ヒト増殖電位幹細胞からのナチュラルキラー細胞の作製
January 13th, 2023
本プロトコルは、3Dおよび2D培養条件の両方で、軽度の細胞毒性を有するCD3−/CD45+CD56+細胞をヒト拡大電位幹細胞(hEPSC)から分化させる方法を示しています。これにより、複雑な微小環境を破壊することなく、日常的な表現型検証が可能になります。
重要性について言えば、拡張可能なソースからNK細胞を生成することは、癌免疫療法などのアプリケーションにとって重要です。この技術の利点は、通常のIP細胞の代わりに、より広い分化能を有する拡張潜在幹細胞を使用できることです。hEPSCの分化前のために、細胞が維持されていたhEPSC培地を除去し、1ミリリットルのDFK培地を添加する。
摂氏37度と5%の二酸化炭素で2〜3日間インキュベートします。胚様体の形成を確認するには、使用済みのDFK培地を除去した後、1ミリリットルのPBSで細胞を1回洗浄します。500マイクロリットルの0.05%トリプシンを加え、形態に基づいて、プレートを摂氏37度と5%二酸化炭素で3〜7分間インキュベートします。
トリプシンが除去されたら、2ミリリットルのDFK培地で細胞を回収した。細胞を300 Gで室温で3分間スピンダウンします。上清を除去した後、DFK培地1ミリリットルとY-276321マイクロリットルを加え、フリックして細胞を再懸濁する。
血球計算盤を使用して細胞をカウントし、細胞懸濁液をDFK培地およびY-27632で希釈して、培地25マイクロリットルあたり4, 000細胞を得る。10センチのペトリ皿のキャップに30〜40滴の細胞懸濁液を置き、液滴の蒸発を防ぐためにPBSを下の皿に注ぎます。キャップをそっとひっくり返して皿を覆い、摂氏37度と5%の二酸化炭素で3日間インキュベートします。
液滴から胚様体を採取するには、PBSを含む1ミリリットルのピペットを使用して、少量のPBSを液滴にポンプで送り込み、胚様体を含む培地を吸引します。次に、これらの胚様体を15ミリリットルのチューブに移し、室温で100Gで1分間回転させます。上清を除去した後、1ミリリットルの培地を加える A.採取した胚様体を非付着性の24ウェルプレートに移し、0日目と考えます。
胚様体の中胚葉パターン化を行うには、プレートを摂氏37度で5%二酸化炭素で3日間インキュベートします。2日目に、500マイクロリットルの使用済み培地Aを同じ容量の新しい培地Aと交換します。胚様体の血液内皮指定を行うには、ウェルから700マイクロリットルの培地Aを取り出し、同量の培地B.Cultureを7日間加え、2日ごとにハーフ培地を交換します。
パターン化された胚様体を空気/液体界面に移すには、プレートを少し傾けて胚様体が底部に凝集し、1ミリリットルのピペットを使用して、培地Bをできるだけ除去します。次に、残りの培地を吸引してピペットで胚体をピックアップし、24ウェルプレートのトランスウェルに移し、リンパ系前駆細胞の増殖を行うには、トランスウェルの下部コンパートメントに500マイクロリットルのNK-1培地を追加し、14日間培養し、1日おきに培地交換を行います。プレートをコーティングするには、コーティング材料をPBSで希釈し、12ウェルプレートの各ウェルに1ミリリットルの希釈コーティング溶液を加え、プレートの開口部をラッピングフィルムで覆います。
プレートを摂氏4度で一晩インキュベートします。200マイクロリットルのPBSをトランスウェルに加え、約5〜6回ゆっくりとピペットで上下させて、オルガノイドから放出された細胞を回収します。採取した細胞懸濁液を2ミリリットルのチューブに移し、室温で5分間500Gで細胞をスピンダウンします。
上清を除去した後、細胞を1ミリリットルのNK-1培地に再懸濁する。ウェルからすべてのコーティング溶液を取り出し、12ウェルプレートの各ウェルを1ミリリットルのPBSで2回洗浄します。次に、回収した細胞を1:2の比率で分割し、細胞懸濁液をコーティングされた12ウェルプレートに移します。
1ミリリットルのNK-1培地を加えて、各ウェルに1.5ミリリットルの培地が含まれるようにします。培地を交換するには、細胞を1〜2分間底に沈めます。次に、750マイクロリットルの培地を注意深く吸引し、前述のようにスピンダウンします。
上清を捨てた後、得られたペレットを5〜6回ピペッティングして750マイクロリットルのNK-1培地に再懸濁し、元のウェルに移します。本研究では、エンドポイントのhEPSC由来産物を分析しました。異なる時点で誘導された2つのバッチから3D培養系から解離した細胞の約15%はCD3陰性、CD56陽性であり、細胞の16%はCD45陽性、CD-56陽性であり、これは以前の試験で見られたCD3陰性、CD56陽性細胞の割合と一致しています。
2D培養系から採取した細胞におけるCD3陰性CD56陽性細胞の割合は30〜6%の範囲であった2D系からの18日目の培養中のhEPSC由来産物は、抗体刺激の2時間後に12%の細胞で異所性CD56およびCD107aの両方の発現を示し、採取された細胞の約28%がCD94陽性であった。 CD159a陽性。インビトロ分化産物を、ヒト赤白血病細胞K562に対する細胞毒性について試験した。腫瘍標的と3時間共培養した場合、分化産物はインターロイキン2非依存性永久細胞株NK92mi細胞と比較して軽度の細胞毒性を示します。
この方法に従って、T細胞、B細胞、赤血球などの細胞を生成することができる。
概要
このプロトコルは、3Dおよび2D培養における、ヒト拡張可能性幹細胞（hEPSCs）からの軽度の細胞毒性を持つCD3−/CD45+CD56+細胞の分化を詳細に説明しています。この方法は、複雑な微小環境を保持しながら、日常的な表現型検証を可能にします。
主要な研究構成要素
科学の分野
- 幹細胞生物学
- 細胞分化
- がん免疫療法
背景
- ヒト拡張可能性幹細胞（hEPSCs）は様々な細胞タイプに分化できます。
- 自然キラー（NK）細胞はがん免疫療法に重要です。
- 従来の誘導多能性幹細胞（iPSCs）はhEPSCsと比較して限界があります。
- 分化プロセスの理解は治療応用に不可欠です。
研究の目的
- hEPSCsからのNK細胞生成のための信頼性の高い方法を開発すること。
- 分化した細胞の細胞毒性ポテンシャルを評価すること。
- 3D対2D培養システムの効率性を評価すること。
使用された方法
- hEPSC培地の除去と、前分化のためのDFK培地の追加。
- 胚様体の形成と特定の培地でのその後の培養。
- さらなる分析のための細胞の収集と再懸濁。
- K562ヒト赤血球白血病細胞に対する細胞毒性の評価。
主な結果
- 3D培養からの細胞の約15%がCD3−/CD56+でした。
- CD45+およびCD56+細胞集団も識別されました。
- 細胞は腫瘍標的と共培養された際に軽度の細胞毒性を示しました。
- 異なる培養システムではNK細胞マーカーの割合が異なっていました。
結論
- このプロトコルはhEPSCsからのNK細胞の分化を成功裏に実現しました。
- 3D培養は望ましい細胞集団の収率を向上させる可能性があります。
- 分化と機能を最適化するにはさらなる研究が必要です。
よくある質問
Executive Industry Relevance
