Name: 蛍光In Situハイブリダイゼーションによるホルマリン固定パラフィン包埋サンプルにおける遺伝子増幅のロバスト検出 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-07-12T14:35:00.000+00:00
Duration: 3 min 55 s
Description: 学ぶFISH法によるFFPEサンプルの遺伝子増幅検出。最適化された前処理とハイブリダイゼーションで、がん進行におけるエクストラクロモソームDNAの分子機能を解明し、治療標的の探索に貢献します。

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SWは、テキサス州の癌予防研究所(RR210034)の学者であり、支援を受けています

この研究プロトコルは、テキサス大学サウスウェスタンメディカルセンターの治験審査委員会(IRB)によって承認されました。手術前にすべての患者からインフォームドコンセントが得られました。
1. 試薬・材料調製
<ol><li>8.212 mLのHCl(37% w/wまたは12.1 N)を491.788 mLのddH2Oにゆっくりと加えて、ドラフト内で0.2 Nの塩化ナトリウム(HCl)溶液を調製します。 注意: 水に酸をゆっくりと加えます。酸に水を加えないでください。</li>
	<li>1.47 gのクエン酸三ナトリウム(二水和物)を400 mLのddH2Oに溶解して、10 mMクエン酸溶液(pH 6.0)を調製します。HClを使用してpH 6.0に調整し、最終容量をddH2Oで500 mLにします。バッファーをRTで保存します。</li>
	<li>100 μL の Tween-20 を 900 μL の ddH2O に加えて、10% Tween-20 溶液を調製します。</li>
	<li>5 mLのIGEPAL CA-630を45 mLのddH2Oに加えて、10% IGEPAL溶液を調製します。</li>
	<li>44.1 gの三ナトリウム(二水和物)と87.65 gの塩化ナトリウム(NaCl)を900 mLのddH2Oに溶解して、20x SSC(pH 7.0、3 M NaCl、0.3 Mクエン酸ナトリウム)溶液を調製します。HClを使用してpH 7.0に調整し、最終容量をddH2Oで1000 mLにします。緩衝液をRTで保存します。</li>
	<li>100 mLの20x SSCを900 mLのddH2Oに加えて、2x SSC溶液を調製します。必要に応じて、0.5mLの防腐剤を加えます(材料表)。RTで保管してください。</li>
	<li>910 μL の ddH2O、500 μL の 20x SSC、50 μL の 10% Tween-20、40 μL の RNase A、1 mL の 50% デキストラン硫酸塩、および 2.5 mL のホルムアミドを混合して、プローブハイブリダイゼーションバッファーを調製します。1mLに分量し、-20°Cで保存します。</li>
	<li>100 mLの2x SSC、15 mLの10% IGEPAL、および385 mLのddH2Oを混合して、0.3% IGEPAL溶液で0.4x SSCを調製します。</li>
	<li>5 mLの10% IGEPALを495 mLの2x SSC溶液に加えて、0.1% IGEPAL溶液で2x SSCを調製します。RTで保管してください。</li>
	<li>使用前に、1 μLのProteinase Kを99 μLのTris-EDTAバッファーに加えて、Proteinase K消化バッファーを新たに調製します。</li>
	<li>1 mgのDAPIを1 mLのddH2Oに溶解して、1 mg/mLのDAPI保存ストックを調製します。-20°Cで光を避けて保存します。2x SSC溶液999 μLにDAPI保存ストック1 μLを加えて、DAPIワーキング溶液を調製します。使用するまで光を避けてください。</li>
</ol>2.サンプルの前処理
注:ここで使用しているスライドには試験片が含まれています。
<ol><li>スライドを60〜90°Cで20分間または一晩熟成させます(図1)。 注:このステップにより、パラフィンの融解が容易になります。通常、20分の加熱で十分です。スケジュールに合わせて一晩に延長することができます。</li>
	<li>スライドをキシレンまたはその代替品にCoplinジャーに10分間浸して脱パラフィンします。新鮮なキシレンまたはその代替品でこの手順を繰り返します。Coplinジャーで次のすべての前処理および洗浄手順を実行します。 注:キシレン代替品は、キシレンの安全で環境に優しい代替品です。代替品の1つ( 材料の表を参照)は、キシレンと同等に、またはそれ以上に機能します。キシレン代替品はキシレンよりも臭いが少ないですが、ドラフト内での使用をお勧めします。キシレン代替品にアクセスできない場合、すべての手順は、変更なしでキシレンベースの脱パラフィン処理に適合します。</li>
	<li>キシレン代替品を100%エタノールで5分間洗い流します。</li>
	<li>スライドを70%エタノール浸漬で5分間再水和します。</li>
	<li>スライドを0.2 N塩酸(HCl)に室温で20分間浸漬します。 注:HClは、塩基性核タンパク質などの酸可溶性タンパク質を効果的に抽出して、FISHプローブ11へのDNAアクセシビリティを改善します。</li>
