Name: Living Caenorhabditis elegansにおける蛍光顕微鏡による内因性貨物の軸索輸送の可視化の最適化 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-02-16T14:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 47 s
Description: 学ぶ蛍光顕微鏡の最適化手法で、生きたCaenorhabditis elegansにおける内因性貨物の軸索輸送を可視化する方法です。時間制御ラベリングとアブレーションを組み合わせ、神経科学の研究に応用できます。

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<meta charset="utf8"></head><body>GFPタグRAB-3を用いた現生 C.エレガンス における軸索輸送解析の強化

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<li>Goudeau, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Split-wrmScarlet+and+split-sfGFP%3A+tools+for+faster%2C+easier+fluorescent+labeling+of+endogenous+proteins+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Split-wrmScarlet and split-sfGFP: tools for faster, easier fluorescent labeling of endogenous proteins in Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 217 (4), (2021).</li>
<li>Cranfill, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+assessment+of+fluorescent+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Quantitative assessment of fluorescent proteins.</a> Nat Methods. 13 (7), 557-562 (2016).</li>
<li>Fan, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SapTrap+assembly+of+Caenorhabditis+elegans+MosSCI+transgene+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22G3%22%5BJournal%5D)">SapTrap assembly of Caenorhabditis elegans MosSCI transgene vectors.</a> G3. 10 (2), Bethesda. 635-644 (2020).</li>
<li>Glomb, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+kinesin-1+adaptor+complex+controls+bimodal+slow+axonal+transport+of+spectrin+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">A kinesin-1 adaptor complex controls bimodal slow axonal transport of spectrin in Caenorhabditis elegans.</a> Dev Cell. 58 (19), 1847-1863 (2023).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>アガロース</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9539</td><td></td></tr><tr><td>カバースリップ(22 mm x 22 mm、No1)。ゴールドシールカバーガラス</td><td>トーマスサイエンティフィック</td><td>6672A14</td><td></td></tr><tr><td>レバミゾール</td><td>ChemCruz</td><td>sc-205730</td><td></td></tr><tr><td>顕微鏡:ニコンTi2倒立顕微鏡、横河CSU-W1ソラスキャンヘッド、ハマツオルカフュージョンBT sCMOSカメラ、ニコンCFIプランアポラムダ60x 1.4 NA油浸対物レンズ、ET525/36発光フィルター付き488nmのニコン光刺激スキャナー</td><td>ニコン</td><td></td>スピ<td>ニングディスク共焦点顕微鏡</td></tr><tr><td>&nbsp;NIS-elements AR</td><td>Nikon</td><td></td><td>Ti2用ソフトウェア</td></tr><tr><td>Plain precleaned microscopy slides</td><td>Thermo Scientific</td><td>420-004T</td><td></td></tr><tr><td>Nematode strain</td><td>Identifier</td><td>Source</td><td></td></tr><tr><td>rab-3(ox699[GFP::flip-on::rab-3]) (II); shyIs43(glr-4p::FLP-NLSx2; odr-1p::RFP) (II)</td><td>Park et al. (DOI: 10.1016/j.cub.2023.07.052)</td><td>MTS1161&nbsp;</td><td>CGC(https://cgc.umn.edu/)にて預託いたします</td></tr></tbody></table>

living caenorhabditis elegansにおける蛍光顕微鏡による内因性貨物の軸索輸送の可視化の最適化

Optimizing Visualization of Axonal Transport of Endogenous Cargo by Fluorescence Microscopy in Living Caenorhabditis elegans

