Name: Cleavage Under Targets and Tagmentation (CUT and Tag) Assay in Mouse Myobblast Researchにおける活用 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-03-01T13:50:00.000+00:00
Duration: 7 min 9 s
Description: 学ぶCUT&Tag法によるマウス筋芽細胞のエピゲノム解析。希少な成体骨格筋幹細胞におけるH3K4me1修飾のプロファイリング手法を解説し、従来のChIP法に比べて少ない細胞数で高品質なデータを得られる革新的アプローチを紹介します。

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この研究は、中国科学院の戦略的優先研究プログラム(XDA16020400からPH)の支援を受けました。中国国立自然科学基金会(32170804からPH)。

CUT&#38;Tagを用いたマウス筋芽細胞のゲノムヒストンマークのプロファイリング

<ol><li>Kaya-Okur, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CUT%26Tag+for+efficient+epigenomic+profiling+of+small+samples+and+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">CUT&Tag for efficient epigenomic profiling of small samples and single cells.</a> Nat Commun. 10 (1), 1930(2019).</li>
<li>Skene, P. J., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+for+generating+high-resolution+maps+of+genome-wide+protein+binding%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">A simple method for generating high-resolution maps of genome-wide protein binding.</a> eLife. 4, e09225(2015).</li>
<li>Nikitina, T., Wang, D., Gomberg, M., Grigoryev, S. A., Zhurkin, V. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combined+micrococcal+nuclease+and+exonuclease+III+digestion+reveals+precise+positions+of+the+nucleosome+core%2Flinker+junctions%3A+implications+for+high-resolution+nucleosome+mapping%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Combined micrococcal nuclease and exonuclease III digestion reveals precise positions of the nucleosome core/linker junctions: implications for high-resolution nucleosome mapping.</a> J Mol Biol. 425 (11), 1946-1960 (2013).</li>
<li>Policastro, R. A., Zentner, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymatic+methods+for+genome-wide+profiling+of+protein+binding+sites%5BTitle%5D)+AND+%22Brief+Funct+Genomics%22%5BJournal%5D)">Enzymatic methods for genome-wide profiling of protein binding sites.</a> Brief Funct Genomics. 17 (2), 138-145 (2018).</li>
<li>Teytelman, L., Thurtle, D. M., Rine, J., van Oudenaarden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+expressed+loci+are+vulnerable+to+misleading+ChIP+localization+of+multiple+unrelated+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Highly expressed loci are vulnerable to misleading ChIP localization of multiple unrelated proteins.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (46), 18602-18607 (2013).</li>
<li>Skene, P. J., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+efficient+targeted+nuclease+strategy+for+high-resolution+mapping+of+DNA+binding+sites%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">An efficient targeted nuclease strategy for high-resolution mapping of DNA binding sites.</a> eLife. 6, e21856(2017).</li>
<li>Mezger, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+chromatin+accessibility+profiling+at+single-cell+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">High-throughput chromatin accessibility profiling at single-cell resolution.</a> Nat Commun. 9, 3647(2018).</li>
<li>Zheng, G. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Massively+parallel+digital+transcriptional+profiling+of+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Massively parallel digital transcriptional profiling of single cells.</a> Nat Commun. 8, 14049(2017).</li>
<li>Nakka, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((JMJD3+activated+hyaluronan+synthesis+drives+muscle+regeneration+in+an+inflammatory+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">JMJD3 activated hyaluronan synthesis drives muscle regeneration in an inflammatory environment.</a> Science. 377 (6606), 666-669 (2022).</li>
<li>Fu, X., Wang, H., Hu, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cell+activation+in+skeletal+muscle+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Stem cell activation in skeletal muscle regeneration.</a> Cell Mol Life Sci. 72 (9), 1663-1677 (2015).</li>
<li>Maesner, C. C., Almada, A. E., Wagers, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Established+cell+surface+markers+efficiently+isolate+highly+overlapping+populations+of+skeletal+muscle+satellite+cells+by+fluorescence-activated+cell+sorting%5BTitle%5D)+AND+%22Skelet+Muscle%22%5BJournal%5D)">Established cell surface markers efficiently isolate highly overlapping populations of skeletal muscle satellite cells by fluorescence-activated cell sorting.</a> Skelet Muscle. 6, 35(2016).</li>
<li>Giordani, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-dimensional+single-cell+cartography+reveals+novel+skeletal+muscle-resident+cell+populations%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">High-dimensional single-cell cartography reveals novel skeletal muscle-resident cell populations.</a> Mol Cell. 74 (3), 609-621.e6 (2019).</li>
<li>Fu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combination+of+inflammation-related+cytokines+promotes+long-term+muscle+stem+cell+expansion%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Combination of inflammation-related cytokines promotes long-term muscle stem cell expansion.</a> Cell Res. 25 (6), 655-673 (2015).</li>
<li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+and+transcription+factor+profiling+in+rare+stem+cell+populations+using+CUT%26Tag%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protoc%22%5BJournal%5D)">Chromatin and transcription factor profiling in rare stem cell populations using CUT&Tag.</a> STAR Protoc. 2 (3), 100751(2021).</li>
<li>Tapscott, S. J., Davis, R. L., Lassar, A. B., Weintraub, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MyoD%3A+a+regulatory+gene+of+skeletal+myogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Experimental+Medicine+and+Biology%22%5BJournal%5D)">MyoD: a regulatory gene of skeletal myogenesis.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 280, discussion 3-6 (1990).</li>
<li>Wardle, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Master+control%3A+transcriptional+regulation+of+mammalian+Myod%5BTitle%5D)+AND+%22J+Muscle+Res+Cell+Motil%22%5BJournal%5D)">Master control: transcriptional regulation of mammalian Myod.</a> J Muscle Res Cell Motil. 40 (2), 211-226 (2019).</li>
<li>Local, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+H3K4me1-associated+proteins+at+mammalian+enhancers%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Identification of H3K4me1-associated proteins at mammalian enhancers.</a> Nat Genet. 50 (1), 73-82 (2018).</li>
<li>Barski, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+profiling+of+histone+methylations+in+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">High-resolution profiling of histone methylations in the human genome.</a> Cell. 129 (4), 823-837 (2007).</li>
<li>Faralli, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((UTX+demethylase+activity+is+required+for+satellite+cell-mediated+muscle+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">UTX demethylase activity is required for satellite cell-mediated muscle regeneration.</a> J Clin Invest. 126 (4), 1555-1565 (2016).</li>
<li>Yang, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myogenic+transcriptional+activation+of+MyoD+mediated+by+replication-independent+histone+deposition%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Myogenic transcriptional activation of MyoD mediated by replication-independent histone deposition.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (1), 85-90 (2011).</li>
<li>Kaya-Okur, H. S., Janssens, D. H., Henikoff, J. G., Ahmad, K., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+low-cost+chromatin+profiling+with+CUT%26Tag%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Efficient low-cost chromatin profiling with CUT&Tag.</a> Nat Protoc. 15 (10), 3264-3283 (2020).</li>
</ol>

