Name: 腸粘膜免疫応答を解析するための免疫適格腸内チップモデル (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-05-24T14:10:00.000+00:00
Duration: 8 min 48 s
Description: 学ぶ免疫適格腸内チップモデルの構築法。流動を用いて3D構造を形成し、微生物叢を維持しながら腸粘膜免疫応答を解析する。感染症治療の分子標的発見に応用可能な革新的なin vitroモデルです。

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この作業は、Collaborative Research Center PolyTarget 1278 (プロジェクト番号 316213987) から V.D.W. と A.S.M. A.F. への財政的支援を受けており、A.S.M. はさらに、ドイツのエクセレンス戦略 - EXC 2051 - Project-ID 690 390713860 に基づくクラスター・オブ・エクセレンス「Balance of the Microverse」による財政的支援を認めています。Astrid Tannert 氏と Jena Biophotonic and Imaging Laboratory (JBIL) が共焦点レーザー走査型顕微鏡 ZEISS LSM980 へのアクセスを提供してくださったことに感謝いたします。 図 1C と 図 2 は Biorender.com を使用して作成されました。

免疫学的洞察のための強化された腸内チッププラットフォーム

<ol><li>Alonso-Roman, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organ-on-chip+models+for+infectious+disease+research%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Organ-on-chip models for infectious disease research.</a> Nat Microbiol. 9 (4), 891-904 (2024).</li>
<li>Fahrner, R., Groger, M., Settmacher, U., Mosig, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+integration+of+natural+killer+cells+in+a+microfluidically+perfused+liver+on-a-chip+model%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Res+Notes%22%5BJournal%5D)">Functional integration of natural killer cells in a microfluidically perfused liver on-a-chip model.</a> BMC Res Notes. 16 (1), 285(2023).</li>
<li>Raasch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidically+supported+biochip+design+for+culture+of+endothelial+cell+layers+with+improved+perfusion+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Biofabrication%22%5BJournal%5D)">Microfluidically supported biochip design for culture of endothelial cell layers with improved perfusion conditions.</a> Biofabrication. 7 (1), 015013(2015).</li>
<li>Deinhardt-Emmer, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Co-infection+with+Staphylococcus+aureus+after+primary+influenza+virus+infection+leads+to+damage+of+the+endothelium+in+a+human+alveolus-on-a-chip+model%5BTitle%5D)+AND+%22Biofabrication%22%5BJournal%5D)">Co-infection with Staphylococcus aureus after primary influenza virus infection leads to damage of the endothelium in a human alveolus-on-a-chip model.</a> Biofabrication. 12 (2), 025012(2020).</li>
<li>Kaden, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+%26+characterization+of+expandable+human+liver+sinusoidal+endothelial+cells+and+their+application+to+assess+hepatotoxicity+in+an+advanced+in+vitro+liver+model%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicology%22%5BJournal%5D)">Generation & characterization of expandable human liver sinusoidal endothelial cells and their application to assess hepatotoxicity in an advanced in vitro liver model.</a> Toxicology. 483, 153374(2023).</li>
<li>Maurer, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+three-dimensional+immunocompetent+intestine-on-chip+model+as+in+vitro+platform+for+functional+and+microbial+interaction+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">A three-dimensional immunocompetent intestine-on-chip model as in vitro platform for functional and microbial interaction studies.</a> Biomaterials. 220, 119396(2019).</li>
<li>Hoang, T. N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Invasive+aspergillosis-on-chip%3A+A+quantitative+treatment+study+of+human+aspergillus+fumigatus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Invasive aspergillosis-on-chip: A quantitative treatment study of human aspergillus fumigatus infection.</a> Biomaterials. 283, 121420(2022).</li>
<li>Kaden, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+of+intravenous+caspofungin+administration+using+an+intestine-on-chip+reveals+altered+Candida+albicans+microcolonies+and+pathogenicity%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Modeling of intravenous caspofungin administration using an intestine-on-chip reveals altered Candida albicans microcolonies and pathogenicity.</a> Biomaterials. 307, 122525(2024).</li>
<li>Shah, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microfluidics-based+in+vitro+model+of+the+gastrointestinal+human-microbe+interface%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">A microfluidics-based in vitro model of the gastrointestinal human-microbe interface.</a> Nat Commun. 7, 11535(2016).</li>
<li>Jaffe, E. A., Nachman, R. L., Becker, C. G., Minick, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culture+of+human+endothelial+cells+derived+from+umbilical+veins.+Identification+by+morphologic+and+immunologic+criteria%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Culture of human endothelial cells derived from umbilical veins. Identification by morphologic and immunologic criteria.</a> J Clin Invest. 52 (11), 2745-2756 (1973).</li>
<li>Mosig, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Different+functions+of+monocyte+subsets+in+familial+hypercholesterolemia%3A+Potential+function+of+cd14%2B+cd16%2B+monocytes+in+detoxification+of+oxidized+ldl%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Different functions of monocyte subsets in familial hypercholesterolemia: Potential function of cd14+ cd16+ monocytes in detoxification of oxidized ldl.</a> FASEB J. 23 (3), 866-874 (2009).</li>
<li>Peterson, M., Mooseker, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+enterocyte-like+brush+border+cytoskeieton+of+the+c2bbe+clones+of+the+human+intestinal+cell+line%2C+caco-2%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Characterization of the enterocyte-like brush border cytoskeieton of the c2bbe clones of the human intestinal cell line, caco-2.</a> J Cell Sci. 102, Pt 3 581-600 (1992).</li>
<li>Shin, W., Hinojosa, C. D., Ingber, D. E., Kim, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+intestinal+morphogenesis+controlled+by+transepithelial+morphogen+gradient+and+flow-dependent+physical+cues+in+a+microengineered+gut-on-a-chip%5BTitle%5D)+AND+%22iScience%22%5BJournal%5D)">Human intestinal morphogenesis controlled by transepithelial morphogen gradient and flow-dependent physical cues in a microengineered gut-on-a-chip.</a> iScience. 15, 391-406 (2019).</li>
<li>Kim, H. J., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gut-on-a-chip+microenvironment+induces+human+intestinal+cells+to+undergo+villus+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Integr+Biol+%28Camb%29%22%5BJournal%5D)">Gut-on-a-chip microenvironment induces human intestinal cells to undergo villus differentiation.</a> Integr Biol (Camb). 5 (9), 1130-1140 (2013).</li>
<li>Kim, H. J., Huh, D., Hamilton, G., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+gut-on-a-chip+inhabited+by+microbial+flora+that+experiences+intestinal+peristalsis-like+motions+and+flow%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Human gut-on-a-chip inhabited by microbial flora that experiences intestinal peristalsis-like motions and flow.</a> Lab Chip. 12 (12), 2165-2174 (2012).</li>
<li>Karra, N., Fernandes, J., James, J., Swindle, E. J., Morgan, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+membrane+properties+on+cell+growth+in+an+%27airway+barrier+on+a+chip%27%5BTitle%5D)+AND+%22Organs-on-a-Chip%22%5BJournal%5D)">The effect of membrane properties on cell growth in an 'airway barrier on a chip'.</a> Organs-on-a-Chip. 5, 10025(2023).</li>
</ol>

