Name: 膜結合型IL-21修飾B細胞株を用いたナチュラルキラー(NK)およびCAR-NK細胞増殖法 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-02-08T13:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 2 s
Description: 学ぼう、膜結合型IL-21を発現するEBV変形B細胞株をフィーダー細胞として用い、臍帯血・末梢血・組織由来のナチュラルキラー細胞およびCAR-NK細胞を効率的に増殖させる方法。高純度で機能的な細胞を大量に得られ、がん免疫療法への応用が期待されます。

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劉研究室のメンバー(シャンチー・ツェン博士、シュエニン・ワン博士、チェン・チーシュン博士)の原稿へのコメントに感謝します。SFGベクターのジャンピエトロ・ドッティ博士と721.221細胞のエリック・ロング博士に感謝します。この作業は、HL125018(D. Liu)、AI124769(D. Liu)、AI129594(D. Liu)、AI130197(D. Liu)、およびRutgers-Health Advance Funding(NIH REACHプログラム)、U01HL150852(R. Panettieri、S. Libutti、およびR. Pasqualini)、S10OD025182(D. Liu)、およびRutgers University-New Jersey Medical School Startup Fund for D. Liu Labの支援を受けた。

このプロトコルのヒト組織および血液関連の作業は、ラトガース大学治験審査委員会(IRB)のガイドラインに従います。
1.図1に示すように、肝臓組織からのNK細胞増殖(0日目)。
注:初期細胞数と生存率は、臓器摘出からの時間と初期組織サンプル量と強く相関しています。しかし、組織を30 mLのハンクスバランス塩溶液(HBSS)に入れ、氷上または冷蔵庫で4°Cで一晩保持した場合、NK細胞は24時間後まで高純度および生存率で増殖することができます。
<ol><li>無菌手術器具を使用して組織および切片からリンパ球を取得するために、生存可能な組織領域を特定します。</li>
	<li>組織を30 mLのHBSS(カルシウムまたはマグネシウムなし)に入れ、分離の準備ができるまで氷上に保ちます。</li>
	<li>バイオセーフティキャビネット内の滅菌かみそりの刃またははさみと鉗子を使用して、組織を<0.5cmの立方体にミンチします。</li>
	<li>10x ストックをHBSSで希釈して、1x コラゲナーゼ IV 溶液 (1 mg/mL) を調製します (10x コラゲナーゼ IV: 10 mg/mL または ~200 U/mL)。</li>
	<li>ミンチ組織片を組織解離管に入れます。チューブに4 g以下の組織を満たし、組織片を~10 mLの1xコラゲナーゼIVに浸します。 注:DNase Iの使用は、NKの生存率と収量をわずかに低下させる可能性があるため、お勧めしません。使用する特定の組織解離管については、 材料表 を参照してください。</li>
	<li>組織解離管を組織解離管に入れ、37°Cでブレンドして組織を完全にミンチします。 注意: 肝臓組織の場合、これには30分以上かかる場合があります。より砕けやすい組織の場合、約15分で十分な場合があります。特定の組織解離剤チューブおよび使用される組織解離剤については、 材料表 を参照してください。</li>
	<li>組織解離チューブを取り外し、5 mLシリンジのバックエンドを使用して40 μmナイロンセルストレーナーを通して粉砕します。溶離液を回収し、大きな未消化の断片を廃棄します。</li>
	<li>溶離液を400 x g で室温で5分間スピンダウンします。上澄み液を吸引する。</li>
	<li>細胞ペレットを30%ポリビニルピロリドン(PVP)コーティングシリカに再懸濁して、最終的なリンパ球画分を汚染する脂肪細胞を除去します。<ol><li>1x PVP被覆シリカを調製するには、10x PBS中のPVP被覆シリカの9:1希釈を使用します。 注意: 使用される特定のPVPコーティングシリカについては、 材料表 を参照してください。</li>
		<li>30%PVPコーティングシリカを調製するには、PVPコーティングシリカ1xをPBS / HBSSで希釈します。</li>
	</ol></li>
	<li>セルペレットを400 x g で室温で5分間スピンダウンします。上澄み液を吸引する。</li>
	<li>細胞ペレットを9 mLのR-10培地に再懸濁します。 注:R-10メディアの構成については、 材料表 を参照してください。</li>
	<li>細胞懸濁液を4 mLのFicollまたはリンパ球分離培地に注意深く重ねて、赤血球および多形核細胞からリンパ球を分離します。</li>
	<li>加速とブレーキをオフまたは最低設定で室温で400 x g で23分間遠心分離することにより、層を分離します。上層から中層を注意深くデカントし、組織浸潤リンパ球を含む間期を採取します。</li>
	<li>細胞を10 mLの培地ですすぎ、細胞計数、フローサイトメトリー、細胞の分注と凍結、または一次NK増殖プロトコルに進みます。</li>
</ol>2. 図2に示すように、PBMC(またはCBまたは臓器組織)からの初代NK細胞増殖(0日目)。
<ol><li>凍結したPBMCと凍結したフィーダーセルを解凍し、37°Cの水浴中で照射した。</li>
	<li>PBMCと100ガンマ線照射(Gy照射)221-mIL-21細胞を、10 mLのR-10培地で400 x g で5分間遠心分離して洗浄します。</li>
	<li>フローサイトメトリー用にPBMCの1 x 106 細胞を保存します。 注:初期のNK細胞の純度は、NK細胞の増殖率を計算する上で重要な要素です。</li>
	<li>細胞を1 mLのR-10培地に再懸濁します。トリパンブルーを使用して細胞をカウントします。</li>
	<li>PBMCの5x 10 6セルと100 Gy照射221-mIL-21セルの10 x 10 6セルを特別な6ウェルプレートで混合します(材料の表を参照)。</li>
	<li>ヒトIL-2(200 U / mL)およびヒトIL-15(5 ng / mL)を添加した30 mLのR-10培地を追加します( 材料の表を参照)。</li>
