2023年11月10日
ここでは、細胞死誘導後に接種された葉を連続的にイメージングすることにより、プログラムされた細胞死開始率を研究するためのプロトコルを提示します。
まず、ウイルスに感染したジャガイモを摂氏22度に維持された成長チャンバーに移します。観察する植物を選び、粘着テープを使用して2枚目の接種した葉を完全に固定します。次に、デジタルマイクロスコープをコンピューターに接続し、画像キャプチャソフトウェアを起動します。
葉を顕微鏡の下に置きます。次に、ダイヤルを使用して葉の表面に焦点を合わせます。カメラの設定を調整するには、設定ボタンをクリックします。
次に、明るさを 64 に、コントラストを 14 に、色相を 0 に設定します。次に、ホワイトバランスを調整し、彩度を 47 に、シャープネスを 0 に、ガンマを 5 に設定します。画像キャプチャアイコンをクリックして、タイムラプスビデオオプションを選択します。
次に、15分ごとに合計24時間の画像キャプチャを設定します。スタートボタンを押すと、画像キャプチャが始まります。キャプチャした画像を保存するには、すべての画像を選択して保存アイコンをクリックします。
次に、エクスポートオプションを選択し、ドット/インチを最大に設定します。保存したら、プログラムからすべての画像を削除します。画像を編集するには、ImageJなどの編集ソフトウェアを起動します。
ファイルをクリックしてから [インポート] を選択し、[画像シーケンス] を選択して、1 つの視野から画像の時系列をインポートします。保存した画像のディレクトリのパスを貼り付けて、[OK]を押します。変換が完了すると、ImageJ は自動的に内部ビデオプレーヤーを起動し、完成したビデオを表示します。
ファイルをクリックし、名前を付けて保存し、AVI形式を選択してビデオファイルをエクスポートします。小さなウィンドウが開いたら、フレームレートを0.3 FPSに設定し、[OK]を押してビデオをAVIファイルとして保存します。少なくとも3〜4枚の葉が完全に発達した生後3〜4週間の接種済みジャガイモをデジタル顕微鏡分析に使用しました。
接種した葉の同じ領域を15分間隔で観察し、病変の発生と経時的な拡大を決定しました。14時間の観察では、病変は見られませんでした。約90分後、目に見える病変が記録されました。
病変は2時間後に拡大し始め、その後8時間半にわたって拡大を続けた。
本研究では、接種した葉を連続的にイメージングするプロトコルを用いて、ジャガイモにおけるプログラム細胞死の開始速度を調査します。この手法により、病斑形成のタイミングを正確に把握することができ、過敏性反応による抵抗性の動態に関する知見が得られます。
植物系における細胞死の開始を精密に定量化することで、過敏性反応の遺伝学的および分子論的決定要因に関する堅牢な仮説検証が可能になります。高解像度のデジタル顕微鏡は、プログラム細胞死を調節する構成因子の同定における予測信頼性を向上させ、植物バイオテクノロジーにおける早期発見と標的バリデーションに直接的な影響を与えます。この機能は、疾患関連システムにおける候補遺伝子の機能について、迅速かつ再現性のある評価を可能にすることで、ポートフォリオの意思決定を強化します。
このデジタル顕微鏡観察プロトコルは、初期の探索から検証に至る連続的なプロセスに組み込まれており、植物系における候補遺伝子や治療法の迅速な仮説検証および機能評価を可能にします。