M.R.はDynamic42 GmbHのCEOであり、同社の株式を保有しています。A.S.M.はDynamic 42 GmbHの科学顧問であり、同社の株式を保有しています。

提示されたプロトコルは、免疫適格な腸オンチップモデルを生成するために必要な手順を詳述しています。免疫蛍光顕微鏡法、サイトカインおよび代謝物分析、フローサイトメトリー、タンパク質および遺伝子分析、透過性測定などの特定の技術と可能な読み出し方法について説明しました。
記載されたモデルは、初代HUVEC、単球由来マクロファージ、および単球由来樹状細胞で構成され、腸上皮細胞の3D層と共培養され、前に説明したように、粘液分泌、吸収性、腸内分泌性、およびパネート細胞様集団の側面を表す6,14。プロトコルの手順を実行する際には、いくつかの重要な点に留意する必要があります。すべてのステップで、マイクロ流体システム内で気泡の形成を防ぐ必要があります。したがって、バイオチップまたはチューブを取り扱うときは、常にピペットを逆方向に(2回目の停止から容量を取り、最初の停止までのみ分注する)してください。バイオチップ内の細胞に高圧またはせん断力がかかるのを防ぐために、バイオチップでピペッティングするときは、常に静かにピペットで反対側のチャンバーを閉じたままにしてください(たとえば、上部チャンバーで培地を交換するときは、それぞれのプラグで下部チャンバーを閉じます)。バイオチップは、PET膜の両側に細胞を播種することを可能にします。したがって、モデルは、PET膜の下に腸絨毛のような構造を持つか、膜上で上向きに成長するように設定できます。研究の関心に応じて、細胞の一方または他方の配向は、フロー培地に浮遊する循環細胞の重力補助細胞接着など、物理的相互作用の点で特定の利点を有する。
マイクロ流体媒体の流れにより、分極した腸細胞は、陰窩状および絨毛状構造に似た三次元組織を形成し、タイトジャンクションと接着ジャンクション6の密なネットワークによって深部の頂端組織バリアを形成します。さらに、統合された自然免疫細胞は腸のバリア機能を高め、ドナー特異的な免疫応答を含むさまざまな刺激に対するサイトカインおよび免疫細胞の応答を詳細に調べることができます3,6。このモデルは、ヒト腸の微生物共生物(Lactobacillus rhamnosus6など)および病原体(Candida albicans 6,8など)を研究するための生理学的に適切なプラットフォームを提供します。このモデルは、腸内微生物の組成変化と粘膜免疫応答の調節のメカニズムを調査するために活用されました6。本研究では、腸管腔の生理的免疫寛容を再現し、生きた微生物による恒常性定着をサポートする方法を示しました。さらに、プロバイオティクスのラクトバチルス・ラムノサスによるモデルの管腔側の事前コロニー形成は、in vivoの状況と同様に、カンジダ・アルビカンスの組織浸潤を減少させ、その血管コンパートメントへの転座を制限しました。この研究は、in vitroで生理学的に関連性のある条件下で腸の微生物相互作用、免疫応答、および病原性メカニズムを研究するためのモデルの可能性を証明しました。
しかし、このチッププラットフォームには、ヒトの腸を完全に表現できないがん由来の腸細胞の使用や、一次内皮細胞や免疫細胞の使用などの制限があります。低酸素培養条件は、灌流条件下で低酸素インキュベーターでモデルを培養することにより確立でき、ヒト腸の in vivo 状況をよりよく反映できます。
Kim et al.14,15 によって発表された「gut-on-a-chip」モデルなどの他の OoC プラットフォームと比較すると、提示された組織モデルを形成する初期細胞数は約 10 倍高くなっています。これにより、例えば、1つの実験で最大3つの免疫蛍光染色パネルを同時に解析することができます。細胞数の増加により、フローサイトメトリー、ウェスタンブロット解析、およびサイトカインプロファイリングや乳酸デヒドロゲナーゼ(LDH)測定などの細胞培養上清を必要とするその他の標準的な既製アッセイなどのエンドポイント解析がさらに効率化されます。1つの実験から複数の読み出しを得ることで、全体的なコストと実験時間が削減されます。業界インターフェースとフットプリント(チップの顕微鏡スライド形式、ルアーロック形式のポート、96ウェルマトリックス上に整列)を特徴とする標準化されたバイオチッププラットフォームにより、幅広いメーカーの既製のハードウェアソリューションを利用できます。これには、さまざまな材料と細孔サイズの多くのメンブレンも含まれます。孔径は、細胞増殖と組織完全性16、ならびに細胞遊走に影響を与える可能性がある。
要約すると、このプロトコルは、人間の腸環境の重要な要素を再現する、詳細で適応性の高い腸オンチップモデルを提示します。腸内細菌叢と腸内宿主組織に関する広範な研究を行うためのスケーラブルで効果的なプラットフォームを提供し、特に宿主の免疫応答と腸の病態生理学に焦点を当てています。したがって、このモデルは、従来の in vitro モデルとヒト生物学との間のギャップを埋める能力があり、腸の生物学に関する詳細な研究に不可欠なツールとなっています。