	<li>特殊な6ウェルプレートを5%CO2で37°Cでインキュベートします。</li>
	<li>培地をヒトIL-2(200 U/mL)およびヒトIL-15(5 ng/mL)を添加したR-10培地に交換し、3〜4日ごとにNK細胞を維持します。 注:培地交換のたびにさらに拡張できるように、ウェルあたり20 x 106 セル未満に維持してください。最良の生存率を得るには、各ウェルの合計細胞数が100 x 106 細胞を超えないようにしてください。</li>
	<li>総細胞数、生存率を記録し、3〜4日毎にフローサイトメトリーを行い、NK細胞増殖率を算出した。</li>
</ol>3. 図2に示すように、293T細胞の付着( 2日目)。
<ol><li>処理した100 mmプレートあたり1.8 x 106 293T細胞を11 mLのD-10培地で分割します。 注意: D-10メディアの構成については、 材料表 を参照してください。</li>
	<li>293T細胞を5%CO2で37°Cでインキュベートします。</li>
</ol>4. レトロウイルストランスフェクション(3日目)
<ol><li>1.7 mLチューブ中で、470 μLの還元血清培地と30 μLのトランスフェクション試薬を混合します。 注:使用する特定の還元血清培地およびトランスフェクション試薬については、 材料表 を参照してください。</li>
	<li>別の1.7 mLチューブに、SFGベクター中の2.5 μgのpRDFプラスミド、3.75 μgのPegpam3プラスミド、および2.5 μgのCARコンストラクトを還元血清培地に加え、最終容量が500 μLになるようにします。</li>
	<li>手順4.1と4.2の溶液を滴下して混合します。</li>
	<li>チューブを室温で15分間インキュベートします。</li>
	<li>ステップ4.4の混合物を1日目に293T細胞プレートに滴下して加えます。</li>
	<li>プレートを5%CO2で37°Cで48〜72 時間インキュベートします。</li>
</ol>5.レトロネクチンプレートコーティング(3日目)
<ol><li>リン酸緩衝生理食塩水(PBS)でレトロネクチンタンパク質を最終濃度50〜100 μg / mLに希釈します。</li>
	<li>500 μLの希釈レトロネクチンを未処理の24ウェルプレートの各ウェル(CARコンストラクトあたり5ウェル)に追加します。パラフィルムを使用してプレートを密封し、プレートを4°Cで一晩インキュベートします。</li>
</ol>6.形質導入(4日目)
<ol><li>レトロネクチンプレートを2103 x g で4°Cで30分間遠心分離します。 上澄み液を捨てる。</li>
	<li>24ウェルプレートの各ウェルを1 mLのR-10培地でブロックします。</li>
	<li>プレートを5%CO2 で37°Cで1時間インキュベートします。</li>
	<li>レトロネクチンプレートがブロックされている間、遠心分離機を32°Cに予熱します。</li>
	<li>トランスフェクトされた293T細胞を0.45 μmフィルターでろ過し、レトロウイルス上清を収集します。</li>
	<li>ろ過したレトロウイルス上清2 mLを各ウェルに分注します。</li>
	<li>24ウェルプレートを2103 x g で32°Cで2時間遠心分離します。</li>
	<li>プレート遠心分離中に、0日目から増殖PBNK細胞を回収し、トリパンブルーを使用して細胞をカウントします。 注:IL-2(200 U / mL)およびIL-15(5 ng / mL)を添加したR-10培地を追加して、PBNK細胞を引き続き増殖させます。</li>
	<li>IL-2(200 U/mL)およびIL-15(5 ng/mL)を添加したR-10培地で、増殖したPBNK細胞を2.5 x 10 5-5 x 10 5細胞/mL(ウェルあたり0.5 x 10 6-1 x10 6細胞)に希釈します。 注:総細胞数、生存率を記録し、5 x 105 増殖PBNK細胞はNK細胞増殖率を決定する上で重要であるため、フローサイトメトリー用に保存してください。</li>
	<li>遠心分離後、各ウェルからレトロウイルス上清を部分的に吸引する。 注:完全に吸引しないでください、すなわち、ウェルあたり約100μLのレトロウイルス上清を残すと、形質導入効率が低下します。</li>
	<li>ステップ6.8から希釈した増殖PBNK細胞2mLを各ウェルに分注する。</li>
	<li>プレートを600 x g で32°Cで10分間遠心分離します。 プレートを5%CO2 で37°Cで48〜72時間インキュベートします。 注意: プレートをパラフィルムしないでください。</li>
</ol>7. 図2に示すように、CAR-NK細胞収集(6日目または7日目)。
<ol><li>24ウェルプレートから細胞を静かに回収し、50 mLの遠沈管に移します。 注:気泡を生成しないようにしてください, これは細胞の生存率の低下をもたらすので.</li>
	<li>チューブを400 x g で5分間遠心分離します。</li>
	<li>ペレットを1 mLのR-10培地で再懸濁し、トリパンブルーを使用して細胞をカウントします。 注:フローサイトメトリー用に5 x 105 細胞を保存して、形質導入効率を測定します。</li>
	<li>再懸濁した細胞を、IL-2(200 U/mL)およびIL-15(5 ng/mL)を添加した30 mLのR-10培地を含む特別な6ウェルプレートに移します。</li>
	<li>特殊な6ウェルプレートを5%CO2で37°Cでインキュベートします。</li>
	<li>IL-2(200 U/mL)およびIL-15(5 ng/mL)を添加したR-10培地を交換して、3〜4日ごとにNK細胞を維持します。 注:ウェルあたり20 x 106 セル未満に維持し、各変更でさらに拡張します。最良の生存率を得るには、各ウェルの合計細胞数が100 x 106 細胞を超えないようにしてください。</li>
	<li>総細胞数、生存率を記録し、3〜4日毎にフローサイトメトリーを行い、NK細胞増殖率を算出した。</li>
	<li>適切なインビトロまたはインビボアッセイに細胞を使用してください。 注: ex vivo で増殖したPBNK細胞およびCAR-NK細胞は、37°Cのインキュベーターで約4週間培養できます。</li>
	<li>フローサイトメトリーにより、7日目、11日目、14日目、18日目、および21日目のNK細胞数と純度を調べます。</li>
</ol>