モデルシステムと測定手順の概要 シナプス小胞前駆体の軸索輸送を可視化するために、RAB-3と標識されたGFPを内因的に追跡しました。ここでは、最近生成されたGFP::Flip-on::RAB-3株6を利用し、細胞特異的プロモーター(glr-4p)の下でのリコンビナーゼFlippaseの発現がDA9運動ニューロンの内因性RAB-3を標識します。DA9は双極性運動ニューロンであり、その細胞体は動物の腹側後部、肛門の近くに位置しています(図1A)。それは、腹側神経索に沿って前方に走る短い樹状突起と、後方に走る長い軸索を含み、交連を形成し、次に背側神経索に沿って前方に走り、そこで背筋とVDニューロン22,23,24を神経支配するアンパッサンシナプスを形成します。シナプス後領域における軸索輸送を視覚化します。ほとんどのトランスポートイベントは、1つの焦点面でキャプチャできます(図1A)。この領域では静止した小胞の背景を減らすために、最初の光退色ステップが実施されますが、この領域ではしばしば一時停止する傾向があります(図1B)。タイムラプスビデオは3分以上にわたって記録され、アシナプス領域に沿ったRAB-3信号はキモグラフにプロットされて、個々の輸送イベントが抽出されます(図1C)。
軸索輸送の可視化を最適化するための取得パラメータの調整 多くの内因性蛍光タグ付きタンパク質のシグナル強度の低さを克服するには、顕微鏡の取得パラメーターを最適化する必要があります。輸送イベントの確実な定量化のためには、個々の輸送イベントのシグナル強度を、細胞質の背景または一時停止中の静止貨物上で可能な限り明るくする必要があります。シナプス小胞前駆体は、しばしば異なる小胞プールのシナプス上領域で一時停止し、新しい入ってくる小胞の検出を妨げ、それらの輸送痕跡をたどることを困難にします7。
最初の蛍光漂白ステップを1回行うだけで、小胞プールから得られる蛍光シグナルを大幅に低減し、新規の入ってくる小胞の移動検出を強化することができます(図2A)。漂白ステップは、RAB-3の細胞質画分が非常に低いためと思われる、細胞質バックグラウンド強度上を移動するRAB-3小胞のシグナルをわずかに増強しただけでした(図2D)。
ビニングを使用すると、ピクセルの配列を 1 つのピクセルに結合することで、個々のトランスポート イベントの背景上の信号を改善するための追加のレイヤーが提供されます。2 x 2ビニングでは、空間分解能が半分になり(ここでは108.33 nm/ピクセルから216.7 nm/ピクセル)、これは個々のRAB-3輸送粒子を追跡するのに十分ですが(図2B)、個々の小胞の信号強度が大幅に向上します(図2D)。非常に高い空間分解能が必要でない限り、ビニングは他の多くの軸索カーゴを視覚化するためにも使用できます。
次に、露光時間の変化が単一の輸送イベントの信号強度をどのように改善できるかを尋ねました。特に、その後のイメージング時点間で700ミリ秒の500ミリ秒の露光時間で最大500ミリ秒の露光時間でも、シナプス小胞前駆体を追跡できる時間分解能が得られることを実証するために、分析に露光時間を含めました(図2C、D)。
フィジーによるキモグラフの生成と解析 キモグラフを生成し、個々の輸送イベントを解析するには、 図 3 の手順に従います。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66236/66236fig01.jpg"> 図1:内因性蛍光RAB-3の軸索輸送を可視化するモデルシステムの概要。 (A)上部パネル:示された前後軸および腹側背軸を有する線虫の概要。運動ニューロンDA9は青色とラベル付けされています。中央パネル:DA9コンパートメントが示されている上部パネルに示されているボックス化された領域を拡大します。アンパッサンシナプスは緑色で示されており、*は肛門を示しています。軸索は、外陰部を通過するまで背側神経索に続いていることに注意してください。赤いボックスは、シナプス異常領域の領域を示しています。下段:近位軸索の単焦点面における内因性GFP標識RAB-3の共焦点顕微鏡画像。シナプス異常領域には、より長い休止状態のRAB-3の小胞シンクがありますが、ほとんどのRAB-3シグナルはシナプス領域にクラスター化していることに注意してください。無シナプス領域は赤で囲まれています。スケール:20 μm. (B) 軸索輸送を視覚化するためのタイムラプス記録の代表的な画像。静止粒子上の個々の輸送粒子のトレーサビリティを強化するために、シナプス異常領域は最初に光退色されます。紫色のボックスで囲まれた領域の下部パネルは、順行性 (オレンジ色の矢印) と逆行性 (青色の矢印) 移動イベントの例を示しています。パネルは上から下に連続した時点を表します。(C)(B)のタイムラプス記録は、キモグラフ(位置上の時間を表す2D表現)としてプロットしました。対角線は、傾きが速度を示す移動イベントを表します。縦線は静止イベントを示します。紫色のボックスは、(B)にも示されている輸送イベントを強調するためのキモグラフの拡大表示で、順行性(オレンジ色)と逆行性(青)の輸送イベントが追跡されます。縦の破線は、一時停止しているイベントを示します。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66236/66236fig01large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66236/66236fig02.jpg"> 図2:取得ステップとパラメータを最適化して、内因性軸索貨物の視覚化を改善します。内因性GFP::RAB-3は、DA9軸索の非シナプスゾーンで視覚化され、共焦点回転ディスク顕微鏡で単一焦点面の画像を撮影しました。キモグラフは、順行性(右から左)および逆行性(左から右)方向(A-C)の個々の輸送イベントを視覚化するために取得されました。(A)キモグラフは、漂白ステップがない場合(左キモグラフ)または統合された漂白ステップがある場合のRAB3輸送イベントを示しています。漂白ステップにより、連続するトランスポート イベント (オレンジ色の矢印) 間の一時停止イベント (黄色の矢印で示される) の視覚化が向上することに注意してください。(B)2 x 2ビニングを実装すると、かすかなRAB3トランスポートイベントの信号強度を向上させるのに役立ちます。画像は300 msの露光時間で取得され、(C)露光時間を段階的に増加させる(左端の100 msから右端の500 msへ)ことで、個々の輸送イベントの信号強度が向上します。画像は、2 x 2ビニングで、最初の光退色ステップを使用して取得しました。すべてのキモグラフは合計 3 分間の持続時間を表示し、同じスケールで描画されるため、連続するイメージング ポイント間の時間経過が長いために取得タイム ポイントが少ないキモグラフは、キモグラフの全長が短くなります。(D)(A-C)のキモグラフからのバックグラウンド蛍光を差し引いた後の輸送イベントあたりの信号強度の定量化。ビニングとフォトブリーチステップは、300 msの露光時間で取得されたことに注意してください。100ミリ秒(n匹の動物= 2でn個のイベント= 27)、200ミリ秒(n匹の動物= 2でn個のイベント= 30)、300ミリ秒(n匹の動物で88匹= 6)、500ミリ秒(n匹の動物でn個のイベント= 12個= 1)、ビニングなしの300ミリ秒(n匹の動物= 3でn個のイベント= 31)、(w)ビニングで300ミリ秒(n匹の動物= 6でn個のイベント= 88)、および300ミリ秒のn個のイベントを使用した統計的比較、 漂白あり(n匹の動物= 6のnイベント= 88)および漂白なしの2 x 2ビニング。各データポイントは、ランダムに選択されたトレースに沿った単一の時点におけるバックグラウンド(軸索の細胞質)減算後の個々のRAB-3輸送イベントの信号強度を表します。露光時間は、Kruskal-Wallis検定を使用して比較し、続いてDunnの多重比較を行い、ビニングと写真の漂白をペアワイズMann-Whitney検定を使用して比較しました。エラーバーは標準偏差を示します。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66236/66236fig02large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66236/66236fig03.jpg"> 図3:キモグラフを生成し、個々の輸送イベントを測定するための段階的な手順(A)ビデオ録画をフィジーにロードした後、セグメント化されたラインツールを使用して、分析される軸索セグメントの長さに沿ってラインをトレースします。(B)キモグラフ(右パネル)は、左パネルに示されているパラメータを使用してKymoreslicewideプラグインを使用して生成されます。(C)個々の輸送イベントは、リニアラインツールでトレースされ、ROIマネージャーに保存されます。右側のパネルには、結果テーブルの生成に使用される測定設定が表示されます。(D)テーブルの結果は、トランスポートパラメータの計算に使用されます。ボックスは、プロトコルのメソッド セクションで説明されている重要なパラメーターを示します。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66236/66236fig03large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>