Organ-on-Chip(OoC)システムは、従来の2D細胞培養と動物モデルとの間のギャップを埋めることができる3D細胞培養の新たな技術です。OoCプラットフォームは、典型的には、メンブレンまたはハイドロゲル1のような広範囲の足場上で増殖した組織特異的細胞を含む1つ以上のコンパートメントからなる。モデルは、1つ以上の定義された器官型機能を模倣することができます。ポンプは、細胞の老廃物を除去するための細胞培養培地の連続的なマイクロ流体灌流、細胞分化を改善するための栄養因子と成長因子の供給、および必要なin vivo条件の再現を可能にします。免疫細胞の統合により、OoCシステムはin vitroでヒトの免疫応答を模倣することができます2。これまでに、さまざまな臓器や機能単位が発表されてきました1。これらのシステムには、血管系3、肺4、肝臓2,5、および腸6のモデルが含まれ、薬物試験5,7および感染研究6,8のために容易にすることができる。
ここでは、絨毛様および陰窩様構造の器官型3Dトポグラフィーを形成するヒト上皮細胞を統合し、内皮内層および組織常在マクロファージを組み合わせたヒト腸オンチップモデルを紹介します。このモデルは、マイクロ流体灌流バイオチップで顕微鏡スライドの形式で培養されます。各バイオチップは、2つの別々のマイクロ流体キャビティで構成されています。各キャビティは、多孔質ポリエチレンテレフタレート(PET)膜によって上部と下部のチャンバーに分割されています。膜自体は、細胞が両側で成長するための足場としても機能します。メンブレンの細孔は、細胞のクロストークと細胞層間の細胞移動を可能にします。各チャンバーには、2つのメスルアーロックサイズのポートからアクセスできます。オプションで、追加のミニルアーロックサイズのポートを使用して、上部または下部のチャンバーにアクセスできます(図1)。
OoCプラットフォームは、1回の実験から得られる多数の読み出しを提供します。インセプトオンチップは、灌流3D細胞培養、廃液分析、および蛍光顕微鏡法を組み合わせて、細胞マーカーの発現、代謝率、免疫応答、微生物のコロニー形成と感染、およびバリア機能を評価するように調整されています3,6,8。このモデルには、組織に常在する免疫細胞と、生きた微生物と宿主組織との直接接触が含まれており、これは他の公開モデルと比較して利点である9。さらに、上皮細胞は、生きた微生物叢とのコロニー形成に生理学的に関連性のあるインターフェースを提供する三次元構造に自己組織化します6。