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</ol>

著者は競合する利益を宣言しません。

臨床試験中の現在のCAR-NK製品のほとんどは、非ホジキンリンパ腫患者18から単離された細胞株であるNK-92、NK-92MI、IL-2非依存性NK-92細胞株19、および大きな顆粒リンパ球患者20から分離されたNKLなどのNK細胞株17を利用しています。しかしながら、これらの細胞株、例えばNK-92細胞は、注入前の照射を必要とするため、限界的な臨床効果およびin vivo増殖を有し、したがって、インビボでの増殖および細胞毒性を制限する21。これらの理由から、末梢血、CB、骨髄(BM)、ヒト胚性幹細胞(HSC)、人工多能性幹細胞(iPSC)、および腫瘍組織を含むいくつかのソースから初代NK細胞を拡張するためのさまざまな戦略が現在検討されています21,22,23。例えば、NK細胞は、IL-15、IL-18、およびIL-21を含むインターロイキンを使用してex vivoで増殖させることができる。K562細胞などのリンパ芽球様細胞株または721.221細胞などのエプスタインバーウイルス形質転換リンパ芽球様細胞株も、NK細胞増殖に使用される16。しかしながら、前述の戦略は、CAR-NK免疫療法の養子移入のために不十分な数のNK細胞を生成することが多い22,24。この問題を解決するために、この研究では、遺伝子組み換えEBV形質転換細胞株である221-mIL-21フィーダー細胞を使用したex vivo NK細胞増殖のプロトコルを示しています。
このプロトコルに示されている221-mIL-21フィーダー細胞を用いた拡張方法論は、HL-60およびOCl-AML3発現膜IL-21、K562、およびOX40リガンド22、24、25を発現するK652-mIL21を含む他の白血病細胞株よりも少なくとも10〜100倍高い増殖率でNK細胞を増殖するように最適化されています。CAR発現は、エクスビボで約2週間評価されます。さらに重要なことに、221-mIL-21フィーダー細胞増殖戦略は、最初のNK濃縮ステップなしで、PBMC、CB、および肝臓などの固形器官を含むさまざまなソースからNK細胞を拡張するために適用できます。221-mIL-21フィーダーシステムは、前述のフィーダー細胞株ほどドナー依存性ではありませんが、ドナーから完全に独立しているわけではありません。平均して、221-mIL-21増殖系は、高いNK細胞数でNK細胞純度の90%を達成でき、増殖後14日目にはT細胞汚染の約<5%を達成できます。したがって、T細胞汚染の可能性を排除するには、ex vivo拡張前に得られたサンプルからNK細胞を単離するか、CD3+選択システムを使用してex vivo拡張後にT細胞を排除する必要があります。 
NK細胞増殖システムを使用する際の批判の1つは、フィーダー細胞が拡張後または輸血前に完全に根絶されていない可能性があることであり、これは重大な規制上の懸念を有する可能性がある。したがって、輸血前にフィーダー細胞を完全に根絶することが重要です。しかし、K562-mIL21-4-1BBLフィーダー細胞をex vivoCBNK細胞増殖に使用した最近のCAR-NK臨床試験24,25では、合併症に関するものは示されなかった。さらに、我々の予備データは、照射された221-mIL-21個体群が拡大が進むにつれて徐々に減少することを示した(データ未掲載)。ただし、この拡張方法を臨床現場で実施するには、より広範な研究が必要です。まとめると、221-mIL-21増殖システムは、初代CAR-NK細胞の増殖という課題を解決するのに役立ち、したがって、近い将来、CAR-NK細胞ベースの免疫療法のより広範な使用に大きく貢献します。