	<li>スライドを10 mMの高温クエン酸溶液に浸し、90〜95°Cで20分間インキュベートします。 注:高温下でのクエン酸処理は、同様に酸可溶性タンパク質を抽出します。どちらの酸処理も、細胞外マトリックスタンパク質を抽出して自家蛍光を減少させると考えられています12。クエン酸溶液をスライドに塗布する前に、目的の温度範囲に予熱することをお勧めします。電子レンジはそのための便利な方法です。真空調理器などのウォーターバスは、高温インキュベーションに最も効果的で経済的なソリューションです。</li>
	<li>スライドを2x SSCで短時間すすぎ、pHを中和します。</li>
	<li>100-200 μL(切片のサイズによっては組織を完全に覆う程度)のProteinase K消化バッファーを添加して組織を消化し、室温で1分間インキュベートします。 注:プロテイナーゼK消化は、FISHプローブのアクセシビリティをさらに向上させ、自家蛍光を減少させます。消化時間は、組織の種類に基づいて最適化する必要があります。ほとんどの場合、1分間の消化で十分です。過剰消化はハロー状の核形態につながり、消化時間を短縮する必要があります。</li>
	<li>プロテイナーゼKの消化を直ちに停止し、スライドを70%エタノールに2分間浸漬して脱水し、続いて85%および100%エタノール処理をそれぞれ2分間行います。</li>
</ol>3. FISHとイメージング
<ol><li>2 μL の FISH プローブストックを 8 μL のハイブリダイゼーションバッファーで希釈して FISH ハイブリダイゼーションミックスを調製し、スライドに適用します。サンプルをカバースリップで覆います。 注:使用されるFISHプローブの合計ストックは、画質に応じて0.5〜4μLの範囲です。信号が低すぎる場合は、プローブ入力を増やします。バックグラウンドが高すぎる場合、特に核の外側に蛍光破片が観察される場合は、FISHプローブの入力を減らしてください。ハイブリダイゼーションバッファーは、市販のプローブに付属するものでも、セクション1のように調製したものでもよい。</li>
	<li>スライドをスライドモートハイブリダイゼーションシステムなどのホットプレートに置き、DNAを75°Cで2〜5分間変性させます。次に、スライドを37°Cに設定された別のホットプレートに移し、一晩でハイブリダイズします。 注意: ホットプレートにハイブリダイゼーション中に湿度を維持するためのウォータートレイまたはリザーバーがある場合、カバースリップをゴムセメントでシールする必要はありません。</li>
	<li>ハイブリダイゼーション後、スライドを0.3% IGEPAL CA-630洗浄バッファーを含む40〜60°C温めた0.4x SSCに浸し、カバースリップを慎重に取り外します。暗闇の中でそれぞれ5分間、最初の10〜15秒間攪拌しながら、洗浄を2回続けます。 注意: スライドを洗浄バッファーに浸すと、カバースリップが静かに解放されます。</li>
	<li>スライドをSSCで0.1%IGEPAL CA-630を使用して、暗闇のRTで5分間洗浄し、最初の10〜15秒間攪拌します。</li>
	<li>自家蛍光をクエンチするには、スライドを自家蛍光クエンチングキット( 材料表を参照)で150 μLの試薬(50 μL + 50 μL + 50 μL の試薬A、B、C)を2〜5分間適用し、2x SSCで5分間洗浄します。 注: これはオプションの手順です。組織の自家蛍光は、主にコラーゲンやエラスチンなどの細胞外マトリックス成分に由来します。また、リソソームやミトコンドリアにはリポフスチン、NADPH、フラビン補酵素が含まれているため、その影響も大きく受けます。アルデヒドの固定と血球の存在も自家蛍光を増加させる可能性があります13,14。</li>
	<li>DAPIでスライドを10分間染色します。スライドを2x SSCバッファーで5分間すすぎます。 注:スライドを自家蛍光クエンチングキットで処理しない場合、DAPI染色は2分に短縮できます。</li>
	<li>スライドを脱イオン水にすばやく1秒以内に浸し、ペーパータオルで余分な水分を吸収してすばやく乾かします。 注: これはオプションの手順です。脱イオン水処理は、スライド上のSSCバッファーの塩結晶の堆積を効果的に防止し、イメージング品質を向上させます。しかし、このような低イオン条件下では、FISHプローブと標的DNAとの間の水素結合が弱まり、プローブの解離やシグナル損失につながります。したがって、水処理ステップを非常に短時間維持することが重要です。</li>
	<li>スライドを乾燥させ、色あせ防止封入剤でマウントします。イメージングする前に、カバーガラスをマニキュアで密封します。 注:スライドを自家蛍光消光試薬で処理する場合は、製造元の指示に従って、スライドに退色防止封入剤を封入してください。さらに、封入剤の種類、硬化性または非硬化性に応じて、サンプルを1〜24時間硬化させてから、シールおよびイメージングする必要があります。イメージングに最適な屈折率を達成するために、サンプルを少なくとも一晩硬化させることをお勧めします。</li>
	<li>60×オイルレンズを使用して蛍光シグナルを捕捉します。DAPIチャンネルを使用してフォーカスを調整します。複数のZスタックを取得するようにしてください。通常、1μm間隔で5〜10個のzスタックで十分です。最高の解像度を達成するために、最大の3D投影を実行します。デコンボリューションまたはその他の背景クリアリングアルゴリズムを適用して、画質をさらに向上させます。</li>
</ol>