<table><tbody><tr><td>96ウェルプレート ブラック、クリアボトム</td><td>サーモフィッシャー</td><td>10000631</td><td>消耗品</td></tr><tr><td>酢酸</td><td>ロス</td><td>3738.4</td><td>ケミカルズ</td></tr><tr><td>アレクサフルーア 488 アフィニピュア、ロバ、抗マウス IgG (H+L)</td> <td>ジャクソン免疫研究</td><td>715-545-150</td><td>二次抗体 血管染色および上皮染色</td></tr><tr><td>アレクサフロー 647 アフィニピュア、ロバ、抗ウサギ IgG (H+L)</td><td>ジャクソンImmuno Research</td><td>711-605-152</td><td>二次抗体上皮</td></tr>染色 <tr><td>Alexa Fluor 647, donkey, anti-rabbit IgG (H+L)</td><td>Thermo Fisher Scientific, Invitrogen</td><td>A31573</td><td>二次抗体 血管染色</td></tr><tr><td>Axiocam ERc5s カメラ</td><td>Zeiss</td><td>426540-9901-000</td><td>技術機器</td></tr><tr><td>基礎培地 MV、フェノールレッドフリー</td><td>プロモセル</td><td>C-22225</td><td>細胞培養消耗品</td></tr><tr><td>Biochip</td><td>Dynamic 42</td><td>BC002</td><td>マイクロ流体消耗品</td></tr><tr><td>BSAフラクションV</td><td>Gibco</td><td>15260-037</td><td>細胞培養消耗品</td></tr><tr><td>C2BBe1 (Caco-2のクローン)</td> <td>ATCC</td><td>CRL-2102</td><td>上皮細胞源</td></tr><tr><td>クロロホルム</td><td>シグマ</td><td>C2432</td><td>化学薬品</td></tr><tr><td>CO2インキュベーター</td><td>Heracell</td><td>150i</td><td>技術機器</td></tr><tr><td>ヒト胎盤由来コラーゲンIV</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5533</td><td>細胞培養消耗品</td></tr><tr><td>カバースリップ (24 x 40 mm; #1.5)</td><td>Menzel-Gl&auml;ser</td><td>15747592</td><td>消耗品</td></tr><tr><td>Cy3 AffiniPure, donkey, anti-goat IgG (H+L)</td><td>Jackson Immuno Research</td><td>705-165-147</td><td>二次抗体血管染色</td></tr><tr><td>Cy3 AffiniPure, donkey, anti-rat IgG (H+L)</td><td>Jackson Immuno Research</td><td>712-165-150</td><td>二次抗体上皮染色</td></tr><tr><td>Descosept PUR</td><td>Dr.Schuhmacher</td><td>00-323-100</td><td>細胞培養消耗品</td></tr><tr><td>DMEM 高グルコース</td><td>Gibco</td><td>41965-062</td><td>細胞培養消耗品</td></tr><tr><td>DMEM 高グルコース w/o フェノールレッド</td><td>Gibco</td><td>31053028</td><td>細胞培養消耗品</td></tr><tr><td>DPBS (-/-)</td><td>Gibco</td><td>14190-169</td><td>細胞培養消耗品</td></tr><tr><td>DPBS (+/+)</td><td>Gibco</td><td>14040-133</td><td>細胞培養消耗品</td></tr><tr><td>EDTA 溶液</td><td>Invitrogen</td><td>15575-038</td><td>細胞培養消耗品</td></tr><tr><td>内皮細胞増殖培地</td><td>プロモセル</td><td>C-22020</td><td>細胞培養消耗品</td></tr><tr><td>内皮細胞増殖培地サプリメントミックス</td><td>プロモセル</td><td>C-39225</td><td>細胞培養消耗品</td></tr><tr><td>エタノール96%、未変性</td><td>Nordbrand-Nordhausen</td><td>410</td><td>化学物質</td></tr><tr><td>ウシ胎児</td>血清 <td>invitrogen</td><td>10270106</td><td>細胞培養消耗品</td></tr><tr><td>フルオレセインイソチオシアネート (FITC)-デキストラン (3-5 kDa)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>FD4-100MG</td><td>化学薬品</td></tr><tr><td>蛍光実装培地</td><td>Dako</td><td>S3023</td><td>化学薬品</td></tr><tr><td>ゲンタマイシン (10mg/mL)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G1272</td><td>細胞培養消耗品</td></tr><tr><td>GlutaMAX Supplement (100x)</td><td>Gibco</td><td>35050061</td><td>細胞培養消耗品</td></tr><tr><td>Histopaque</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10771</td><td>細胞培養消耗品</td></tr><tr><td>Hoechst (bisBenzimid) H33342</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>14533</td><td>上皮染色</td></tr><tr><td>ホロトランスフェリン (5mg/mL) トランスフェリン、ホロ、ヒト血漿</td><td>ミリポア</td><td>616397</td><td>細胞培養消耗品</td></tr><tr><td>ヒト組換え GM-CSF</td><td>Peprotech</td><td>300-30</td><td>細胞培養消耗品</td></tr><tr><td>ヒト組換え M-CSF</td><td>Peprotech</td><td>300-25</td><td>細胞培養消耗品</td></tr><tr><td>照明装置</td><td>Zeiss</td><td>HXP 120 