著者は何も開示していません。

特定のCUT&Tag反応に必要な特定の細胞数は、試験対象のヒストンマーク/バリアントまたはクロマチン結合タンパク質の濃縮に完全に依存しています。通常、H3K4me1、H3K4me3、H3K27acなどの非常に濃縮されたヒストンマークの場合、1回のCUT&Tag反応には25,000-50,000個の筋芽細胞で十分です。ただし、一部のまれなクロマチン結合タンパク質は、最大250,000個の細胞を必要とする場合があります。CUT&Tagアッセイで使用される細胞番号は重要であり、適切に処理しないと通常、アッセイの失敗の原因となります。CUT&Tag反応に過剰な数の細胞を使用することは、特に非常に濃縮されたヒストンマークを試験する場合に有害です。細胞が多すぎると、各細胞に割り当てられた抗体が不十分になります。CUT&Tagは、非常に低いセル番号で機能するだけでなく、実際にはシングルセルレベル1で適用できます。
何よりも、高い親和性と特異性を持つ信頼性とバリデーションされた抗体を使用することが、CUT&Tagアッセイを成功させるための鍵となります。ChIP、免疫沈降(IP)、IFアッセイと同様に、CUT&Tagにも自然に折りたたまれた抗原を認識できる抗体が必要です1。対照的に、ウェスタンブロットで弛緩したペプチドのみを認識する抗体は、CUT&Tagでは厳重に避けるべきです。
細胞数の最適化や、免疫蛍光法でバリデーションされた抗体、または十分に引用された抗体を使用しても、CUT&Tagアッセイのシグナル不良の問題を解決できない場合は、目的のタンパク質がDNAに弱く結合するクロマチン関連タンパク質なのか、それともDNAに直接結合しないのかを調べてください。この場合は、前述のように、CUT&Tag の代わりに CUT&RUN を使用するように切り替えます。あるいは、0.5%パラホルムアルデヒドに5分間浸漬する(その後、0.1 Mグリシンに10分間急冷する)などのわずかな固定法も、試験する価値のある方法かもしれません。しかし、CUT&Tagアッセイで固定を実践したことはなく、CUT&Tagを実行する前に細胞を固定する必要にさえ遭遇したことがないため、架橋についてこれ以上のコメントはできません。
CUT&Tagプロトコルのバージョンによっては、一次抗体のインキュベーションステップにRT(2時間)と4°C(一晩)の両方で適切な結果が得られると主張している場合があることを理解しています21。ただし、RTを2時間使用するのではなく、4°C(一晩)を使用することを強くお勧めします。一方、インキュベーション時間を一晩以上延長することもお勧めしません。
感度、バックグラウンドコントロール、研究者が扱う複雑さの度合いの点で、CUT&TagはChIPアッセイよりも優れています。ChIPと比較してCUT&Tagにいくつかの欠点があるとすれば、唯一の欠点は、CUT&Tagプロトコルには、ChIPアッセイで「インプット」を使用するような内部標準化方法が含まれていないことです1。そのため、CUT&Tagを使用してサンプル間のピーク高さを比較する場合、研究者はまずサンプル間の細胞数を均等にする必要があります。また、技術的なレプリケートを含めることも重要です。
このプロトコールは、マウス筋芽細胞におけるCUT&Tagの実施について、この細胞タイプにおけるH3K4me1 CUT&Tagの成功例を提供することで、詳細を示しています。ここで説明する方法は、新たに単離されたMuSCに何も変更せずに直接適用できます。さらに、ヒストンマーク、ヒストンバリアント、または他の細胞タイプの転写因子に関するCUT&Tag実験も、このプロトコルに従って実施することができます。筋管または筋線維の場合、最初に核を単離し、次に筋核に対してCUT&Tagを実行できます。これを行うと、このCUT&Tagプロトコルで細胞が処理されるのと同じように核を治療できます。筋管と筋線維は多核細胞であり、筋管や筋線維をConcanavalin-Aビーズに直接結合できるかどうかは検証していませんが、これは可能かもしれません。