がん組織サンプル中の発がんドライバーのFISH解析の強化

<ol><li>ICGC/TCGA Pan-Cancer Analysis of Whole Genomes Consortium. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pan-cancer+analysis+of+whole+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Pan-cancer analysis of whole genomes.</a> Nature. 578 (7793), 82-93 (2020).</li>
<li>Wu, S., Bafna, V., Chang, H. Y., Mischel, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extrachromosomal+DNA%3A+An+emerging+hallmark+in+human+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Pathol%22%5BJournal%5D)">Extrachromosomal DNA: An emerging hallmark in human cancer.</a> Annu Rev Pathol. 17, 367-386 (2022).</li>
<li>Luebeck, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extrachromosomal+DNA+in+the+cancerous+transformation+of+Barrett%27s+oesophagus%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Extrachromosomal DNA in the cancerous transformation of Barrett's oesophagus.</a> Nature. 616 (7958), 798-805 (2023).</li>
<li>Nathanson, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+therapy+resistance+mediated+by+dynamic+regulation+of+extrachromosomal+mutant+EGFR+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Targeted therapy resistance mediated by dynamic regulation of extrachromosomal mutant EGFR DNA.</a> Science. 343 (6166), 72-76 (2014).</li>
<li>Kim, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extrachromosomal+DNA+is+associated+with+oncogene+amplification+and+poor+outcome+across+multiple+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Extrachromosomal DNA is associated with oncogene amplification and poor outcome across multiple cancers.</a> Nat Genet. 52 (9), 891-897 (2020).</li>
<li>Pal Choudhuri, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acquired+cross-resistance+in+small+cell+lung+cancer+due+to+extrachromosomal+DNA+amplification+of+MYC+paralogs%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Discov%22%5BJournal%5D)">Acquired cross-resistance in small cell lung cancer due to extrachromosomal DNA amplification of MYC paralogs.</a> Cancer Discov. 14 (5), 804-827 (2024).</li>
<li>Greytak, S. R., Engel, K. B., Bass, B. P., Moore, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accuracy+of+molecular+data+generated+with+FFPE+biospecimens%3A+Lessons+from+the+literature%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Accuracy of molecular data generated with FFPE biospecimens: Lessons from the literature.</a> Cancer Res. 75 (8), 1541-1547 (2015).</li>
<li>Chrzanowska, N. M., Kowalewski, J., Lewandowska, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+fluorescence+in+situ+hybridization+%28FISH%29+in+diagnosis+and+tailored+therapies+in+solid+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules%22%5BJournal%5D)">Use of fluorescence in situ hybridization (FISH) in diagnosis and tailored therapies in solid tumors.</a> Molecules. 25 (8), 1864(2020).</li>
<li>Cui, C., Shu, W., Li, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+in+situ+hybridization%3A+Cell-based+genetic+diagnostic+and+research+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Fluorescence in situ hybridization: Cell-based genetic diagnostic and research applications.</a> Front Cell Dev Biol. 4, 89(2016).</li>
<li>Finn, E. H., Misteli, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-throughput+DNA+FISH+protocol+to+visualize+genome+regions+in+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protoc%22%5BJournal%5D)">A high-throughput DNA FISH protocol to visualize genome regions in human cells.</a> STAR Protoc. 2 (3), 100741(2021).</li>
<li>Watters, A. D., Bartlett, J. M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+in+situ+hybridization+in+paraffin+tissue+sections%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Fluorescence in situ hybridization in paraffin tissue sections.</a> Mol Biotechnol. 21 (3), 217-220 (2002).</li>