C</td><td>蛍光顕微鏡セットアップ</td></tr><tr><td>レーザー走査型顕微鏡</td><td>Zeiss</td><td>CLSM980</td><td>蛍光顕微鏡セットアップ</td></tr><tr><td>塩酸リドカイン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L5647</td><td>細胞培養消耗品</td></tr><tr><td>リポ多糖(LPS)</td><td>Sigma</td><td>L2630</td><td>細胞培養消耗品</td></tr><tr><td>ロフテックス ワイプ</td><td>ロフテックス</td><td>1250115</td><td>消耗品</td></tr><tr><td>低アタッチメントチューブ (PS, 5 mL)</td><td>ファルコン</td><td>352052</td><td>消耗品</td></tr><tr><td>トップキャップ用ルアーアダプター (M)</td><td>Mo Bi Tec</td><td>M3003</td><td>マイクロ流体消耗品</td></tr><tr><td>オス ミニルアープラグ 4 列、PP、不透明</td><td>マイクロ流体チップショップ</td><td>09-0556-0336-09</td><td>マイクロ流体消耗品</td></tr><tr><td>MEM 非必須アミノ酸溶液</td><td>Gibco</td><td>11140</td><td>細胞培養消耗品</td></tr><tr><td>メタノール</td><td>Roth</td><td>8388.2</td><td>化学</td></tr><tr><td>顕微鏡</td><td>Zeiss</td><td>Axio Observer 5</td><td>蛍光顕微鏡セットアップ</td></tr><tr><td>顕微鏡スライド</td><td>Menzel</td><td>MZ-0002</td><td>消耗品</td></tr><tr><td>モノクローナル、マウス、抗ヒト CD68 抗体 (KP1)</td><td>Thermo Fisher Scientific, Invitrogen</td><td>14-0688-82</td><td>一次抗体 血管染色</td></tr><tr><td>モノクローナル、ラット、抗ヒト E-カドヘリン抗体 (DECMA-1)</td> <td>Sigma-Aldrich, Millipore</td><td>MABT26</td><td>一次抗体 上皮染色</td></tr><tr><td>Multiskan Go プレートリーダー</td><td>サーモフィッシャー</td><td>51119300</td><td>技術機器</td></tr><tr><td>ノーマルロバ血清</td><td>Biozol</td><td>LIN-END9010-10</td><td>化学薬品</td></tr><tr><td>光学セクショニング</td><td>Zeiss</td><td>ApoTome</td><td>蛍光顕微鏡セットアップ</td></tr><tr><td>ペニシリン-ストレプトマイシン (10,000 U/mL)</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td>細胞培養消耗品</td></tr><tr><td>プラグ</td><td>コールパーマー</td><td>GZ-45555-56</td><td>マイクロ流体消耗品</td></tr><tr><td>ポリクローナル、ヤギ、抗ヒト VE-カドヘリン抗体</td><td>R&D Systems</td><td>AF938</td><td>一次抗体 血管染色</td></tr><tr><td>ポリクローナル、ウサギ、抗ヒト フォン・ヴィレブランド因子抗体</td><td>Dako</td><td>A0082</td><td>一次抗体 血管染色</td></tr><tr><td>ポリクローナル、ウサギ、抗ヒト ZO-1 抗体</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック、Invitrogen</td><td>61-7300</td><td>一次抗体 上皮染色</td></tr><tr><td>電源顕微鏡</td><td>ZEISS</td><td>Eplax Vp232</td><td>蛍光顕微鏡のセットアップ</td></tr><tr><td>プリモバート顕微鏡</td><td>ツァイス</td><td>415510-1101-000</td><td>技術機器</td></tr><tr><td>レグロICC蠕動ポンプ</td><td>イスマテック</td><td>ISM4412</td><td>技術機器</td></tr><tr><td>サハ(ボリノスタット)</td> <td>シグマ・アルドリッチ</td><td>SML0061-25MG</td><td>ケミカルズ</td></tr><tr><td>サポニン</td><td>フルーカ</td><td>47036</td><td>ケミカルズ</td></tr><tr><td>S-モノベット、7.5mL Zゲル</td><td>Sarstedt</td><td>01.1602</td><td>消耗品</td></tr><tr><td>S-Monovette, 9.0 mL K3E</td><td>Sarstedt</td><td>02.1066.001</td><td>消耗品</td></tr><tr><td>ピルビン酸ナトリウム</td><td>Gibco</td><td>11360-088</td><td>細胞培養消耗品</td></tr><tr><td>タンク 4.5 mL</td><td>ChipShop</td><td>10000079</td><td>マイクロ流体消耗品</td></tr><tr><td>トリパンブルーステイン 0.4%</td><td>Invitrogen</td><td>T10282</td><td>細胞培養消耗品</td></tr><tr><td>トリプシン</td><td>Gibco</td><td>11538876</td><td>細胞培養消耗品</td></tr><tr><td>チューブ</td><td>ダイナミック 42</td><td>ST001</td><td>マイクロ流体消耗品</td></tr><tr><td>ピンセット (Pr&auml;zisionspinzette DUMONT abgewinkelt Inox08, 5/45, 0,06 mm)</td><td>Roth</td><td>K343.1</td><td>消耗品</td></tr><tr><td>小麦 胚芽凝集素 (WGA)</td><td>Thermo Fisher Scientific, Invitrogen</td><td>W32464</td><td>上皮染色</td></tr><tr><td>X-VIVO 15</td><td>Lonza</td><td>BE02-060F</td><td>細胞培養消耗品, 造血細胞培地</td></tr><tr><td>Zellkultur Multiwell Platten, 24 Well, sterile</td><td>Greiner Bio-One</td><td>662 160</td><td>消耗品</td></tr><tr><td>Zellkultur Multiwell Platten, 6 Well,</td><td>Greiner Bio-One</td><td>657 160</td><td>消耗品</td></tr><tr><td>Zen Blue Software</td><td>Zeiss</td><td>Version 3.7</td><td>Microscopy Software</td></tr></tbody></table>

