ヒト増殖電位幹細胞からのナチュラルキラー細胞の作製

本プロトコルは、3Dおよび2D培養条件の両方で、軽度の細胞毒性を有するCD3−/CD45+CD56+細胞をヒト拡大電位幹細胞(hEPSC)から分化させる方法を示しています。これにより、複雑な微小環境を破壊することなく、日常的な表現型検証が可能になります。

重要性について言えば、拡張可能なソースからNK細胞を生成することは、癌免疫療法などのアプリケーションにとって重要です。この技術の利点は、通常のIP細胞の代わりに、より広い分化能を有する拡張潜在幹細胞を使用できることです。hEPSCの分化前のために、細胞が維持されていたhEPSC培地を除去し、1ミリリットルのDFK培地を添加する。

摂氏37度と5%の二酸化炭素で2〜3日間インキュベートします。胚様体の形成を確認するには、使用済みのDFK培地を除去した後、1ミリリットルのPBSで細胞を1回洗浄します。500マイクロリットルの0.05%トリプシンを加え、形態に基づいて、プレートを摂氏37度と5%二酸化炭素で3〜7分間インキュベートします。

トリプシンが除去されたら、2ミリリットルのDFK培地で細胞を回収した。細胞を300 Gで室温で3分間スピンダウンします。上清を除去した後、DFK培地1ミリリットルとY-276321マイクロリットルを加え、フリックして細胞を再懸濁する。

血球計算盤を使用して細胞をカウントし、細胞懸濁液をDFK培地およびY-27632で希釈して、培地25マイクロリットルあたり4, 000細胞を得る。10センチのペトリ皿のキャップに30〜40滴の細胞懸濁液を置き、液滴の蒸発を防ぐためにPBSを下の皿に注ぎます。キャップをそっとひっくり返して皿を覆い、摂氏37度と5%の二酸化炭素で3日間インキュベートします。

液滴から胚様体を採取するには、PBSを含む1ミリリットルのピペットを使用して、少量のPBSを液滴にポンプで送り込み、胚様体を含む培地を吸引します。次に、これらの胚様体を15ミリリットルのチューブに移し、室温で100Gで1分間回転させます。上清を除去した後、1ミリリットルの培地を加える A.採取した胚様体を非付着性の24ウェルプレートに移し、0日目と考えます。

胚様体の中胚葉パターン化を行うには、プレートを摂氏37度で5%二酸化炭素で3日間インキュベートします。2日目に、500マイクロリットルの使用済み培地Aを同じ容量の新しい培地Aと交換します。胚様体の血液内皮指定を行うには、ウェルから700マイクロリットルの培地Aを取り出し、同量の培地B.Cultureを7日間加え、2日ごとにハーフ培地を交換します。

パターン化された胚様体を空気/液体界面に移すには、プレートを少し傾けて胚様体が底部に凝集し、1ミリリットルのピペットを使用して、培地Bをできるだけ除去します。次に、残りの培地を吸引してピペットで胚体をピックアップし、24ウェルプレートのトランスウェルに移し、リンパ系前駆細胞の増殖を行うには、トランスウェルの下部コンパートメントに500マイクロリットルのNK-1培地を追加し、14日間培養し、1日おきに培地交換を行います。プレートをコーティングするには、コーティング材料をPBSで希釈し、12ウェルプレートの各ウェルに1ミリリットルの希釈コーティング溶液を加え、プレートの開口部をラッピングフィルムで覆います。

プレートを摂氏4度で一晩インキュベートします。200マイクロリットルのPBSをトランスウェルに加え、約5〜6回ゆっくりとピペットで上下させて、オルガノイドから放出された細胞を回収します。採取した細胞懸濁液を2ミリリットルのチューブに移し、室温で5分間500Gで細胞をスピンダウンします。

上清を除去した後、細胞を1ミリリットルのNK-1培地に再懸濁する。ウェルからすべてのコーティング溶液を取り出し、12ウェルプレートの各ウェルを1ミリリットルのPBSで2回洗浄します。次に、回収した細胞を1:2の比率で分割し、細胞懸濁液をコーティングされた12ウェルプレートに移します。

1ミリリットルのNK-1培地を加えて、各ウェルに1.5ミリリットルの培地が含まれるようにします。培地を交換するには、細胞を1〜2分間底に沈めます。次に、750マイクロリットルの培地を注意深く吸引し、前述のようにスピンダウンします。

上清を捨てた後、得られたペレットを5〜6回ピペッティングして750マイクロリットルのNK-1培地に再懸濁し、元のウェルに移します。本研究では、エンドポイントのhEPSC由来産物を分析しました。異なる時点で誘導された2つのバッチから3D培養系から解離した細胞の約15%はCD3陰性、CD56陽性であり、細胞の16%はCD45陽性、CD-56陽性であり、これは以前の試験で見られたCD3陰性、CD56陽性細胞の割合と一致しています。

2D培養系から採取した細胞におけるCD3陰性CD56陽性細胞の割合は30〜6%の範囲であった2D系からの18日目の培養中のhEPSC由来産物は、抗体刺激の2時間後に12%の細胞で異所性CD56およびCD107aの両方の発現を示し、採取された細胞の約28%がCD94陽性であった。 CD159a陽性。インビトロ分化産物を、ヒト赤白血病細胞K562に対する細胞毒性について試験した。腫瘍標的と3時間共培養した場合、分化産物はインターロイキン2非依存性永久細胞株NK92mi細胞と比較して軽度の細胞毒性を示します。

この方法に従って、T細胞、B細胞、赤血球などの細胞を生成することができる。