<li>Richardson, S. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One-fits-all+pretreatment+protocol+facilitating+fluorescence+in+situ+hybridization+on+formalin-fixed+paraffin-embedded%2C+fresh+frozen+and+cytological+slides%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cytogenet%22%5BJournal%5D)">One-fits-all pretreatment protocol facilitating fluorescence in situ hybridization on formalin-fixed paraffin-embedded, fresh frozen and cytological slides.</a> Mol Cytogenet. 12, 27(2019).</li>
<li>Monici, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+and+tissue+autofluorescence+research+and+diagnostic+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Annu+Rev%22%5BJournal%5D)">Cell and tissue autofluorescence research and diagnostic applications.</a> Biotechnol Annu Rev. 11, 227-256 (2005).</li>
<li>Davis, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterizing+and+diminishing+autofluorescence+in+formalin-fixed+paraffin-embedded+human+respiratory+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J+Histochem+Cytochem%22%5BJournal%5D)">Characterizing and diminishing autofluorescence in formalin-fixed paraffin-embedded human respiratory tissue.</a> J Histochem Cytochem. 62 (6), 405-423 (2014).</li>
<li>Cancer Genome Atlas Network. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+molecular+portraits+of+human+breast+tumours%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Comprehensive molecular portraits of human breast tumours.</a> Nature. 490 (7418), 61-70 (2012).</li>
<li>Liang, Z., et al. Chromatin-associated RNA dictates the ecDNA interactome in the nucleus. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLiang%2C+Z+%22bioRxiv%22">bioRxiv</a>. , (2023).</li>
<li>Lange, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+evolutionary+dynamics+of+extrachromosomal+DNA+in+human+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">The evolutionary dynamics of extrachromosomal DNA in human cancers.</a> Nat Genet. 54 (10), 1527-1533 (2022).</li>
<li>Hung, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ecDNA+hubs+drive+cooperative+intermolecular+oncogene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">ecDNA hubs drive cooperative intermolecular oncogene expression.</a> Nature. 600 (7890), 731-736 (2021).</li>
<li>Storlazzi, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+amplification+as+double+minutes+or+homogeneously+staining+regions+in+solid+tumors%3A+origin+and+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Gene amplification as double minutes or homogeneously staining regions in solid tumors: origin and structure.</a> Genome Res. 20 (9), 1198-1206 (2010).</li>
<li>Guerin, T. M., Marcand, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Breakage+in+breakage-fusion-bridge+cycle%3A+an+80-year-old+mystery%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Genet%22%5BJournal%5D)">Breakage in breakage-fusion-bridge cycle: an 80-year-old mystery.</a> Trends Genet. 38 (7), 641-645 (2022).</li>
<li>Nguyen, H. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+mapping+and+accelerated+super-resolution+imaging+of+the+human+genome+using+in+situ+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">3D mapping and accelerated super-resolution imaging of the human genome using in situ sequencing.</a> Nat Methods. 17 (8), 822-832 (2020).</li>
<li>Deshpande, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploring+the+landscape+of+focal+amplifications+in+cancer+using+AmpliconArchitect%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Exploring the landscape of focal amplifications in cancer using AmpliconArchitect.</a> Nat Commun. 10 (1), 392(2019).</li>
<li>Rajkumar, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EcSeg%3A+Semantic+segmentation+of+metaphase+images+containing+extrachromosomal+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22iScience%22%5BJournal%5D)">EcSeg: Semantic segmentation of metaphase images containing extrachromosomal DNA.</a> iScience. 21, 428-435 (2019).</li>
</ol>