ナチュラルキラー(NK)細胞は、CD56を発現し、T細胞マーカーであるCD3 1,2の発現を欠くリンパ球の重要なサブセットです。従来のNK細胞は、ウイルス感染細胞やがん細胞の免疫監視を担う自然免疫細胞に分類される。T細胞とは異なり、NK細胞は、CD16または他の活性化受容体を使用して感染細胞または悪性細胞を認識し、抗原ペプチドと主要組織適合遺伝子複合体(MHC)クラスI分子との間の複合体の形成を必要としない3,4。再発または難治性のCD19陽性がん(非ホジキンリンパ腫または慢性リンパ性白血病[CLL])を治療するためにキメラ抗原受容体(CAR)-NK細胞を使用する最近の臨床研究では、CAR-NK細胞の優れた安全性の利点が示されました5。たとえば、CAR-NK細胞注入は、移植片対宿主病(GVHD)、神経毒性、心毒性、およびサイトカイン放出症候群(CRS)6,7,8,9,10に関連しています。しかし、ヒトNK細胞を増殖させる従来の方法では、強力な殺ダニ剤とテロメア不足を伴う網羅的な表現型を示し、養子免疫療法に十分な数の機能的なNK細胞を得る上で大きな課題となっています11。
これらの課題を克服するために、MHCクラスI分子3の発現が低いヒトBリンパ芽球様細胞株である721.221(以下、221)細胞株を用いて、未分画末梢血単核細胞(PBMC)または臍帯血(CB)から直接初代NK細胞を増殖させる方法を開発した。以前の研究では、NK細胞増殖におけるIL-21の重要性が示されました。したがって、721.221細胞株のバージョン(今から221-mIL-21)を発現する遺伝子操作された膜結合IL-21が開発されました11、12、13、14、15。その結果、221-mIL-21フィーダー細胞増殖初代NK細胞は、約2〜3週間にわたって高いNK細胞純度を維持しながら平均>40,000倍に増殖したことが示されました。このプロトコルの適用に関する追加情報は、Yangら16に見出すことができる。
このプロトコルは、PBNK、CBNK、組織由来NK、およびCAR-NK細胞のエクス ビボでの新規増殖の段階的な手順を実証することを目的としています。