Living Caenorhabditis elegansにおける蛍光顕微鏡による内因性貨物の軸索輸送の可視化の最適化

Axonal transport is a prerequisite to deliver axonal proteins from their site of synthesis in the neuronal cell body to their destination in the axon. ...

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「カーゴマッピング」解析を用いた軸索貨物を移動するに分子モーターの構成を特徴づける

線虫ニューロンの細胞内輸送を分析するための固定化

本研究では、自由に利用可能な画像処理ツールを用いて、C.エレガンスにおけるシナプスサイズと局在化、筋肉形態、ミトコンドリア形状の定量的測定を概説する。このアプローチにより、C.エレガンスにおける将来の研究は、遺伝的変異の結果としての組織および小器官構造変化の程度を定量的に比較することを可能にする。...

カエモルハブ炎エレガンスにおける細胞構造と器官形態学の研究に関する定量的アプローチ

蛍光標識End結合タンパク質を用いて 生体内で 動的微小管をイメージングするプロトコルが提示された。...

インビボカエノハブディティス・エレガンスニューロンにおける微小管動態と向きの評価

トランスジェニック蛍光マウスを用いて、生きた動物における無傷の坐骨神経の運動軸索および感覚軸索内のシグナル伝達エンドソームおよびミトコンドリアの インビボ 軸索輸送を評価するための詳細なプロトコールが記載されている。...

軸索輸送の In Vivo イメージングのためのツールキットの拡張

このプロトコルは、老化中の C.エレガンスの...

老化中の C.エレガンス におけるミトコンドリア形態のイメージングと定量化

ここでは、広視野顕微鏡画像内の個々のワームを自動セグメンテーションするために開発した深層学習システムであるSegElegansを、その後ImageJなどの画像解析ソフトウェアで使用するために効果的に活用する方法を説明します。オンラインとオフラインの両方でシステムの利用方法を提供します。...

SegElegansを用いたC .エレガンス 蛍光画像の自動解析

学ぶ蛍光顕微鏡の最適化手法で、生きたCaenorhabditis elegansにおける内因性貨物の軸索輸送を可視化する方法です。時間制御ラベリングとアブレーションを組み合わせ、神経科学の研究に応用できます。

Living Caenorhabditis elegansにおける蛍光顕微鏡による内因性貨物の軸索輸送の可視化の最適化

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