The ability to generate natural killer (NK) cells from human expanded potential stem cells (hEPSCs) addresses a critical bottleneck in immunotherapy R&D by providing a scalable, defined source of cytotoxic immune effectors. This protocol enables the production of phenotypically validated NK cells in both 3D and 2D systems, supporting early-stage target validation and functional screening. The approach enhances predictive confidence for cell-based immunotherapeutic strategies and supports risk-adjusted portfolio advancement.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of NK cell differentiation pathways from pluripotent sources.
- Supports functional validation of immune cell targets in a controlled in vitro setting.
- Facilitates mechanistic de-risking by modeling immune cell-tumor interactions.
- Provides a platform for evaluating the impact of cytokine cocktails on lineage specification.
Screening & Assay Development
- Delivers reproducible NK cell populations for downstream cytotoxicity assays.
- Supports quantitative phenotypic validation using CD3, CD45, CD56, CD94, and CD159a markers.
- Enables assay standardization across 2D and 3D culture formats.
- Prepares validated immune effectors for compound or biologic screening workflows.
Translational & Preclinical Research
- Models disease-relevant immune cell interactions with tumor targets in vitro.
- Aligns with translational biomarker strategies by enabling marker-based cell tracking.
- Supports continuity from discovery through preclinical validation of cell-based therapies.
- Provides a foundation for risk-adjusted advancement of immunotherapeutic candidates.
Pipeline & Workflow Integration
This differentiation protocol integrates into the discovery-to-preclinical continuum by supplying validated NK cells for functional assays, mechanistic studies, and translational modeling.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on NK cell lineage commitment and immune effector function.
- Screening: Provides standardized, phenotypically defined NK cells for cytotoxicity and functional assays.
- Analytics: Enables quantitative measurement of surface markers and cytotoxic activity against tumor targets.
- Translational Research: Facilitates alignment with biomarker-driven strategies for cell therapy development.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable workflow for generating immune effectors from pluripotent sources.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in immune cell differentiation and function.
- Operational Value: Standardizes NK cell production with scalable, serum-free protocols.
- Strategic Value: Reduces biological risk and supports informed go/no-go decisions for immunotherapy programs.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of cell-based therapeutic candidates.
Implementation Considerations
- Requires expertise in stem cell culture and immune cell phenotyping.
- Demands access to flow cytometry and cell sorting infrastructure for marker validation.
- Necessitates cross-team standardization of cytokine cocktails and culture conditions.
- Adaptable to both 2D and 3D model systems for diverse assay needs.
- Yields may vary between batches and culture formats, requiring optimization for specific applications.