<table><tbody><tr><td>100 mm表面処理滅菌組織培養皿</td><td>VWR</td><td>10062-880</td><td>トランスフェクション</td></tr><tr><td>用 293T細胞</td><td>ATCC</td><td>CRL-3216</td><td>トランスフェクション用</td></tr><tr><td>6ウェルG-REXプレート</td><td>ウィルソンウルフ</td><td>80240M</td><td>NK細胞増殖用</td></tr><tr><td>AF647結合型 AffiniPure F(ab')2フラグメントヤギ抗ヒトIgG (H + L)</td> <td>Jackson ImmunoResearch</td><td>109-606-088</td><td>フロー用</td></tr><tr><td>SFGベクターのサイトメトリーCARコンストラクト</td><td>Dongfang Liu博士の研究室</td><td></td>で生成 <td>トランスフェクション用</td></tr><tr><td>コラゲナーゼIV</td><td>Σ</td><td>C4-22-1G</td><td>TIL単離用</td></tr><tr><td>凍結保存培地 成分:ウシ胎児血清(FBS)</td><td>コーニング</td><td>35-010-CV</td><td>90%</td></tr><tr><td>凍結保存培地 成分:ジメチルスルホキシド(DMSO)</td><td>Sigma</td><td>D2050</td><td>10%</td></tr><tr><td>D-10 media 成分:DMEM</td><td>VWR</td><td>45000-304</td><td></td></tr><tr><td>D-10 media 成分:ウシ胎児血清(FBS)</td><td>Corning</td><td>35-010-CV</td><td>10%</td></tr><tr><td>D-10 media 成分:ペニシリン ストレプトマイシン</td><td>VWR</td><td>45000-652</td><td>1%</td></tr><tr><td>FastFlow &低結合 Millipore Express PES メンブレン</td><td>Millex</td><td>SLHPR33RB</td><td>形質導入用</td></tr><tr><td>Genejuice トランスフェクション試薬</td><td>VWR</td><td>80611-356</td><td>トランスフェクション</td></tr><tr><td>用 gentleMACS C-tubes</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-237</td><td>TILs アイソレーション</td></tr><tr><td>用 gentleMACS Octo</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>TILs アイソレーションの</td><td></td></tr><tr><td>見積もり ハンクの平衡塩溶液 (HBSS - w/oカルシウムまたはマグネシウム)</td> <td>ThermoFisher</td><td>14170120</td><td>TILsの分離のために</td></tr><tr><td>人間IL-15</td><td>Peprotech</td><td>200-15</td><td>NK細胞の増殖のために</td></tr><tr><td>人間IL-2</td><td>Peprotech</td><td>200-02</td><td>NK細胞の増殖</td></tr><tr><td>のために 照射された221-mIL21フィーダー細胞</td><td>Dongfang Liu博士の研究室</td><td></td>で生成 <td>凍結保存培地で凍結</td></tr><tr><td>リンパ球分離培地</td><td>Corning</td><td>25-072-CV</td><td>TILs単離用</td></tr><tr><td>OPTI-MEM</td><td>ThermoFisher</td><td>31895</td><td>トランスフェクション</td></tr><tr><td>用 PE 抗ヒト CD3クローン HIT3a</td><td>バイオレジェンド</td><td>300308</td><td>フローサイトメトリー用</td></tr><tr><td>PE/Cy7 抗ヒト CD56 (NCAM) クローン 5.1H11</td><td>バイオレジェンド</td><td>362509</td><td>フローサイトメトリー用</td></tr><tr><td>Pegpam3 プラスミド</td><td>Dongfang Liu博士の研究室</td><td></td>で生成<td>トランスフェクション</td></tr><tr><td>Percoll</td><td>GE Healthcare</td><td>17089101</td><td>TILs単離用</td></tr><tr><td>末梢血単核細胞(PBMC)</td><td>ニューヨーク血液センター</td><td></td><td>健康なドナーの血漿から単離され、凍結保存培地で凍結</td></tr><tr><td>リン酸緩衝生理食塩水(PBS)</td><td>Corning</td><td>21-040-CV</td><td>トランスダクション</td></tr><tr><td>pRDFプラスミド</td>用 <td>Dongfang Liu博士の研究室</td><td></td>で生成<td>トランスフェクション用</td></tr><tr><td>R-10 media 成分: RPMI 1640</td><td>VWR</td><td>45000-404</td><td></td></tr><tr><td>R-10 media 成分: L-グルタミン</td><td>VWR</td><td>45000-304</td><td>1%</td></tr><tr><td>R-10 media 成分: ペニシリン ストレプトマイシン</td><td>VWR</td><td>45000-652</td><td>1%</td></tr><tr><td>R-10 media 成分: ウシ胎児血清 (FBS)</td> <td>Corning</td><td>35-010-CV</td><td>10%</td></tr><tr><td>レトロネクチン</td><td>Dongfang Liu博士の研究室で生成</td><td>自家製</td><td>形質導入用</td></tr><tr><td>トリパンブルー</td><td>コーニング</td><td>25-900-Cl</td><td>細胞計数用</td></tr><tr><td>未処理の24ウェルプレート</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>13-690-071</td><td>形質導入用</td></tr></tbody></table>

膜結合型il-21修飾b細胞株を用いたナチュラルキラー(nk)およびcar-nk細胞増殖法

Natural Killer (NK) and CAR-NK Cell Expansion Method using Membrane Bound-IL-21-Modified B Cell Line

キメラ抗原受容体(CAR)修飾免疫細胞療法は、癌や感染症の新たな治療法となっています。NKベースの免疫療法、特にCAR-NK細胞は、生命を脅かす重篤な毒性のない最も有望な「既製」開発の1つです。しかし、CAR-NK療法を成功させるためのボトルネックは、第三者から十分な数の非網羅的で長寿命の「既製の」CAR-NK細胞を達成することです。ここでは、遺伝子改変膜型のインターロイキン-21(IL-21)を発現するエプスタイン・バーウイルス(EBV)形質転換B細胞株を用いた新しいCAR-NK増殖法を開発しました。このプロトコルでは、臍帯血および末梢血、ならびに固形臓器組織からNKおよびCAR-NK細胞を拡張するための段階的な手順が提供されています。この研究は、CAR-NK免疫療法の臨床開発を大幅に強化します。

