ヒト好中球細胞外トラップ放出のリアルタイムハイスループット顕微鏡定量とアンタゴニストの薬理学の評価
2024年10月18日
この定義されたプロトコルは、 in vitroでヒト好中球の細胞外トラップ(NET)放出を視覚化および定量するためのリアルタイムのハイスループット顕微鏡アプローチを説明しています。再現性のある方法により、異なるNETosis誘導剤による刺激によるNET放出の特性と動態の調査が可能になり、NETosisアンタゴニストの薬理学の評価が可能になります。
私たちは、好中球の細胞外トラップまたはNETを定量するためのリアルタイム顕微鏡法を開発しました。これらのNETは、自然免疫防御に重要な役割を果たしています。しかし、組織内にNETsが蓄積すると、複数の炎症性疾患や自己免疫疾患の病態生理に寄与することが明らかになっています。
NETsの病理学的な意味合いから、NETosis拮抗薬の開発に対する関心が高まっています。NETosis阻害を研究するために、ヒトNETリリースを定量化するためのリアルタイム顕微鏡法を開発し、NETosisとその阻害をハイスループットで研究することを可能にしました。好中球は敏感な細胞であり、機械的、微生物的、その他の種類のストレスにより、精製プロセス中に刺激に対する反応性を変化させる可能性があります。
したがって、好中球の活性化を最小限に抑えるために、好中球単離プロトコルを検証することが重要です。したがって、この手法により、健康な個人と病気の個人からのNET放出の研究が可能になります。さらに、さまざまな生理学的刺激によって誘発されるNET形成の動力学を研究することができます。
このハイスループット顕微鏡技術により、シトルリン化ヒストン2Aおよび4を標的とするモノクローナル抗体であるNETosisアンタゴニストCIT-013が、IC 50または4.6ナノモルでNET放出を効率的に阻害できることを実証することができました。このことは、このアッセイがNETosisアンタゴニストの試験に適していることを示しています。健康なボランティアから末梢血をリチウムヘパリンチューブで採取した後、血液を新鮮な50ミリリットルチューブに移します。
リチウムヘパリンチューブをDPBSですすぎ、同じ50ミリリットルチューブに移して、血液とDPBSの比率が1:1であることを確認します。混合後、密度勾配溶液の上に希釈した血液を加えます。血液を400Gで40分間遠心分離し、最小限の加速と休憩で行います。
10ミリリットルのピペットで上部のプラズマ層を廃棄します。次に、プラスチック製のパスツールピペットを使用して、末梢血単核細胞と密度勾配溶液を廃棄します。赤血球と好中球を含む層を静かに振とうしてから、15ミリリットルのDPBSに再懸濁します。
25ミリリットルの6%デキストランと0.9%塩化ナトリウム溶液を加え、チューブを反転させて混合します。25分間のインキュベーション後、10ミリリットルのピペットで上部の好中球層を新鮮な50ミリリットルのチューブに移し、500Gで10分間遠心分離します。チューブをデカントして上清を捨て、ペレットを10ミリリットルの塩化アンモニウムカリウム溶解緩衝液に再懸濁します。
同じ溶解バッファーを40ミリリットル加え、溶液が半透明になるまでチューブを連続的に反転させながら室温でインキュベートします。チューブを350Gで10分間遠心分離します。上清を取り除いた後、ゆっくりと滴下して、好中球を懸濁液にせずに、好中球ペレットの上に5ミリリットルの培地、10%を加えます。
好中球ペレットの上部に存在する赤血球のほとんどが培地に再懸濁されるまで、チューブを静かに渦巻かせます。上清を除去した後、好中球ペレットを10ミリリットルの培養培地に再懸濁し、10%完全に再懸濁したら、最大50ミリリットルの培養培地を10%追加し、混合物を遠心分離してから、ペレットを10ミリリットルの好中球細胞外トラップまたはNETアッセイバッファーに再懸濁します。まず、96ウェルプレートの各ウェルに0.001%ポリ-L-リジン溶液を加え、摂氏37度で1時間インキュベートします。
200マイクロリットルのDPBSでウェルを3回洗浄し、ウェルを風乾します。次に、必要な数の好中球をNeutrophil Extracellular TrapまたはNETアッセイバッファーに再懸濁します。NETアッセイバッファー中の4倍濃縮DNA色素を各ウェルに移します。
NETアッセイバッファー中の4倍濃縮NETosis刺激を対応するウェルに加えます。次に、NETアッセイバッファーおよび好中球懸濁液中の4倍に濃縮されたNETosisアンタゴニストを対応するウェルに加えます。プレートを100 Gで2分間遠心分離します。
次に、プレートをインキュベーターに設置した生細胞顕微鏡分析システムに、摂氏37度、二酸化炭素5%で挿入します。好中球懸濁液を含む96ウェルイメージングプレートを生細胞顕微鏡分析システムに置いた後、システムソフトウェアを開きます。[スケジュール] をクリックして取得し、プラス ボタンをクリックして起動します。
次に、[スケジュールに従ってスキャン]を選択し、[次へ]をクリックします。新しい船を最初から作成するには、船舶の作成セクションで新規を選択し、次へをクリックします。「スキャン・タイプ」セクションで、「標準」を選択し、「次へ」をクリックします。
スキャン設定をセルごとに選択し、なしを選択します。画像チャネル、緑の位相コントラスト。取得時間、100ミリ秒、対物レンズ20倍。
次に、「次へ」をクリックします。「Vessel Selection」セクションから、スキャンする適切なタイプの船舶を選択し、「Next」をクリックします。容器のドロワー内の位置を指定し、[次へ] をクリックします。
[スキャンパターン]セクションで、スキャンする必要のあるウェルとウェルごとの画像の数を選択します。「次へ」をクリックします。「Vessel Notebook」セクションで、船舶に関する情報を入力します。
プレート名を入力し、[次へ]をクリックします。「解析設定」セクションで、「解析を延期」を選択し、「次へ」をクリックします。「スキャン・スケジュール」セクションで、「次の間隔でスキャンする新しいスケジュールを作成する」を選択し、「スキャンをスケジュールに追加」セクションで「1 時間」を選択します。
[最初のスキャンから 5 時間後にスキャンを停止する] を選択します。[次へ] をクリックし、[追加] をクリックして、スキャン情報が正しいときにスケジュールを設定します。好中球の位相差画像と免疫蛍光画像を取得した後、生細胞顕微鏡解析ソフトウェアを起動します。
ビューから、解析する生細胞顕微鏡実験を選択します。「新規分析定義の作成」を選択し、「次へ」をクリックします。次に、[Analysis Type] セクションから [Basic Analyzer] を選択し、[Next] をクリックします。