CUT&Tagアッセイは、ChIPs 1の明らかな欠陥を補うために考案されました。ChIPの2つの大きな欠点は、1)クロマチンを断片化する際に生じるバイアスと、2)低い細胞数での作業ができないことです。X-ChIPアッセイは、クロマチンフラグメントを取得するために超音波処理またはMNase消化のいずれかに依存していますが、N-ChIPは主にMNase消化を使用してヌクレオソームを取得します。超音波処理は、プロモーター領域2のような弛緩したクロマチン位置に偏りを示しており、明らかに、MNase消化は弛緩したクロマチン繊維に対してもより効率的に機能します。また、MNaseの消化にもDNA配列依存的なバイアスが見られるとの報告もありました3。したがって、ChIPアッセイのインプット調製ステップでは、あらゆる種類のゲノム位置から完全にランダムな方法でクロマチンフラグメントを取得することは不可能です。さらに、ChIPアッセイは通常、CUT&Tagよりも高いバックグラウンドシグナルを生成し、ピークが1,4,5である場所を強調するためにCUT&Tagよりも10倍以上のリードを必要とします。これが、ChIP実験がCUT&Tagよりもはるかに多くの細胞から始めなければならない理由を説明しています。細胞株を研究する際には、細胞株を繰り返し継代して非常に高い細胞数を達成できるため、これは問題になりません。しかし、ChIPアッセイは、希少なまたは貴重な初代細胞集団を研究するための強力なエピジェネティックなツールではないことは確かですが、初代細胞の方がより実用的で医学的な意味合いを持っていることは明らかです。
長くて複雑なChIP手順により、一部の研究者はこの手法を学んだり使用したりすることを思いとどまらせますが、人々は免疫細胞化学(ICC)や免疫蛍光(IF)などの簡単なアッセイに慣れています。CUT&Tagアッセイは、基本的にICCおよびIF実験のプロセスに似ていますが、試験管内でのみ行われます。CUT&Tagは、そもそも断片化されたクロマチンを必要とせず、代わりに、抗体結合1のためにゲノムが無傷でなければなりません。ChIP実験の初日、研究者は通常、短いクロマチン片を抗体ビーズと混合する前に、ソニケーションまたはMNase消化で核から断片化されたクロマチンを調製するのに最大4時間を費やします4,5。これとは対照的に、CUT&Tag法の初日の作業負荷は、細胞をConcanavalin-Aビーズに固定し、その後、細胞ビーズに一次抗体を添加することです。これには ~40 分1 しか必要ありません。
特筆すべきは、Cleavage Under TargetsおよびRelease Using Nuclease(CUT&RUN)がCUT&Tagの重要な代替手段であることです。CUT&RUNは、CUT&Tagと同様の動作メカニズムに基づいて設立されました。CUT&Tagでは、抗体がpA/G-Tn5トランスポゼースをすべての場所に誘導し、酵素がそれぞれクロマチンの一部を切り取り、その間にライブラリ作製アダプターでタグを付けますが、CUT&RUNでは、pA/G-Tn5の役割は、ジョブの切断部分のみを実行するpA/G-MNaseによって果たされます6。そのため、CUT&Tagと比較すると、CUT&RUNでは、pA/G-MNaseで断片化されたDNA断片7,8にライブラリー作製アダプターを接着する追加工程が必要になります。CUT&TagとCUT&RUNは類似性が高いため、CUT&Tagに精通した研究者は、CUT&RUNを上手に行うことに容易に適応することができます。ただし、CUT&TagとCUT&RUNには若干の違いがあります。CUT&RUNのプロトコルでは、通常、洗浄ステップで物理濃度の塩 (~150 mM) を使用しますが、CUT&Tagでは、300-Dig洗浄バッファーの塩分が多く含まれています。