S.W.は、Dimension Genomics Inc.の科学諮問委員会のメンバーです。

FISHは、細胞遺伝学的診断のための迅速で手頃な価格のオプションです。特に、ecDNAががんに存在するかどうかを判断する際には、FISHの証拠が依然としてゴールドスタンダード1です。FFPE組織中のFISHは、患者の生検標本の遺伝子状態を迅速に決定することができるため、より迅速な診断と疾患の進行全体にわたる変化の追跡が可能になります。この手法は、病理学のためにすでに収集されている臨床サンプルの検査に特に価値があります。
このプロトコルには、いくつかの重要な手順が含まれます。最初のステップは、徹底的な脱パラフィンです。残留パラフィンは、FISHのハイブリダイゼーションを阻害する可能性があります。ステップ2後もサンプルがワックス状に見える場合は、新鮮なキシレンまたはその代替品で再度処理する必要があります。
第二に、タンパク質の抽出と消化が重要です。これらのプロセスは、FISHプローブへのDNAのアクセス性を高めるだけでなく、自家蛍光を大幅に低減します。このプロトコルには、3つの除タンパクステップが含まれています。0.2 N HClと10 mMのクエン酸による治療は簡単ですが、プロテイナーゼKの消化には最適化が必要な場合があります。過剰消化は、プロテイナーゼKを使用する際の最も一般的なエラーであり、ハロー状の核をもたらします。消化時間を短縮すると、核の形態が改善されます。さらに、最初のサンプルと最後のサンプルの間の時間差を最小限に抑えるために、4つ以上のサンプルを同時に分解しないことをお勧めします。無傷の核でさえ、高倍率および高解像度の顕微鏡下ではハローとして現れる可能性があることに注意することが重要です。これは、原子核が同じ焦点面上にないためです。したがって、複数のZスタックを取り、最大投影を実行して核の形態を検査することをお勧めします。
最後に、自家蛍光の消光をお勧めします。酸抽出とプロテイナーゼK消化はタンパク質由来のバックグラウンドを大幅に低減できますが、蛍光代謝物は依然としてイメージング品質に影響を与える可能性があります。
FISHは、局所的な遺伝子増幅の同定において比類のない空間分解能を提供しますが、限界があります。まず、PCRや次世代シーケンシング(NGS)ベースのアプローチと比較して、コンテンツとスループットが低いです。通常、1枚のスライドに異なる色の1〜3個のFISHプローブを、特殊な機器なしで1枚のスライドに適用できます。それにもかかわらず、自動化技術の進歩により、 in situ sequencing21のようなハイコンテントでハイスループットなFISHが実現可能になりました。次に、FISHプローブの設計には事前情報が必要です。がんにおける再発性焦点増幅事象を特定するための継続的な取り組みにより、実験室および臨床アプリケーション向けに事前に設計されたFISHパネルの作成が可能になりました。例えば、MYCファミリーのがん遺伝子は、小細胞肺がんにおいて化学療法抵抗性を媒介するためにecDNAとして頻繁に増幅されます。したがって、MYC、MYCL、およびMYCN遺伝子を標的とするFISHパネルは、生検における治療反応の決定を迅速化できます。それに比べて、NGSは、関心のある遺伝子のより偏りのないスクリーニングを可能にします。しかし、NGSベースの技術の中では、計算コストの高い解析22 による全ゲノムシーケンシングのみがecDNAを特徴づけることができる。
要約すると、FFPEサンプルの焦点遺伝子増幅を調査するための堅牢で包括的な手順を示します。FISHのシグナルパターンを調べることで、遺伝子座が増幅されるかどうか、またどのように増幅されるかが明確に明らかになります。間期核の画像解析23 に機械学習を統合して、コピー数や増幅形態(染色体またはecDNA)に関する細胞遺伝学的情報を抽出することで、分子診断プロセスの効率化とがんの発症メカニズムの理解が深まると期待しています。