「イメージチャネル」セクションで、緑色を選択し、フェーズの選択を解除して、「次へ」をクリックします。画像レイヤーウィンドウを開き、緑色を選択してフェーズの選択を解除します。緑色のセクションで自動スケールをオフにし、最小と最大を手動で設定します。
次に、容器のスキャン時間ウィンドウを開き、NETを使用したポジティブコントロールウェルを表す画像を選択します。解析定義設定ウィンドウを開き、オブジェクト名にNETsを書き込みます。セグメンテーションには、[アダプティブ] を選択します。
しきい値 GCU の場合は、3 から 5 まで選択し、[Edge Split On] をマイナス 10 から 0 の間で設定します。次に、クリーンアップのために、[穴埋め]を100平方マイクロメートルに選択し、サイズをマイナス1ピクセルに調整します。[フィルター] から、200 平方マイクロメートルを超える領域、24.6 未満の [平均強度] 、7, 000 を超える [統合強度] を選択します。
次に、[現在のプレビュー] または [すべてプレビュー] をクリックして設定を適用します。さまざまな NET 構造にカーソルを合わせ、解析設定を調整して、偽陽性と偽陰性の NET を微調整します。NET 分析の設定が正しい場合は、[次へ] をクリックします。
「スキャン時間とウェル」セクションで分析するタイムポイントとウェルを選択し、「次へ」をクリックします。「Analysis Definition の保存と適用」セクションに定義名を挿入し、「Next」をクリックします。解析情報が正しいことを確認したら、[完了] をクリックします。
目的の容器内の解析をクリックして、実験解析を開きます。次に、グラフ メトリック ウィンドウを開きます。次に、プラスボタンをクリックしてメトリックを作成します。
データを NET Confluency の割合で表示する場合は、[メトリック] セクションで [面積] を選択し、[値] セクションで [Confluence] を選択します。NETting好中球の割合としてデータを表示する場合は、[メトリック]セクションで[オブジェクト数]を選択し、[値]セクションで[画像ごと]を選択します。メトリック設定を構成した後、ユーザー定義のメトリック セクションで、[NETs Area Confluence] または [NETs Object Count Per Image] を選択します。
分析に必要なすべての時点とウェルを、Select ScansセクションとSelect Wellセクションからそれぞれ選択します。最後に、[データのエクスポート] をクリックします。カルシウムイオノフォア刺激は、PMAと比較してより速いNETosisを誘発し、その結果、NETを放出する好中球の割合が高かった。
カルシウムイオノフォアによって誘導されたNETは、好中球の原形質膜を超えてより拡散したが、PMAによって誘発されたNETは好中球の原形質膜に近いままであった。好中球がコーティングされた免疫複合体、FMLP、および尿酸ナトリウム結晶で活性化されたときに、NETレベルの上昇傾向が観察されました。23187に応答したNET放出は、4.6ナノモルの半値阻害濃度でCIT-013によって完全に阻害されました。
概要
この研究は、ヒトの好中球細胞外トラップ（NET）放出をin vitroで視覚化し定量化するためのリアルタイム顕微鏡法を提示しています。これは自然免疫防御と炎症性疾患におけるNETの役割を理解する上で重要です。開発されたプロトコルにより、NET形成とNETosis拮抗剤の効果の高スループット分析が可能になります。
主要な研究構成要素
研究領域
- 自然免疫防御
- 好中球生物学
- 炎症性および自己免疫疾患
背景
- NETは様々な疾患の免疫応答および病態生理に寄与しています。
- その病理学的意味から、NETosis拮抗剤への関心が高まっています。
- 活性化を最小限に抑えるために好中球分離プロトコルを最適化することの重要性。
使用された方法
- 高スループットリアルタイム顕微鏡
- 生物学的システムとしてのヒト好中球
- NET放出と阻害をテストするためのアッセイ
主な結果
- CIT-013によるNET放出の効果的な阻害をIC50が4.6ナノモーラーで実証しました。
- NET放出の動態と拮抗剤の薬理学を評価するための再現可能な方法を確立しました。
- NETosis阻害剤をテストするためのアッセイを検証しました。
結論
- この研究は、NET放出メカニズムの理解を進める方法を示しています。
- NETを含む疾患に対する治療戦略の開発に重要な可能性を秘めています。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Quantitative, high-throughput microscopy for NETosis enables robust target validation and pharmacological profiling of NETosis antagonists in early discovery. This platform addresses the need for standardized, reproducible assessment of NET release kinetics and antagonist efficacy, directly impacting inflammatory and autoimmune disease portfolios. Real-time, semi-automated analysis supports predictive confidence and de-risks advancement of NET-targeted therapeutics.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct interrogation of NETosis mechanisms and antagonist effects in human neutrophils.
- Supports functional target validation by quantifying NET release in response to disease-relevant and non-physiological stimuli.
- Facilitates mechanistic de-risking by distinguishing NETs from non-netting activated neutrophils.
- Provides quantitative IC50 data for antagonist potency, informing portfolio triage.