したがって、CUT&Tagは、ヒストンマーク/バリアントまたは転写因子をプロファイリングする際にバックグラウンドを制御するのが得意で、これらのタンパク質はDNA1に直接かつ強力に結合します。CUT&Tagは、DNAに直接結合せず、クロマチンに対して弱い親和性を示すクロマチン関連因子をプロファイリングする際に問題に遭遇する可能性があります。CUT&Tagの高塩分洗浄ステップでは、クロマチン関連因子が取り除かれ、最終出力にシグナルが生成されない可能性があります。CUT&Tagを使用して非ヒストン/非転写因子タンパク質9をプロファイリングできる成功例もありますが、弱く結合したクロマチン関連タンパク質のプロファイリングには、CUT&TagよりもCUT&RUNをお勧めします。
哺乳類が成体に達した後も、その骨格筋組織にはまだ筋幹細胞が含まれています。筋肉損傷の間、これらの幹細胞は活性化され、細胞数の拡大および分化を受けて損傷した筋線維を再生することができる10。これらの幹細胞は、筋幹細胞/衛星細胞(MuSC)として知られています。MuSCは動物から単離された後、または筋肉の損傷によって活性化された後、増殖を開始し、筋芽細胞になります。
マウス骨格筋消化物からMuSCを得るために、Vcam1(Cd106)、Cd34、α7-インテグリン(Itga7)などのMuSC表面マーカーを個々に、または組み合わせて使用して、蛍光活性化細胞ソーティング(FACS)11中にMuSCを濃縮することがよくあります。Cd31-/Cd45-/Sca1-/Vcam1+ は、おそらく>95%の純粋なMuSCを得るための最良のマーカーの組み合わせであることが示されています12。FACSは、新鮮な筋肉が消化された直後に純粋なMuSCを分離することができます。しかし、実験デザインが純粋なMuSCを分離する必要がない場合、プレプレーティングはFACSよりも費用対効果が高く、>90%の純粋な筋芽細胞(MuSC子孫)を得ることができます。
マウスから新たに単離されたMuSCは、ウシ胎児血清(FBS)を添加したハムのF10培地では効率的に増殖しません。MuSCの細胞数をより多く増やし、十分な筋芽細胞を得るためには、FBSの代わりにウシ成長血清(BGS)を使用すべきである。しかし、BGSが利用できない場合は、ハムのF10フル培地(約20%のFBSを含む)を等量のT細胞条件付き培地と混合して、筋芽細胞の増殖を劇的に促進することができる13。したがって、このプロトコルでは、T細胞培地コンディショニングMuSC培地の調製についても説明します。
最も重要なことは、このプロトコールは、マウス後肢筋から単離されたマウス筋芽細胞に対してH3K4me1 CUT&Tagアッセイを実施する完全な例を提供することです。このプロトコルは、他の細胞タイプやヒストンマーク、ヒストンバリアントにも適用され、読者は、研究する特定のヒストンマークやバリアントの濃縮に基づいて、自分のケースの細胞数や抗体量を最適化するだけでよいことにご注意ください。
CUT&TagまたはCUT&RUNで使用するには、Tn5またはMNaseをプロテインAまたはプロテインGと融合させて、pA-Tn5、pG-Tn5、pA-MNase、またはpG-MNaseを生成する必要があります。明らかに、プロテインAとプロテインGの両方をこれらの酵素に同時に融合させて、pA/G-Tn5またはpA/G-MNaseを生成することができるようです。プロテインAとプロテインGは、異なる種由来のIgGに対して異なる親和性を示します。したがって、プロテインAとプロテインGを酵素に融合させることで、この問題を克服し、酵素を複数の生物種の抗体と適合させることができます。

