピンダウンします。
上清を除去した後、細胞を1ミリリットルのNK-1培地に再懸濁する。ウェルからすべてのコーティング溶液を取り出し、12ウェルプレートの各ウェルを1ミリリットルのPBSで2回洗浄します。次に、回収した細胞を1:2の比率で分割し、細胞懸濁液をコーティングされた12ウェルプレートに移します。
1ミリリットルのNK-1培地を加えて、各ウェルに1.5ミリリットルの培地が含まれるようにします。培地を交換するには、細胞を1〜2分間底に沈めます。次に、750マイクロリットルの培地を注意深く吸引し、前述のようにスピンダウンします。
上清を捨てた後、得られたペレットを5〜6回ピペッティングして750マイクロリットルのNK-1培地に再懸濁し、元のウェルに移します。本研究では、エンドポイントのhEPSC由来産物を分析しました。異なる時点で誘導された2つのバッチから3D培養系から解離した細胞の約15%はCD3陰性、CD56陽性であり、細胞の16%はCD45陽性、CD-56陽性であり、これは以前の試験で見られたCD3陰性、CD56陽性細胞の割合と一致しています。
2D培養系から採取した細胞におけるCD3陰性CD56陽性細胞の割合は30〜6%の範囲であった2D系からの18日目の培養中のhEPSC由来産物は、抗体刺激の2時間後に12%の細胞で異所性CD56およびCD107aの両方の発現を示し、採取された細胞の約28%がCD94陽性であった。 CD159a陽性。インビトロ分化産物を、ヒト赤白血病細胞K562に対する細胞毒性について試験した。腫瘍標的と3時間共培養した場合、分化産物はインターロイキン2非依存性永久細胞株NK92mi細胞と比較して軽度の細胞毒性を示します。
この方法に従って、T細胞、B細胞、赤血球などの細胞を生成することができる。
概要
本プロトコルでは、ヒト拡張能幹細胞（hEPSCs）から、3Dおよび2D培養の両方を用いて、軽度の細胞毒性を有するCD3−/CD45+CD56+細胞へと分化させる手法について詳述します。この手法により、複雑な微小環境を維持しながら、日常的な表現型の検証が可能になります。
研究の主要構成要素
科学分野
- 幹細胞生物学
- 細胞分化
- がん免疫療法
背景
- ヒト拡張能幹細胞（hEPSCs）は、さまざまな細胞型に分化することが可能です。
- ナチュラルキラー（NK）細胞は、がん免疫療法において極めて重要です。
- 従来の人工多能性幹細胞（iPSCs）は、hEPSCsと比較して制限があります。
- 分化プロセスを理解することは、治療への応用において不可欠です。
研究目的
- hEPSCからNK細胞を生成するための信頼性の高い手法を開発すること。
- 分化させた細胞の細胞傷害能を評価すること。
- 3D培養システムと2D培養システムの効率を比較検討すること。
使用された手法
- hEPSC培地を除去し、前分化用のDFK培地を添加する。
- 胚様体の形成と、それに続く特定培地での培養。
- さらなる解析のための細胞回収および再懸濁。
- K562ヒト赤白血病細胞に対する細胞毒性の評価。
主な結果
- 3D培養細胞の約15%がCD3−/CD56+であった。
- CD45+およびCD56+の細胞集団も同定された。
- 腫瘍標的細胞と共培養した際、細胞は軽度の細胞毒性を示した。
- 培養系によって、NK細胞マーカーの陽性率が異なっていた。
結論
- 本プロトコールにより、hEPSCからNK細胞を分化させることができた。
- 3D培養により、目的の細胞集団の回収率が向上する可能性がある。
- 分化能および機能性を最適化するためには、さらなる研究が必要である。
よくある質問
産業界における重要性
ヒト拡張能幹細胞（hEPSCs）からナチュラルキラー（NK）細胞を生成できる能力は、スケーラブルで定義された細胞毒性免疫エフェクターの供給源を提供することにより、免疫療法の研究開発における極めて重要なボトルネックを解消します。本プロトコルでは、3Dおよび2Dの両システムにおいて、表現型が検証されたNK細胞の製造が可能となり、初期段階のターゲット検証および機能スクリーニングを支援します。このアプローチは、細胞ベースの免疫療法戦略に対する予測信頼性を高め、リスク調整後のポートフォリオ推進をサポートします。
バイオファーマR&Dにおける戦略的応用
初期発見およびターゲットバリデーション
- 多能性ソースからのNK細胞分化経路の解析を可能にする。
- 制御されたin vitro環境において、免疫細胞ターゲットの機能的な検証をサポートする。
- 免疫細胞と腫瘍の相互作用をモデル化することで、メカニズム的なリスク低減を促進する。
- サイトカインカクテルが系統決定に与える影響を評価するためのプラットフォームを提供する。
スクリーニングおよびアッセイの開発
- ダウンストリームの細胞毒性試験に向けて、再現性のあるNK細胞集団を提供します。
- CD3、CD45、CD56、CD94、およびCD159aマーカーを用いた定量的な表現型検証をサポートします。
- 2Dおよび3D培養フォーマット間でのアッセイ標準化を可能にします。
- 化合物または生物学的製剤のスクリーニングワークフローに向けた、検証済み免疫エフェクターを調製します。
トランスレーショナル・前臨床研究
- in vitroで、腫瘍標的との疾患関連免疫細胞相互作用をモデル化します。
- マーカーベースの細胞追跡を可能にすることで、トランスレーショナルなバイオマーカー戦略と整合させます。
- 細胞療法の探索から前臨床検証までの継続性をサポートします。
- 免疫療法の候補物質を、リスク調整した形で進展させるための基盤を提供します。
パイプラインおよびワークフローの統合
この分化プロトコルは、機能アッセイ、メカニズム研究、およびトランスレーショナルモデリングに用いる検証済みNK細胞を提供することで、創薬から前臨床に至る一連の流れに組み込まれます。
- 発見生物学：NK細胞の系統決定および免疫エフェクター機能に関する仮説検証を支援します。
- スクリーニング：細胞毒性および機能解析のための、標準化され表現型が定義されたNK細胞を提供します。
- 分析：表面マーカーの定量測定および腫瘍標的に対する細胞毒性活性の測定を可能にします。
- トランスレーショナルリサーチ：細胞治療開発に向けたバイオマーカー駆動型戦略との整合性を促進します。
- エンタープライズ再利用：多能性ソースから免疫エフェクターを生成するための再利用可能なワークフローを確立します。
運用および企業への影響
- 科学的価値：免疫細胞の分化および機能における予測の信頼性を向上させる。
- 運用の価値：スケーラブルで無血清のプロトコルにより、NK細胞の製造を標準化する。
- 戦略的価値：生物学的リスクを低減し、免疫療法プログラムにおける十分な根拠に基づいたゴー/ノーゴー決定を支援する。
- ポートフォリオへの影響：細胞ベースの治療薬候補について、リスク調整後の優先順位付けを可能にする。
実施上の検討事項
- 幹細胞培養および免疫細胞のフェノタイピングに関する専門知識が必要です。
- マーカー検証のため、フローサイトメトリーおよびセルソーターの設備を利用できる必要があります。
- サイトカインカクテルおよび培養条件について、チーム間での標準化が必要です。
- 多様なアッセイニーズに応じて、2Dおよび3Dの両方のモデルシステムに適応可能です。
- 収量はバッチや培養形式によって異なる場合があるため、特定のアプリケーションに合わせた最適化が必要です。