腸粘膜免疫応答を解析するための免疫適格腸内チップモデル

Immunocompetent Intestine-on-Chip Model for Analyzing Gut Mucosal Immune Responses

上皮の3D器官型絨毛様および陰窩様構造を再現する高度な腸オンチップモデルが開発されました。免疫適格モデルには、ヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVEC)、Caco-2腸上皮細胞、組織常在マクロファージ、樹状細胞が含まれ、これらは組織内で自己組織化し、ヒト腸粘膜の特性を反映しています。このプラットフォームのユニークな側面は、循環するヒト初代免疫細胞を統合し、生理学的関連性を高める能力です。このモデルは、細菌や真菌のコロニー形成や感染に対する腸管免疫系の反応を調べるために設計されています。キャビティサイズが拡大しているため、このモデルは、透過アッセイ、サイトカイン放出、免疫細胞浸潤などの多様な機能的読み出しを提供し、上皮細胞層によって形成される3D構造の免疫蛍光測定に適合します。これにより、細胞の分化と機能に関する包括的な洞察が得られます。このインタインオンチッププラットフォームは、微生物叢の代理とヒト宿主組織との間の微生物叢の代理と、微生理学的灌流バイオチッププラットフォーム内での複雑な相互作用を解明する可能性を実証しています。

これらの代表的な結果は、インタネインオンチップモデルの異なる組織層を示しています。それらは、プロトコルセクション11に記載されているように免疫蛍光染色されています。画像は、落射蛍光顕微鏡または共焦点蛍光顕微鏡でZスタックとして撮影され、直交投影に処理されました。顕微鏡のセットアップとソフトウェアの詳細については、材料の表を参照してください。図5は、HUVECとマクロファージからなるバリア形成内皮単層である血管層を示しています。内皮細胞にはVE-Cadherin因子、von Willebrand因子、マクロファージにはCD68などの代表的な細胞マーカーを染色します。C2BBe1細胞からなる三次元上皮層を図6と図7に示します。組織の完全性は、E-カドヘリンとZO-1の染色によって確認されます。予想されるすべての組織マーカーと組織分極の詳細な分析は、Maurer et al.6にあります。図8は、腸絨毛様構造の3次元成長を欠いた例示的な画像を示しています。一般的な三次元細胞層(図6)と比較して、染色された核の数は非常に少なく、細胞は単層にのみ存在します。この特定の表現型は、細胞増殖を阻害するヒストン脱アセチル化酵素阻害剤を細胞培養培地に添加することによって作成されました。バリア透過性は、FITC-デキストランを使用した透過アッセイによって評価されます。透過性は、図9Aに示すように、日和見病原性C.albicansに感染すると増加しました。感染は、サイトカインIL-1β、IL-6、IL-8、およびIL-10の血管培地上清への放出を増加させる(図9B)8。
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66603/66603fig05.jpg"> 図5:インタインオンチップの固定された血管側。 5日間の灌流後の血管関門の代表的な免疫蛍光画像。組織をメタノールで固定した。1 μm切片のzスタックを落射蛍光顕微鏡で取得し、このzスタックの直交最大投影を表示します。(A)核内のDNAをDAPIで染色した。(B)完全分化型単球由来マクロファージはCD68を発現し、血管組織全体に広がっています。(C)HUVECは、VE-カドヘリンなどの接着結合の形成により、組織の完全性を示すコンフルエント層を作成します。さらに、(D)フォン・ヴィレブランド因子はHUVECによって高度に表現されます。最後に、(E)すべてのマーカーがオーバーレイで表示されます。スケールバー = 100 μm。略語:DAPI= 4'、6-ジアミジノ-2-フェニルインドール;HUVECs = ヒト臍帯静脈内皮細胞。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66603/66603fig05large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66603/66603fig06.jpg"> 図6:腸の固定された上皮側-オンチップ。 ジャンクションタンパク質E-カドヘリンとZO-1を発現する5日間の灌流後の分極上皮細胞層の代表的な免疫蛍光像。組織をメタノールで固定した。1 μm切片のzスタックを落射蛍光顕微鏡で取得しました。この Z スタックの直交最大投影が表示されます。(A)核内のDNAをDAPIで染色した。タイトな上皮バリアは、(B)E-カドヘリンで染色された付着性ジャンクションと、(C)ZO-1で染色された頂端タイトジャンクションの形成によって形成されます。タイトジャンクションと接着ジャンクションは、(D)オーバーレイ画像に見られるように、頂端細胞膜で共局在します。スケールバー = 100 μm。略語:DAPI= 4'、6-ジアミジノ-2-フェニルインドール。