スペクトラルフローサイトメトリーにより固形組織から単離された細胞懸濁液の分析

このスペクトラルサイトメトリー技術の全般的な目的は、蛍光色素の放出スペクトル全体を用いて、異なるフルオロクロムを区別することです。さらに、本プロトコルではオートフルオレッセンスを独立したパラメータとして実装できるため、実質臓器から単離された細胞の適切な解析が可能になります。この手法は、希少な細胞集団をどのように同定するかといった、免疫学や幹細胞生物学の発達分野における重要な問いに答えるのに役立ちます。

この手法の主な利点は、多数のパラメータを同時に解析でき、かつ固体組織の自家蛍光を制御できるという独自の能力にあります。本手法では腸管および心臓由来の単一細胞懸濁液の調製に使用していますが、肺、骨格筋、肝臓、脂肪、腎臓などの他の臓器にも適用可能です。まず、成マウスから小腸を摘出し、洗浄します。

次に、組織をペーパータオルの上に置き、鋭い鋏を用いてパイエル板を慎重に除去します。腸管を縦方向に切開して開き、1 cm ずつに分割します。その後、組織を 10% FCS を添加した 30 mL の HBSS が入ったビーカーに移し、37 °C で絶えず撹拌しながら 30 分間インキュベートします。

インキュベーションが完了したら、細胞懸濁液を15 mLのプラスチックチューブに移し、5分間激しくボルテックスします。次に、懸濁液を氷上で10分間インキュベートし、解離していない大きな断片を沈殿させます。その後、上清を新しいチューブに移し、細胞を120 ×gで7分間遠心分離します。

ペレット化した後、細胞を1% FCS含有HBSS 10 mLに懸濁し、ノイバウエル室を用いて細胞数を計数します。細胞染色に先立ち、陰性対照を調製するため、腸細胞1×10⁶個を5 mLチューブに移します。サンプルを調製するには、新しい5 mLチューブに腸細胞1×10⁶個を加え、続いて1% FCS含有HBSS 2 mLを加え、この懸濁液を4°C、120×gで5分間遠心分離します。

上清を捨てた後、細胞を50 µLの抗体溶液に懸濁させます。チューブをアルミホイルで包み、4 °Cで20分間インキュベートします。インキュベーションが完了したら、サンプルに1% FCS含有HBSSを2 mL加え、4 °C、120 ×gで5分間遠心分離します。

上清を捨て、ペレットを200 µLの0.5 µg/mLプロピジウムヨード溶液で再懸濁します。マウス胚の頭部を切除した後、あらかじめ湿らせたペーパータオルを敷き、1% FCS含有HBSSを50 mL満たしたシャーレに胚の体を浸します。実体顕微鏡下で、胚の胸部の右側に切開を加え、心臓を傷つけないように注意しながら胸腔を開きます。

大血管を把持し、肺および胸腺に繋がった状態で心臓を摘出します。これらの臓器を、1% FCS含有HBSS 2 mLを満たした35 mLペトリ皿に移します。その後、周囲の臓器および結合組織から心臓を分離します。

心臓を洗浄した後、あらかじめ温めておいた酵素溶液1 mLに浸し、実体顕微鏡下で微細ピンセットとメスを用いて、組織を1 mm³の大きさに細切します。さらに温めた酵素溶液1 mLを加え、細切した組織をキャップ付きの5 mLチューブに移します。サンプルを水平に置き、37 °Cで15分間インキュベートします。

インキュベーション完了後、P1000ピペットで懸濁液を繰り返しピペッティングし、組織を均質化します。次に、未消化の組織片が沈殿するまで、サンプルを垂直に立てた状態で放置します。その後、上清を50 millilitersチューブに移します。

10% FCS含有HBSSを2 mL加え、単離した細胞を氷上で保持します。次に、未消化の組織沈殿物を含む5 mLチューブに、あらかじめ加温した酵素溶液を2 mL加え、組織が消失するまで前述の手順に従って組織の消化を続けます。得られた細胞懸濁液を120 ×gで10分間遠心分離します。

次に、上清を捨て、カルシウムおよびマグネシウムカチオンを含まないHBSS中の1% FCS 1 mLで細胞を再懸濁します。心筋細胞を染色するため、細胞懸濁液200 µLをラウンドボトム96ウェルプレートの各ウェルに分注します。プレートを480 ×gで1分間遠心分離し、上清を捨てます。