限局性がん遺伝子増幅の研究は、がんの形成、進行、および治療抵抗性を促進するため、非常に重要です1。重要なことに、がん遺伝子と免疫調節遺伝子は染色体外DNA(ecDNA)として増幅する可能性があり、その非対称遺伝はがんの遺伝的不均一性を促進します2,3。ecDNAは、治療抵抗性と好ましくない臨床転帰に関連しています4,5,6。
ホルマリン固定パラフィン包埋(FFPE)組織標本は、病理学研究室の膨大なアーカイブリソースであり、レトロスペクティブ研究のための豊富な情報を提供します。しかし、PCRやシーケンシングによりFFPE検体から分子データを抽出することは、固定中の核酸の断片化、分解、架橋などの理由から困難です7。FFPE組織の分子解析に利用できる一連の技術の中で、蛍光 in situ ハイブリダイゼーション(FISH)は特定のDNA配列の視覚化に有効であることが証明されています8。
現代の分子診断技術の進歩にもかかわらず、FISHがシングルセルレベルで遺伝子増幅を視覚化および定量化する能力は、腫瘍形成と臨床転帰の根底にある分子メカニズムに関する貴重な洞察を提供します。目的の標的遺伝子に相補的な蛍光標識プローブを使用することにより、FISHはがん遺伝子の局在を便利に解決し、他の技術では不可能または高価である個々の細胞内のがん遺伝子増幅(ecDNAなど)の形態を推測できます。したがって、FISHは、腫瘍の不均一性とクローン進化を評価するための経済的な方法を提供します9。さらに、自動化、イメージング、および計算解析の進歩により、FISHデータのハイスループット解析が容易になり、大規模組織コホート10にわたる遺伝子増幅の堅牢な定量が可能になりました。
しかし、FISHをFFPE組織に適用すると、架橋アーチファクトやバックグラウンドの自家蛍光など、固有の課題があります。これらの障害を克服するには、正確で再現性のある結果を確保するために、各手順を慎重に最適化する必要があります。この論文では、FISHを適用してFFPE組織サンプルの遺伝子増幅を調査するための、完全に最適化されたステップバイステップのプロトコルを提供します。ERBB2(HER2)遺伝子座を標的とするプローブを使用して、FISHが乳がん患者のFFPEサンプルのERBB2増幅状態を堅牢に検出できることを実証します。ERBB2がecDNAとして増幅されるかどうかを推定することさえ可能です。既存の文献と実験結果を統合することにより、FISHベースの分析の方法論的考慮事項、技術的課題、および潜在的な落とし穴を解明します。また、さまざまながん種における遺伝子増幅プロファイリングの臨床的関連性についても議論し、その予後的意義と個別化治療戦略の可能性を強調します。
要約すると、この論文は、FFPE組織標本の遺伝子増幅を研究するための貴重なツールとしてのFISHの重要性を強調し、腫瘍生物学への比類のない洞察を提供し、腫瘍学における臨床的意思決定を導きます。FISHベースの分析は、補完的な分子アッセイによる継続的な改良と統合により、がんの病因に関する理解を深め、精密医療の時代における患者の転帰を改善する態勢を整えています。

<table><tbody><tr><td>DAPI</td>、<td>トクリス、バイオサイエンス</td><td>、5748</td><td>核染色、</td></tr><tr><td>デキストラン、硫酸塩、50%溶液</td><td>、EMD、ミリポア、シグマ</td><td>、S4030</td><td>、プローブ、ハイブリダイゼーションバッファー</td></tr><tr><td>、ERBB2(HER2)、FISHプローブ</td>、<td>エンパイアゲノミクス</td>、<td>ERBB2-20-RE</td>、<td>FISHプローブ</td></tr><tr><td>、エタノール</td><td>、デコンラボ、2716</td><td></td>、<td>脱水および水和組織</td></tr><tr><td>、ホルムアミド</td><td>、サーモサイエンティフィック化学薬品</td><td>205821000</td><td>プローブ ハイブリダイゼーションバッファー</td></tr><tr><td>フォーミュラ 83 (キシレン代替品)</td><td>CBG バイオテクノロジー</td><td>CH0104A</td><td>パラフィンの除去</td></tr><tr><td>塩酸</td><td>フィッシャーケミカル</td><td>A144-500</td><td>サンプル前処理</td></tr><tr><td>IGEPAL CA-630&nbsp;</td><td>Thermo Scientific Chemicals</td><td>J19628K2</td><td>スライド洗浄</td></tr><tr><td>Proclin 300</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>48914-U</td><td>SSC バッファー用防腐剤(オプション)</td></tr><tr><td>プロテイナーゼ K (800 units/mL)</td><td>New England Biolabs</td><td>P8107S</td><td>タンパク質消化</td></tr><tr><td>RNase A (20 mg/mL)</td><td>New England Biolabs</td><td>T3018L</td><td>プローブハイブリダイゼーションバッファー</td></tr><tr><td>スライドモートハイブリダイゼーションシステム</td><td>Boekel Scientific</td><td>280001</td><td>サンプルの変性とハイブリダイゼーション。代替のホットプレートも使用できます。</td></tr><tr><td>塩化ナトリウム</td><td>フィッシャーケミカル</td><td>S2713</td><td>SSCバッファー</td></tr><tr><td>クエン酸ナトリウム二水和物</td><td>フィッシャーバイオ試薬</td><td>FLBP3271</td><td>SSCバッファーおよびサンプル前処理</td></tr><tr><td>トリス-EDTA(TE)バッファー</td><td>フィッシャーバイオ試薬</td><td>BP2473500</td><td>プロテイナーゼK消化バッファー</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>フィッシャーバイオ試薬</td><td>BP337-500</td><td>プローブハイブリダイゼーションバッファー</td></tr><tr><td>ベクタシールド褪色防止封入剤</td><td>ベクターラボラトリーズ&nbsp;</td><td>H190010</td><td>スライド取付</td></tr><tr><td>Vector TrueVIEW</td><td>Vector Laboratories&nbsp;</td><td>SP8400</td><td>自家蛍光消光キット</td></tr></tbody></table>