221-mIL-21フィーダー細胞法を用いた組織浸潤NK細胞単離およびPBNK細胞増殖の概略ワークフローを図1および図2に示します。増殖したPBNK細胞をフローサイトメトリーのために3または4日ごとに回収し、細胞を抗ヒトCD56および抗ヒトCD3で染色することによってNK細胞純度を決定した。膨張系の再現性を示すために、2つの異なるドナーを用いて実験を繰り返した(図3)。221-mIL-21によって拡大されたPBNK細胞は、ほぼ5×10から4倍に拡大することが示された(図3A)。さらに、NK細胞の純度は、21日間の増殖を通して約85%と高度に維持された(図3B)。221-mIL-21フィーダー細胞増殖系を用いて、NK細胞の純度は、ドナーとは無関係に一貫して85%〜95%の範囲であった(データ示さず)。221-mIL-21増殖系の頑健性を実証するために、PBMCは増殖前に抗CD56および抗CD3について染色され、NK細胞で7.09%の細胞純度と高い割合のT細胞を示しました(図4A)。PBMCを221-mIL-21と共培養してNK細胞を増殖させた。NK純度は、4日目のCAR-NK形質導入の前にチェックされました(図4A)。CAR-NK細胞を回収し、抗CD56、抗CD3、抗hIgG(H+L)F(ab')2について染色したところ、NK細胞集団が高く(7日目に86.9%)、CAR導入効率が約70%と高かった(図4)。より高い形質導入効率(最大95%)も、レトロウイルスパッケージングシステムを使用して観察されました。全体として、これらのデータは、221-mIL-21フィーダー細胞がNK細胞を正常に増殖させ、NK細胞の純度をex vivoで維持できることを示しています。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62336/62336fig01.jpg"> 図1:固体ヒト臓器サンプルからのNK細胞増殖の図。 簡単に言えば、得られたヒト肝臓サンプルは、機械的消化のために小さな立方体にミンチされる。次に、解離した細胞をPVPコーティングシリカとリンパ球分離培地を使用して単離します。さらに、NK細胞は、図2に記載の拡張プロトコルを用いて増殖される。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62336/62336fig01large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62336/62336fig02.jpg"> 図2:PBMCからのCAR-NK細胞生成の概略ワークフロー。 簡単に説明すると、221-mIL21フィーダー細胞を、IL-2およびIL-15を添加したPBMCと共培養する前に0日目に100Gyで照射した。並行して、293T細胞をレトロウイルスパッケージングシステムでトランスフェクトしてCARレトロウイルスを産生し、IL-2およびIL-15の存在下で増殖PBNK細胞に形質導入しました。初代CAR-NK細胞を7日目に回収し、21日間増殖を続けた。この図はYangら16から修正されたものである。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62336/62336fig02large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62336/62336fig03.jpg"> 図3:PBNK細胞の動的タイムラプス増殖 。 (A)22日間の時間経過中のPBNKの倍拡大。細胞を、フローサイトメトリーのために指示された日に抗CD56および抗CD3で染色した。NK細胞の総数は、全細胞数にNK細胞の純度を乗じることにより求めた。拡大率は以下のようにして生成した:(NK細胞数)Tn/(NK細胞数)T0、ここでNK細胞数=(NK細胞純度の割合)×(全細胞数)、T0 は時刻0日目におけるNK細胞数、Tnは時刻nにおけるNK細胞数である。 (B)22日間の経時変化におけるNK細胞純度。NK細胞増殖を2つの異なるドナーで2回繰り返した。エラーバー±SEMを表します。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62336/62336fig03large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62336/62336fig04.jpg"> 図4:CAR-NK細胞の代表的なフローサイトメトリー解析。 (A)18日間のコース中のCAR-NK細胞のNK細胞純度の動的タイムラプスを示す代表的なドットプロット。フローサイトメトリー分析は、示された時点で細胞を抗CD56および抗CD3で染色することによって評価した。0日目はPBNKの事前拡張を示します。4日目は、PBNKの増殖後およびCAR-NK細胞の形質導入前を示します。7日目は、CAR-NK細胞の形質導入後を示す。(B)レトロウイルスパッケージングシステムを用いたCAR-NK細胞の形質導入効率を示す代表的なドットプロット。フローサイトメトリーでは、細胞を抗CD56、抗CD3、および抗hIgG(H+L)F(ab')2で染色しました。(C)18日目のCD56+CD3-、CD56-CD3+、CD56+CD3+、およびCD56-CD3-を含む様々なサブセットにおけるCAR発現を示す代表的なドットプロット。細胞をフローサイトメトリーのために抗CD56、抗CD3、および抗hIgG(H+L)F(ab')2(CAR発現を示す)で染色した。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62336/62336fig04large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>