<table><tbody><tr><td>bFGF</td><td>のR&D Systems</td><td>233-FB-025</td><td></td></tr><tr><td>コラーゲン</td><td>コーニング</td><td>354236</td><td></td></tr><tr><td>コラゲナーゼ II</td><td>ワージントン</td><td>LS004177</td><td></td></tr><tr><td>Concanavalin-A</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5275</td><td></td></tr><tr><td>Concanavalin-A ビーズ</td><td>Bangs Laboratories</td><td>BP531</td><td></td></tr><tr><td>Digitonin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>300410</td><td></td></tr><tr><td>Dispase II</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>17105041</td><td></td></tr><tr><td>ウシ胎児血清</td><td>Hyclone</td><td>SH30396.03</td><td></td></tr><tr><td>H3K4me1抗体&nbsp;</td><td>abcam</td><td>ab8895</td><td></td></tr><tr><td>ハムのF10培地</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>11550043</td><td></td></tr><tr><td>Hyperactive Universal CUT&Illumina用タグアッセイキット&nbsp;</td><td>Vazyme</td><td>TD903</td><td>このキットは、</td></tr><tr><td>1.5 mL EPチューブ用磁気ラック</td><td>Qualityard</td><td>QYM06</td><td></td></tr><tr><td>8-PCRチューブストライプ用磁気ラック</td><td>Anosun Magnetic</td><td>CLJ16/21-021</td><td></td></tr><tr><td>NEBNext High-Fidelity 2x PCR Master Mix</td><td>NEB</td><td>M0541L</td><td>ライブラリ作成用PCR反応</td></tr><tr><td>pA-Tn5</td><td>Vazyme</td><td>S603-01</td><td>使用前にアダプターを取り付ける必要があります</td></tr><tr><td>プロテアーゼ阻害剤カクテル</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>5056489001</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Beyotime</td><td>ST535-100mg</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640 培地</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>C11875500BT</td><td></td></tr><tr><td>二次抗体 (モルモット抗ウサギ IgG)</td><td>抗体-オンライン</td><td>ABIN101961</td><td></td></tr><tr><td>スペルミジン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2626</td><td></td></tr><tr><td>TruePrep Index Kit V2 イルミナ用&nbsp;</td><td>Vazyme</td><td>TD202</td><td>このキットは、Illumina N7XXおよびN5XXプライマーを提供します&nbsp;</td></tr><tr><td>VAHTS DNAクリーンビーズ&nbsp;</td><td>Vazyme</td><td>N411</td><td>Ampure XPビーズの代わりに使用できます。CUT&を精製できますライブラリにタグを付け、サイズごとにDNAフラグメントを選択</td></tr></tbody></table>

cleavage under targets and tagmentation (cut&#38;tag) assay in mouse myobblast researchにおける活用