蛍光in situハイブリダイゼーションによるホルマリン固定パラフィン包埋サンプルにおける遺伝子増幅のロバスト検出

Robust Detection of Gene Amplification in Formalin-Fixed Paraffin-Embedded Samples by Fluorescence In Situ Hybridization

染色体外DNA(ecDNA)などの限局性遺伝子増幅は、がんの発生と治療抵抗性に重要な役割を果たします。シーケンシングベースの方法論によりecDNAの偏りのない同定が可能になりますが、蛍光 in situ ハイブリダイゼーション(FISH)などの細胞遺伝学ベースの手法は、臨床検体中のecDNAを同定するための時間と費用対効果に優れています。ホルマリン固定パラフィン包埋(FFPE)組織サンプルへのFISHの適用は、特に生存可能な標本が核型検査に利用できない場合に、増幅された遺伝子を検出するためのユニークな方法を提供します。ただし、この手法にはコンセンサス手順が不足しています。このプロトコルは、このプロトコルが克服し標準化することを目指している独自の課題を提示するFFPE組織サンプル中のecDNAを含む遺伝子増幅を検出するためにFISHを実施するための包括的で完全に最適化された段階的な指示を提供します。このプロトコルに従うことで、研究者は遺伝子増幅を評価するための高品質なイメージングデータを再現性よく取得することができます。

HER2陽性乳がんとHER2陽性乳がんと陰性乳がんの両方からのFFPEサンプルを使用して、FISHイメージングの結果を実証しました。 HER2 ( ERBB2 遺伝子によってコードされる)の増幅は、HER2分子標的療法の利用可能性と有効性により、好ましいマーカーです。それどころか、HER2、エストロゲン受容体(ER)、およびプロゲステロン受容体(PR)の発現を欠くトリプルネガティブ乳がんの患者は、治療の選択肢が限られているため、転帰が悪いという課題に直面しています。したがって、 HER2 の状態を決定することは、乳がんの研究と治療において非常に重要です15。
トリプルネガティブ乳がんサンプルでは、ほとんどの核が HER2/ERBB2 FISHシグナルを表す2つの異なるドットを示しています。一部の核は、セクショニングバイアスによりドットが1つしかない場合があります(図2左)。対照的に、HER2陽性のサンプルは、2つの異なるパターンで豊富なFISHシグナルを示します。1つのパターンは、原子核全体に点在していることを示しています(図2中央)。このパターンは、ecDNAがユニークで組織化された核領域を占有しない可能性があるため、ecDNAの形態の特徴である16。さらに、有糸分裂中のecDNAの非対称的な偏属は、コピー数の変動を引き起こし、核間のシグナルの不均一性につながります17。一部の核は時折クラスターを示すことがあり、これはecDNAハブ18 を示しています(図2、右)。他のタイプのHER2増幅は、主に棒状の凝縮凝集体を示します。この形態は、均質染色領域(HSR)19 や切断融合ブリッジ(BFB)サイクル20など、染色体に基づく増幅を示している可能性が高い。特に、ecDNA、HSR、およびBFB増幅は、同じ核内で共存できます。したがって、焦点増幅の形態を推測するために、複数の核を調べることをお勧めします。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66978/66978fig01.jpg"> 図 1: FFPE サンプルの FISH の概略図。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66978/66978fig01large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66978/66978fig02.jpg"> 図2:乳がんFFPEサンプルの代表的なFISH画像。 倍率:600倍。スケールバー:10μmこの <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66978/66978fig02large.jpg" target="_blank">図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>

このプロトコールは、ホルマリン固定パラフィン包埋(FFPE)組織標本の遺伝子増幅を視覚化するための再現性のある方法を提供します。

蛍光In Situハイブリダイゼーションによるホルマリン固定パラフィン包埋サンプルにおける遺伝子増幅のロバスト検出

Focal gene amplification, such as extrachromosomal DNA (ecDNA), plays an important role in cancer development and therapy resistance. While ...

robust-detection-gene-amplification-formalin-fixed-paraffin-embedded

Research

JoVE Journal

Cancer Research

がん研究

ampliPHOX比色検出技術は、マイクロアレイの蛍光検出に安価な代替手段として提示されます。光重合に基づいて、ampliPHOXはわずか数分で肉眼で見える固体高分子スポットを生成します。結果はシンプルかつ強力なソフトウェアパッケージと一緒にして撮像し、自動的に解釈されます。...