ここでは、末梢血ナチュラルキラー(PBNK)、肝臓組織からのNK細胞、末梢血単核球(PBMC)または臍帯血(CB)に由来するキメラ抗原受容体(CAR)-NK細胞を拡大する方法を紹介します。このプロトコルは、増殖したNK細胞の最適化された純度に加えて、221-mIL-21フィーダー細胞を使用したNKおよびCAR-NK細胞の増殖を実証します。

膜結合型IL-21修飾B細胞株を用いたナチュラルキラー(NK)およびCAR-NK細胞増殖法

Chimeric antigen receptor (CAR)-modified immune cell therapy has become an emerging treatment for cancers and infectious diseases. NK-based immunotherapy, ...

このプロトコルは、拡張系に基づく他のフィーダー細胞と比較して、機能的で非網羅的なメモリー様NK細胞のエクスビボでの増殖を有意に改善することができる。これは、NK細胞増殖前のNK細胞単離ステップをスキップするフィーダー細胞を使用する他のプロトコルと比較して、より簡単な方法です。このプロトコールは、免疫療法のために十分な数のNK細胞およびCAR-NKを提供することができる。この手法は再現性が高いです。ただし、新鮮で新しい出発物質を使用し、増殖の最初の数日間はNK細胞を乱さないように注意することが重要です。まず、無菌手術器具を使用して生存組織領域を特定して切片化し、リンパ球を取得します。次に、切片化した組織をカルシウムまたはマグネシウムを含まない30ミリリットルのHBSSに入れ、分離の準備ができるまで組織を氷上に置いておきます。バイオセーフティキャビネット内で作業し、滅菌かみそりの刃と鉗子で組織を0.5センチメートル未満の立方体に細かく刻みます。細かく刻んだ組織片を4グラム以下の組織解離管に入れ、10ミリリットルのコラゲナーゼIVを組織片に加えます。組織を完全にミンチするには、組織解離剤チューブを摂氏37度の組織解離剤に処理します。組織解離剤からチューブを取り外した後、5ミリリットルのシリンジのバックエンドを使用して、40ミクロンのナイロンセルストレーナーを通してミンチ組織を粉砕します。大きな未消化の断片を捨てます。採取した溶離液を室温で400Gで5分間スピンダウンし、上清を吸引してから、細胞ペレットを30%ポリビニルピロリドンコーティングシリカに再懸濁して脂肪細胞を除去します。説明に従って細胞をスピンダウンしてから、細胞ペレットを9ミリリットルのR-10培地に再懸濁します。赤血球および多形核細胞からリンパ球を分離するには、細胞懸濁液を4ミリリットルのFicollまたはリンパ球分離培地に注意深く重ねます。加速とブレーキをオフにして、室温で400Gで23分間遠心分離して層を分離します。次に、上層から中層を注意深くデカントし、組織浸潤リンパ球を含む間期を採取します。細胞を10ミリリットルの培地ですすぎ、分析または一次ナチュラルキラー(NK)細胞増殖プロトコルに進みます。末梢血単核球(PBMC)と100個のガンマ線照射された221-mIL-21細胞を、10ミリリットルのR-10培地で400Gで5分間遠心分離することにより別々に洗浄します。遠心分離後、フローサイトメトリー用に1 x 10を6番目のPBMCに保存し、5 x 10を6番目のPBMCに10 x 10から6番目の100ガンマ線照射221-mIL-21細胞を特別な6ウェルプレートで混合します。ヒトインターロイキン-2とヒトインターロイキン-15を添加した30ミリリットルのR-10培地を同じ6ウェルプレートに加え、37°Cで5%二酸化炭素でプレートをインキュベートし、3〜4日ごとに培地を交換します。インキュベーション中、全末梢血ナチュラルキラー(PBNK)の細胞生存率を記録し、3〜4日ごとにフローサイトメトリーを実行してNK細胞増殖率を算出する。処理した100ミリメートルプレートあたり11ミリリットルのD-10培地中の6番目の293T細胞に1.8 x 10を加え、293T細胞を摂氏37度で5%二酸化炭素でインキュベートします。1.70ミリリットルのチューブで、470マイクロリットルの還元血清培地を30マイクロリットルのトランスフェクション試薬と混合します。別の1.70ミリリットルのチューブに、SFGベクター中の2.5マイクログラムのpRDFプラスミド、3.75マイクログラムのPegpam3プラスミド、および2.5マイクログラムのCARコンストラクトを還元血清培地に加え、最終容量500マイクロリットルにします。チューブの内容物を、前に準備した1.70ミリリットルのチューブと滴下して混合します。室温で15分間インキュベートした後、1ミリリットルの混合物をチューブから293Tセルプレートに滴下して加え、プレートを5%二酸化炭素を含む摂氏37度に48〜72時間置きます。レトロネクチンタンパク質をPBSでミリリットル当たり50〜100マイクログラムの最終濃度に希釈する。500マイクロリットルの希釈レトロネクチンを未処理の24ウェルプレートの各ウェルに加える。次に、パラフィルムを使用してプレートを密封し、プレートを摂氏4度で一晩インキュベートします。翌日、レトロネクチンプレートを摂氏4度で30分間2、103Gで遠心分離し、上清を廃棄する。24ウェルプレートの各ウェルを1ミリリットルのR-10培地でブロッキングした後、プレートを摂氏37度で5%二酸化炭素で1時間インキュベートします。0.45ミクロンのフィルターを使用して以前にトランスフェクトした293T細胞をろ過し、レトロウイルス上清を収集します。濾過したレトロウイルス上清2ミリリットルを24ウェルレトロネクチンプレートの各ウェルに分注する。24ウェルレトロネクチンプレートを2, 103Gで2時間遠心分離し、摂氏32度で予熱した遠心分離機に入れます。プレートが遠心分離されている間に、0日目から増殖したPBNK細胞を収集し、トリパンブルーを使用して細胞をカウントします。増殖したPBNK細胞を、インターロイキン-2およびインターロイキン-15を添加したR-10培地で、ミリリットル当たり2.5 x 10〜5〜5 x 10〜5番目の細胞の濃度に希釈する。24穴レトロネクチンプレートの遠心分離後、各ウェルからレトロウイルス上清を部分的に吸引する。次に、2ミリリットルの希釈膨張PBNK細胞を各ウェルに加えます。プレートを摂氏32度で600Gで10分間遠心分離してから、プレートを摂氏37度で5%二酸化炭素で48〜72時間インキュベートします。細胞を24ウェルプレートから50ミリリットルの遠沈管に移し、チューブを400Gで5分間遠心分離します。ペレットを1ミリリットルのR-10培地で再懸濁した後、再懸濁した細胞を、インターロイキン-2およびインターロイキン-15を添加した30ミリリットルのR-10培地を含む特別な6ウェルプレートに移します。特殊な6ウェルプレートを摂氏37度、二酸化炭素5%でさわやかな培地でインキュベートし、3〜4日ごとにNK細胞の増殖率を計算します。221-mIL-21によって拡大されたPBNK細胞は、ほぼ5 x 10倍から4倍に拡大することが示された。NK細胞の純度は、21日間の増殖を通して約85%に維持された。増殖に先立ち、221-mIL-21増殖系の頑健性を抗CD56および抗CD3のPBMCを染色して調べたところ、NK細胞では7.09%の細胞純度とT細胞の割合が高いことが示されました。PBMCおよび221-mIL-21共培養の4日目に、CAR-NK形質導入前にNK純度をチェックした。抗CD56、抗CD3、抗ヒトIgGで染色したCAR-NK細胞は、7日目に高いNK細胞集団を示し、約70%の高いCAR形質導入効率が観察されました。18日目に、様々なサブセットにおけるCAR発現をフローサイトメトリーで確認した。NK細胞増殖に続いて、細胞はインビトロ機能アッセイまたはインビボ実験に使用できます。研究者は、このプロトコルを使用して、機能的NK欠損症の患者や犬などの他の種に対してNKおよびCAR-NKを拡大できます。