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66603/66603fig06large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66603/66603fig07.jpg"> 図7:絨毛様の成長を伴う腸の固定された上皮側。 6日間の灌流後の三次元上皮細胞層の代表的な免疫蛍光画像。組織をカーノイの固定剤で固定しました。1μm切片のzスタックを共焦点レーザー走査型顕微鏡で撮影し、(A)このzスタックの直交最大投影を表示しています。核内のDNAをヘキストで染色しました。さらに、この組織を小麦胚芽凝集素であるレクチンで染色し、ヒトムチンを染色しました。(B)上皮の絨毛様および陰窩様構造の三次元成長は、zスタックのxおよびyセクションで検出できます。スケールバー = 50 μm。略語:WGA=小麦胚芽凝集素。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66603/66603fig07large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66603/66603fig08.jpg"> 図8:絨毛様の成長がない腸の固定された上皮側。 ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤であるスベロイルアニリドヒドロキサミン酸(SAHA)で処理し、細胞増殖を防止する上皮細胞層の代表的な免疫蛍光画像。組織をメタノールで固定した。1 μm切片のzスタックを落射蛍光顕微鏡で取得しました。この Z スタックの直交最大投影が表示されます。(A)核内のDNAをDAPIで染色した。(B)では接着接合部をE-カドヘリンで染色し、(C)ではタイトジャンクションをZO-1で染色します。タイトジャンクションと接着ジャンクションは、オーバーレイ画像(D)に示すように共局在します。スケールバー = 100 μm。略語:DAPI= 4'、6-ジアミジノ-2-フェニルインドール。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66603/66603fig08large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66603/66603fig09.jpg"> 図9:統合された自然免疫細胞の病原体依存性免疫応答: この図はKadenら8から改変されています。 C. albicans SC5314に非感染(-)または感染(+)した腸内モデルについて、(A)FITC-Dextran(3-5 kDa)の透過性および(B)サイトカイン分泌について分析しました。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66603/66603fig09large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>ソリューション/メディウム</td>
			<td colspan="2">組成</td>
		</tr><tr><td>コラーゲンストック溶液</td>
			<td colspan="2">0.5 mg/mL コラーゲン IV 液中 0.5 mM 酢酸</td>
		</tr><tr><td>アイソバッファ</td>
			<td colspan="2">PBS -/-、1 mg/mL ウシ血清アルブミン画分V、2 mM EDTA</td>
		</tr><tr><td>単球分化培地</td>
			<td colspan="2">造血細胞培地 + 10% ヒト自家血清 + 10 ng/mL 組換えマクロファージコロニー刺激因子 (M-CSF) + 10 ng/mL 組換え顆粒球マクロファージコロニー刺激因子 (GM-CSF)</td>
		</tr><tr><td>トリプシン解離試薬</td>
			<td colspan="2">0.25% トリプシン + 1 mM EDTA in PBS -/-</td>
		</tr><tr><td>単球剥離試薬</td>
			<td colspan="2">4 mg/mL リドカイン + 5 mM EDTA in PBS -/-</td>
		</tr><tr><td>ECコンディショニング媒体</td>
			<td colspan="2">EC-medium +10% ヒト自家血清 +10 ng/mL M-CSF + 10 ng/mL GM-CSF</td>
		</tr><tr><td>C2-ミディアム</td>
			<td colspan="2"></td></tr><tr><td></td><td colspan="2"></td></tr><tr><td></td><td colspan="2"></td></tr><tr><td></td><td colspan="2"></td></tr><tr><td></td><td colspan="2"></td></tr><tr><td></td><td colspan="2"></td></tr></tbody></table>