インフルエンザのためのDNAマイクロアレイ上ampliPHOX比色検出

このビデオでは、mRNAプローブを特定の標的mRNAにハイブリダイズするシーケンシャルハイブリダイゼーション戦略について説明しています。プローブハイブリダイゼーションに続いて、組織学的サンプルのRNA-CISH中にシグナル対ノイズ比を減少させることにより分解能を向上させるために、シグナル増幅が行われます。...

RNA In Situハイブリダイゼーションにおけるプローブハイブリダイゼーションとシグナル増幅:組織切片中の特定のRNA配列を検出するための技術

我々は、動物モデルの組織切片内の永続的なDNAウイルスゲノムの検出のためのin situハイブリダイゼーションプロトコルにおいて蛍光を確立した。このプロトコルは、ウイルスゲノムのcodetection、そのRNA産物、および単一細胞内のウイルスまたは細胞タンパク質によって感染プロセスを研究できます。...

蛍光による神経組織の持続的なDNAウイルスのゲノム転写物の検出その場でハイブリダイゼーションは、免疫染色と組み合わせる

ここでは、スライドマウント染色体上の反復ヘテロクロマティック配列を可視化するために、蛍光DNAのin situハイブリダイゼーション(DNA...

蛍光DNAための簡単​​な方法<em&gt;その場で</em&gt;ぺしゃんこ染色体へのハイブリダイゼーション

このビデオの目的は、臨床の場で珍しい変異を検出するために、ホルマリン固定パラフィン包埋（FFPE）参照標準細胞株およびデジタル滴PCR（ddPCR）分析から、自動化されたDNAの抽出を実行する方法を実証することです。 FFPEサンプルにおける変異を検出することはFFPEサンプルでddPCRの臨床的有用​​性を示します。...

ホルマリン固定パラフィン包埋参照標準細胞株にBRAF V600E変異を検出するデジタルドロップレットPCRを採用

特定の細胞タイプへの遺伝子発現の局在化は、特異的な抗体がないために困難な場合があります。ここでは、ダブル蛍光 RNA in situ ハイブリダイゼーションと免疫染色を組み合わせることにより、遺伝子発現を 3...

ダブル蛍光を組み合わせます<em&gt;その場で</em&gt;マウス脳切片の3遺伝子の発現を検出するための免疫標識とのハイブリダイゼーション

HER2 のプロトコルは、非相互リンク、無料のホルマリン組織固定液を使用して低温保存とホルマリン固定の利点を結合する魚します。

記載されている RNAその場で交配のプロトコルでは、全体のショウジョウバエの胚または切り裂かれたティッシュで RNA の検出をことができます。96 ウェル マイクロ...

ショウジョウバエの胚とパスチラミドシグナル信号増幅を利用した生体表面の高解像度蛍光In Situハイブリダイゼーション

Expansion-Assisted Iterative Fluorescence In Situ Hybridization(EASI-FISH)は、拡大顕微鏡法と蛍光in...

Expansion-assisted iterative Fluorescence In Situ Hybridizationを用いたInsact Drosophila Brainにおける遺伝子発現のマルチプレックス検出

このプロトコルは、マイクロRNAおよびマルチプレックスタンパク質を同時に検出および定量するためのホルマリン固定パラフィン包埋組織を用いたタンデム免疫蛍光ハイブリダイゼーションアッセイを記述している。...

新しい検出および定量法としてのロック核酸 in situ ハイブリダイゼーションによるマイクロRNA増幅と認識

学ぶFISH法によるFFPEサンプルの遺伝子増幅検出。最適化された前処理とハイブリダイゼーションで、がん進行におけるエクストラクロモソームDNAの分子機能を解明し、治療標的の探索に貢献します。

蛍光In Situハイブリダイゼーションによるホルマリン固定パラフィン包埋サンプルにおける遺伝子増幅のロバスト検出

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