Echinococcus granulosusからの小さな細胞外小胞の単離と樹状細胞の取り込み

私たちの研究は、Echinococcus granulosus 細胞外小胞の特徴付けと、寄生虫と宿主の相互作用におけるそれらの役割に焦点を当てています。宿主樹状細胞による組成の取り込みと免疫調節への潜在的な影響を調査します。E. granulosus EVは樹状細胞に取り込まれ、成熟と抗原提示に影響を与えることを実証しました。また、寄生虫と宿主の相互作用や免疫応答に影響を与える可能性のあるEVカーゴ中の主要な免疫調節タンパク質と抗原タンパク質も同定しています。

当社のプロトコルは、in vitro寄生虫培養を最適化して小さなEV生産を強化し、高品質の単離を保証し、免疫調節を研究するための樹状細胞アッセイを統合します。全体として、または部分的に適用できます。私たちの将来の研究では、免疫応答に対する E. granulosus EV の in vivo 効果、ワクチン成分としての可能性、樹状細胞、マイクロファージ、およびこれらの細胞の免疫モデルへの影響を調査します。

[ナレーター]まず、70%アルコールを使用して包虫病で安楽死させたマウスの腹側表面を洗浄します。腹腔を外科的に開き、はさみと鉗子を使用して発達した後回虫を除去します。次に、鉗子を使用してメタセストード塊を滅菌シャーレに移します。必要に応じて鉗子を使用して結合組織を取り除き、後セストード塊から嚢胞を解放します。得られたメタセストデスを摂氏4度で補充されたPBSで洗浄します。次に、必要なすべての成分を使用して培地を調製し、溶液を反転して穏やかに混合します。調製した培地5ミリリットルを各レイトンチューブに移します。寄生虫を培地に加え、培地を変更せずにチューブを摂氏37度で5日間インキュベートします。各レイトンチューブから寄生虫培養培地を収集し、15ミリリットルの円錐形チューブに移します。収集した培地を摂氏4度で300gで10分間遠心分離し、上清を新しい15ミリリットルの円錐形チューブに移します。次に、上清を2,000gで摂氏4度で10分間遠心分離します。得られた上清をピペットを使用して新しい1.5ミリリットルチューブに移します。チューブを10,000gで摂氏4度で30分間遠心分離し、小さな細胞破片を除去します。ピペットを使用して、上清を超遠心分離機ローターに適したチューブに移します。チューブの片側にマーカーで印を付けます。そして、マークされた面を上に向けてチューブをローターに入れます。チューブを摂氏4度で1時間、100,000gで遠心分離します。上清を素早く注ぎ、チューブを逆さまにして1分間置きます。ペレットを少なくとも3ミリリットルのPBSで洗浄し、汚染タンパク質を除去します。ピペットを使用して、ペレットが予想されるマークされた側に焦点を当てて、すべてのチューブ面に沿ってペレットを複数回再懸濁します。超遠心分離を繰り返した後、ペレットを30マイクロリットルのPBSに再懸濁します。再懸濁したサンプルを1.5ミリリットルのチューブに移し、細胞外小胞を摂氏マイナス80度で凍結して保管します。安楽死させた5〜8週間齢の雌CF-1マウスにエタノールをスプレーしてから、組織培養フードに入れます。仰臥位で解剖ボードにマウスを置きます。鉗子と解剖はさみを使用して、尿道の上に垂直のT切開を行い、下肢の上部まで水平に伸ばします。鉗子を使用して、両後肢に沿って皮膚を分離し、脚の骨と組織を露出させます。手で、足首から腹部に向かって押した後、両脚の皮膚を取り除き、皮膚を反対側に引っ張り、両脚を皮膚から解放します。次に、はさみと鉗子を使用して大腿骨と脛骨を慎重に取り除き、破損しないようにします。各骨の先端を鉗子で固定します。そして腱を切断して、骨の周りの筋膜を取り除きます。紙ナプキンで筋肉組織を完全に洗浄します。除去された各骨を、2ミリリットルの補充された完全RPMI培地を含む滅菌50ミリリットルのチューブに入れて、破片を除去します。培地を廃棄した後、骨を70%エタノールで5分間2回洗浄します。洗浄した骨を滅菌ペトリ皿に移し、鋭利な解剖ハサミを使用して2つの骨骨端を切り取り、骨髄細胞にアクセスします。完全培地を含む20ミリリットルの注射器に取り付けられた25ゲージの針を使用して、4つの骨のそれぞれから骨髄細胞を滅菌ペトリ皿に注意深く洗い流します。次に、ピペッティングにより、骨結合組織と細胞の塊を除去するために、回避された骨髄を含む培地を穏やかに均質化します。サンプルを滅菌された50ミリリットルの円錐形チューブに移し、細胞を滅菌された70マイクロメートルのポリプロピレン細胞ストレーナーに通して結合組織と骨片を除去します。細胞を450gで摂氏4度で7分間遠心分離します。 ペレットがチューブ壁に付着したままになるように、慎重に上清を除去して廃棄します。細胞を室温で1分間インキュベートした後、500マイクロリットルのRBC溶解バッファーに再懸濁し、3ミリリットルの完全培地で溶解バッファーを中和します。細胞を450gで摂氏4度で7分間遠心分離します。上清を廃棄し、ペレットを5ミリリットルの完全培地に再懸濁します。示されているようにサンプルをろ過した後、血球計算盤を使用して細胞をカウントします。組換えマウスFMS関連チロシンキナーゼ3リガンド(FLT3L)を1ミリリットルあたり300ナノグラムを培地に加えます。10×10の濃度で細胞を1ミリリットルあたり6つの細胞の累乗でマルチウェルプレートにプレーニングします。細胞を摂氏37度で、二酸化炭素5%の加湿雰囲気で7日間インキュベートします。3日目に、細胞を乱すことなく各ウェルから1ミリリットルの培地を取り出し、1ミリリットルの予熱した新鮮な完全培地に置き換え、組換えマウスFLT3Lの1ミリリットルあたり150ナノグラムを添加します。Echinococcus granulosus幼虫期から精製された細胞外小胞(EV)は、主に50〜200ナノメートルの範囲のサイズの小さなEVであり、動的光散乱と透過型電子顕微鏡によって確認されました。骨髄由来の樹状細胞は、7日間にわたって形態学的分化を示し、小さくて丸い造血細胞から細胞質が伸びた星状細胞に進行しました。1時間のインキュベーション後、樹状細胞は蛍光標識された小さなEVを捕捉し、共焦点顕微鏡で確認されたように、エンドソーム-リソソームコンパートメント内のMHCIII分子と共局在しました。