Using Cleavage Under Targets and Tagmentation (CUT&#38;Tag) Assay in Mouse Myoblast Research

このプロトコール論文は、Cleavage Under Targets and Tagmentation(CUT&Tag)を使用して、クロマチン結合因子、ヒストンマーク、およびヒストンバリアントのゲノム位置をプロファイリングする方法の詳細を新しい研究者に提供することを目的としています。CUT&Tagプロトコールは、マウス筋芽細胞および新たに分離された筋幹細胞(MuSC)で非常に良好に機能します。Concanavalin-Aビーズで細胞を固定化できる限り、他の多くの細胞タイプに容易に適用できます。CUT&Tagと比較すると、クロマチン免疫沈降(ChIP)アッセイは時間のかかる実験です。ChIPアッセイでは、クロマチック材料を免疫沈降に使用する前に、クロマチンの前処理が必要です。架橋ChIP(X-ChIP)では、クロマチンの前処理には、クロマチンを断片化するための架橋と超音波処理が含まれます。ネイティブChIP(N-ChIP)の場合、断片化されたクロマチンは通常、Micrococcal nuclease(MNase)消化によって達成されます。超音波処理とMNase消化の両方がChIP実験にいくつかのバイアスをもたらします。CUT&Tagアッセイは、ChIPと比較してより少ないステップで終了し、必要な細胞数も大幅に少なくて済みますが、さまざまなゲノム位置の転写因子やヒストンマークに関するより偏りのない情報を提供します。CUT&Tagは、わずか5,000個の細胞で機能します。ChIPよりも感度が高く、バックグラウンドシグナルが低いため、研究者はシーケンシング後の数百万回の読み取りから信頼性の高いピークデータを取得することが期待できます。