Screening & Assay Development
- Delivers high-throughput, semi-automated quantification of NET release for scalable compound screening.
- Standardizes assay conditions and readouts, improving reproducibility across experiments and teams.
- Generates robust, quantitative outputs (e.g., NET area confluence, object count) for reliable compound evaluation.
- Enables screening of NETosis antagonists against multiple stimuli and disease-relevant triggers.
Translational & Preclinical Research
- Aligns NET quantification with disease-relevant stimuli, supporting translational biomarker strategies.
- Enables continuity from discovery through preclinical validation by using primary human neutrophils from healthy and diseased donors.
- Supports risk-adjusted advancement decisions for NET-targeted therapeutics.
Pipeline & Workflow Integration
This real-time microscopy method integrates from early discovery through lead identification and preclinical validation for NETosis-targeted programs.
- Discovery Biology: Provides quantitative hypothesis testing and pathway clarification for NETosis mechanisms.
- Screening: Offers assay readiness and reproducibility for high-throughput antagonist evaluation.
- Analytics: Delivers quantitative metrics (NET area, object count, IC50) to compare antagonist efficacy and NET release kinetics.
- Translational Research: Connects in vitro NET quantification to disease-relevant triggers and patient-derived samples.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable, standardized platform for NETosis research and pharmacology across programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in NETosis-targeted discovery.
- Operational Value: Enhances standardization, reproducibility, and scalability for NET quantification workflows.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by providing robust pharmacological data early.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization and advancement of NETosis antagonist candidates.
Implementation Considerations
- Requires expertise in neutrophil isolation and live-cell microscopy analysis.
- Needs access to high-content imaging platforms and compatible analysis software.
- Demands cross-team standardization of assay setup and analysis parameters.
- Adaptable to both healthy and diseased donor samples for broader translational relevance.
- Dependent on careful validation of neutrophil purity and activation state to ensure data integrity.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:00
Introduction
1:48
Neutrophil Isolation from Human Peripheral Blood for Assessing Pharmacology of NETosis Antagonists
4:25
Optimized Assay for NETosis Analysis Using Multiple 96‐Well Imaging Plates with Stimuli and Antagonists
5:37
Configuring Live Cell Microscopy Analysis System Software for the Phase Contrast and Immunofluorescence Imaging of Neutrophils
7:27
Analyzing Neutrophil Extracellular Trap (NET) Formation Using Live Imaging Microscopy Software