natural-killer-nk-car-nk-cell-expansion-method-using-membrane-bound

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ヒト増殖電位幹細胞からのナチュラルキラー細胞の作製

ここでは、ヒトiPS細胞由来のキメラ抗原受容体(CAR)を発現するナチュラルキラー細胞を分化・増殖させ、様々な悪性腫瘍に対する死傷性を向上させる方法を紹介します。このプロトコールは、ナチュラルキラー(NK)に最適化されたiPS細胞由来CAR-NK細胞の分化と増殖、およびさまざまな腫瘍細胞株に対する抗腫瘍活性の測定を示しています。...

ヒト人工多能性幹細胞由来キメラ抗原受容体発現ナチュラルキラー細胞の進歩

このプロトコルは、生細胞イメージングとフローサイトメトリーを用いて、ヒトの自然なキメラ抗原受容体介在および抗体依存性細胞毒性を一貫して測定するための標準化された in vitro.

キメラ抗原受容体および治療用抗体によって増強されるNK細胞毒性の定量化:生細胞イメージングおよびフローサイトメトリー

学ぼう、膜結合型IL-21を発現するEBV変形B細胞株をフィーダー細胞として用い、臍帯血・末梢血・組織由来のナチュラルキラー細胞およびCAR-NK細胞を効率的に増殖させる方法。高純度で機能的な細胞を大量に得られ、がん免疫療法への応用が期待されます。

膜結合型IL-21修飾B細胞株を用いたナチュラルキラー(NK)およびCAR-NK細胞増殖法

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