当社の詳細なプロトコルは、3D構造とさまざまな細胞タイプでヒトの腸粘膜をシミュレートし、微生物のコロニー形成に応答した免疫応答と細胞機能の詳細な分析を可能にする高度な腸オンチップモデルの作成と使用について概説しています。

An advanced intestine-on-chip model recreating epithelial 3D organotypic villus-like and crypt-like structures has been developed. The immunocompetent ...

私たちの研究は、免疫適格臓器チッププラットフォームの開発と使用に焦点を当てています。これらの生理学的に関連性のあるヒト化in vitroモデルを作成することにより、複雑な宿主と病原体の相互作用を研究することができます。私たちが生み出す知識は、感染症の治療のための分子標的を操作し、特定するために使用できます。重要な課題の1つは、in vitroで宿主組織と並んで恒常性条件下で生きた微生物叢を維持することです。これには、陰窩および絨毛構造の器官型3Dトポグラフィーとそれらの微生物コロニー形成の複製が含まれます。インセプリンオンチッププラットフォームは、フローを使用して器官型構造を形作り、細菌の過剰増殖を防ぐことでこれに対処します。これにより、安定した培養条件が確保されます。他の利用可能な腸内チッププラットフォームと比較して、当社のモデルは、初代組織に常在する免疫細胞が含まれているため、病原体に対するヒトの免疫応答の詳細な研究を可能にします。さらに、モデルサイズにより、1回の実験で複数の読み出しが可能になり、全体的なコストと実験回数が削減されます。当研究室では、人工多能性幹細胞を用いて、個別化医療を可能にする自家システムの開発に取り組んでいます。

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

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