Concanavalin-Aビーズに細胞を結合する前に、顕微鏡で細胞懸濁液を確認してください。したがって、Concanavalin-Aビーズで細胞をインキュベートした後、サンプルチューブを磁気ラックに置き、上清を顕微鏡で再度観察する必要があります。これは、Concanavalin-Aビーズによって細胞がどれだけ効率的に捕捉されたかを評価するためです。7 x 105 細胞/mLを含む洗浄バッファーは、顕微鏡下で 図1A のようになります。対照的に、 図1B は、Concanavalin-Aビーズ結合後の上清を示しており、ビーズがすべての細胞を取り除いています。Concanavalin-Aビーズが細胞を効率的に捕捉していなかったら、CUT&amp;Tagの次のステップに進む意味はありません。洗浄バッファーは、Concanavalin-Aビーズへの細胞膜の結合を廃止する可能性があるため、血清含有量やEDTA/EGTAを含んではいけません。しかし、ウシ血清アルブミンは、細胞へのコンカナバリン-Aの結合を妨げません。
PCRでCUT&amp;Tagライブラリを作製した後、ライブラリの少量アリコート(3-4 μL)を1.2-1.5%アガロースゲル上で電気泳動し、ライブラリが良好かどうかを試験することができます。 図2 は、H3K4me1 CUT&amp;Tagライブラリの成功例を示しています。ヒストンマークまたはヒストンバリアントCUT&amp;Tagでは、切断されたユニットの大部分は明らかにモノヌクレオソームですが、2つのヌクレオソームを一緒に切り取ることもできます。3つのヌクレオソームが切断され、全部でタグ付けされることは非常にまれです。したがって、モノヌクレオソーム、ジヌクレオソーム、および非常に少ないトリヌクレオソームを含むヌクレオソームアレイは、ヒストンマークCUT&amp;Tagライブラリの電気泳動で観察されるべきです。ヌクレオソームには147 bpのDNAが含まれていますが、Tn5トランスポザースとライブラリーPCRによってシーケンシングアダプターを追加すると、 図2に示すように、CUT&amp;タグ付きモノヌクレオソームの合計サイズは300 bpになるはずです。
CUT&amp;Tagライブラリのハイスループットシーケンシングに費用をかける前に、別の品質管理方法として、遺伝子座特異的プライマーを用いたqPCRを実施します。これは、ChIP-qPCRを実行するのと同じです。また、CUT&amp;Tag qPCRの遺伝子座特異的プライマーは、ChIP-qPCRプライマーと同じ原理に基づいて設計されています。図3は、Myod1遺伝子座上のさまざまな位置のqPCR増幅を示しています。Myod1は、筋形成中の骨格筋の系統を決定するマスター転写因子であるMyoDをコードしています15。図3に示すように、H3K4me1はMyod1遺伝子座のコアエンハンサー(CER)と遠位調節領域(DRR)で高度に濃縮されています。CERとDRRは、Myod116の非常に確立されたエンハンサー領域です。これは、H3K4me1が特に委託されたエンハンサー17をマークするという十分に文書化された表現型と一致しています。さらに、図3は、活性プロモーターの近位領域のヌクレオソームが通常H3K4me1ではなくH3K4me318で修飾されるため、H3K4me1レベルが近位調節領域(PRR)で非常に低いことを示しています。これらの評価された遺伝子座のすべてのプライマーペアは以前に発表されており19,20、配列は表4にあります。通常、特定の遺伝子座に対するライブラリDNA電気泳動とqPCRによる品質管理を行った後、研究者は自信を持ってシーケンシングを進めることができます。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66066/66066fig01.jpg"> 図1:Washバッファーに再懸濁した筋芽細胞。 (A)Concanavalin-Aビーズ結合前と(B)結合後の顕微鏡図。パネルBは、Concanavalin-Aビーズインキュベーション後の懸濁液中に細胞がほとんど残っていないことを示しており、細胞がビーズによって効率的に捕捉されたことを示しています。パネルBの小さな粒子は、過剰なConcanavalin-Aビーズである可能性が高いです。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66066/66066fig01large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66066/66066fig02.jpg"> 図2:CUT&amp;Tagライブラリの電気泳動。 3つの独立したH3K4me1 CUT&amp;Tagアッセイを実施し、それぞれをIlluminaプライマーとPCRを使用してシーケンシングライブラリにしました。各H3K4me1 CUT&amp;Tagは、70,000個のマウス筋芽細胞を使用しました。ライブラリには、主にタグ付きモノヌクレオソームが含まれています。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66066/66066fig02large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66066/66066fig03.jpg"> 図3:Myod1遺伝子座上の異なる位置のqPCR増幅。 qPCRは、マウス筋芽細胞では、H3K4me1マークがMyod1遺伝子のエンハンサー領域で高度に濃縮されていることを示しており、これは発表された結論と一致しています。CERおよびDRRは、Myod1プロモーターの上流に位置するMyod1のエンハンサーとして公開されています。PRRにはH3K4me1の蓄積がなく、これは活性プロモーターが主にH3K4me3でマークされているという事実とも一致していることに注意してください。濃縮度は、サンプル「Repeat 1」の「gene desert」上のH3K4me1の濃縮度に正規化して計算した。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66066/66066fig03large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>名前</td>
			<td>シーケンス (5'-3'):</td>
		</tr><tr><td>オリゴレブ</td>
			<td>phos-CTGTCTCTTATACACATCT</td>
		</tr><tr><td>オリゴエー</td>
			<td>TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTGTATAAGAGACAG</td>
		</tr><tr><td>オリゴB</td>
			<td>GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAG</td>
		</tr></tbody></table>表1:アダプターAおよびアダプターBをpA/G-Tn5トランスポザーゼにマウントするためのオリゴ配列。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>端数</td>