次に、心筋細胞を100 µLの抗体溶液に再懸濁します。プレートをアルミホイルで包み、4 °Cで20分間インキュベートします。インキュベート終了後、カルシウムおよびマグネシウム不含HBSSに1% FCSを添加した溶液200 µLで心筋細胞を洗浄し、懸濁液を480 ×gで1分間遠心分離します。

次に、カルシウムおよびマグネシウムイオン不含HBSS中の1% FCS 200 µLで細胞を再懸濁し、カルシウムおよびマグネシウム不含HBSS中の1% FCS 200 µLをあらかじめ満たした5 mLチューブに懸濁液を移します。最後に、0.5 µg/mLのプロピジウムヨードを含むカルシウムおよびマグネシウムカチオン不含HBSS中の1% FCS 400 µLを加え、細胞懸濁液を70 µmナイロンメッシュでろ過します。細胞を可視化するために、染色したサンプルをフローサイトメーターにロードして「preview」をクリックし、「acquire」をクリックしてサンプル中の最大2×10⁶イベントを記録します。

解析タブでカラーパレットウィンドウを開き、各パラメータに対応するフルオロクロームを追加して、解析対象となるすべてのパラメータを登録します。この際、自家蛍光と生存率のパラメータを必ず含めてください。コントロールウィンドウのチューブリスト内で、コンペンセーションビーズを含む最初のシングルスタインサンプルの解析を行います。

次に、ワークシートでポリゴンデザインツールをクリックし、FSC SSCプロット内のビーズ集団をゲートします。ゲートをダブルクリックして、ゲートされたビーズのドータープロットを作成します。その後、陽性ビーズと陰性ビーズを個別にゲートします。

連続的なゲーティングおよび各陽性・陰性分画におけるアウトライヤーの除去により、選択した娘細胞集団を検証します。次に、アンミキシングウィンドウに陰性および陽性のゲートをアップロードします。続いて、チューブリストから未染色の細胞サンプルを選択し、自家蛍光細胞と非自家蛍光細胞のための個別のゲートを設定します。

オートフルオレッセンスおよび生存率を含むすべてのパラメータについて、ネガティブゲートとポジティブゲートを定義した後、「calculate」をクリックします。次に、解析したサンプルにアンミキシングを適用します。データを解析するには、SSC対FSCのプロットで細胞をゲートし、プロピジウムヨウ化物で染色された死細胞を除外します。

最後に、目的とするすべての細胞集団のゲートを設定します。ここでは、胎児心臓から単離し、anti-TER119、anti-CD45、およびanti-Sca-1抗体で染色した細胞のフローサイトメトリーおよびスペクトルサイトメトリー解析の結果を示します。2台の従来型サイトメーターでは自家蛍光細胞のサブセットが検出されましたが、スペクトルサイトメトリーではこれらの細胞は自家蛍光として定義されず、CD45 TER119陰性集団に含まれていました。

従来のフローサイトメトリーで自家蛍光性であると識別され、かつCD31陽性ではない細胞について、心筋細胞に特異的な転写物の発現を解析しました。自家蛍光細胞集団において、心筋トロポニンおよび心房心筋様転写物の高レベルな発現が認められ、従来のフローサイトメトリーでは心筋細胞の大部分が見落とされていることが確認されました。この手法に習熟し、適切に実施すれば、約8時間で完了させることができます。

この手順を行う際は、細胞の生存能を維持するため、すべてのステップを氷上で行い、迅速に完了させることが重要です。本手順に続き、細胞内タンパク質の解析や追加の表面マーカーの分析を行うことで、特定の分子経路に関する疑問を明らかにすることができます。この手法は、免疫学や発生生物学、幹細胞生物学の分野の研究者が、さまざまな臓器から希少な細胞集団を探索し、単離することを可能にしました。

このビデオを視聴することで、細胞組織から細胞を単離および染色する方法と、細胞の自家蛍光による制限を克服するスペクトラルフローサイトメトリーを用いて表面マーカーの発現を解析する方法について、十分に理解できるはずです。プロピジウムヨードイ化物を用いた作業は極めて危険であるため、本手順を実施する際は、常にPPE（個人用保護具）の使用などの予防措置を講じることを忘れないでください。