			<td>容積</td>
		</tr><tr><td>CUT&amp;Tag反応後の精製ゲノムDNA</td>
			<td>21μL</td>
		</tr><tr><td>N5XXプライマー(10μM)</td>
			<td>2 μL</td>
		</tr><tr><td>N7XXプライマー(10 μM)</td>
			<td>2 μL</td>
		</tr><tr><td>NEBNext High-Fidelity 2× PCR マスターミックス</td>
			<td>25μL</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td>合計 50 μL</td>
		</tr></tbody></table>表2:Illuminaインデックスプライマーを用いたCUT&amp;Tagライブラリー調製のためのPCRセットアップ。 DNAポリメラーゼミックスなどのライブラリPCR試薬を含む市販のCUT&amp;Tagキットを使用する場合は、そのキットの特定のマニュアルに従ってライブラリPCRをセットアップしてください。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>歩</td>
			<td>温度</td>
			<td>時間</td>
			<td>サイクル番号</td>
		</tr><tr><td>1</td>
			<td>72 °C</td>
			<td>3分間</td>
			<td>1</td>
		</tr><tr><td>2</td>
			<td>95 °C</td>
			<td>3分間</td>
			<td>1</td>
		</tr><tr><td>3</td>
			<td>98 °C</td>
			<td>10秒</td>
			<td rowspan="2">9歳から14歳まで</td>
		</tr><tr><td>4</td>
			<td>60 °C</td>
			<td>5 秒後、ステップ 3 に進みます</td>
		</tr><tr><td>5</td>
			<td>72 °C</td>
			<td>1分間</td>
			<td>1</td>
		</tr><tr><td>6</td>
			<td>4 °C</td>
			<td>持つ</td>
			<td>該当なし</td>
		</tr></tbody></table>表3:Illuminaインデックスプライマーを用いたCUT&amp;Tagライブラリ調製のためのPCRプログラム。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>場所</td>
			<td>プライマー配列 (5'-3')</td>
		</tr><tr><td rowspan="2">CERの</td>
			<td>対象:GGG CAT TTA TGG GTC TTC CT</td>
		</tr><tr><td>リビジョン:CTC ATG CCT GGT GTT TAG GG</td>
		</tr><tr><td rowspan="2">-15,000</td>
			<td>対象:TGC、CCA、GA、GA、ATC AT</td>
		</tr><tr><td>改訂:TCA TGC ATC CTT GCT GGA TA</td>
		</tr><tr><td rowspan="2">-7,000</td>
			<td>対象:GGC ATG GGA GGT TTA TAG CA</td>
		</tr><tr><td>改訂:ATG、CCA、CTA、TGC、AAT、CCA、CA</td>
		</tr><tr><td rowspan="2">災害リスク軽減</td>
			<td>対象:TCA GGA CCA GGA CCA TGT CT</td>
		</tr><tr><td>改訂:CTG、GAC、CTG、TGG、CCT、CTT、AC、</td>
		</tr><tr><td rowspan="2">PRRの</td>
			<td>対象:GAG TAG ACA CTG GAG AGG CTT GG</td>
		</tr><tr><td>改訂:GAA AGC AGT CGT GTC CTG GG</td>
		</tr><tr><td rowspan="2">CDS1の</td>
			<td>対象:CAT CTG ACA CTG GAG TCG CTT TG</td>
		</tr><tr><td>改訂:CAA GCA ACA CTC CTT GTC ATC AC</td>
		</tr><tr><td rowspan="2">CDS2の</td>
			<td>対象:GTG AGC CTT GCA CAC CTA AGC C</td>
		</tr><tr><td>改訂:GTT、GCA、CTA、CAC、AGC、ATG、CCT G</td>
		</tr><tr><td rowspan="2">IgHエンハンサー</td>
			<td>対象:ACC CTG GGA AGA CCA TAC TTA ATC T</td>
		</tr><tr><td>改訂:CCA TCC ACA CTC GTG CCT TA</td>
		</tr><tr><td rowspan="2">ジーン砂漠</td>
			<td>対象:TCC TCC CCA TCT GTG TCA TC</td>
		</tr><tr><td>改訂:GGA TCC ATC ACC ATC AAT AAC C</td>
		</tr></tbody></table>表4: Myod1 遺伝子のさまざまな位置でH3K4me1濃縮をテストするための遺伝子座特異的プライマー。

エピジェネティックな分野に不慣れな研究者は、CUT&TagがChIPアッセイの非常に簡単な代替手段であることに気づくでしょう。CUT&Tagは、希少細胞集団と初代細胞集団のエピジェネティック研究に多大な恩恵をもたらし、非常に少数の細胞から高品質のデータを生成しました。このプロトコールでは、マウス後肢筋から単離したマウス筋芽細胞に対するH3K4me1 CUT&Tagアッセイの実施について説明します。

Cleavage Under Targets and Tagmentation (CUT&#38;Tag) Assay in Mouse Myobblast Researchにおける活用

This protocol paper aims to provide the new researchers with the full details of using Cleavage Under Targets and Tagmentation (CUT&amp;Tag) to profile ...

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Research

JoVE Journal

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