細菌からの外膜由来細胞外小胞の単離と濃縮

遺伝子組み換え細菌のコロニーを液体培地に接種することから始めます。

これらの細菌は、外膜である外部保護層に蛍光融合タンパク質を発現します。

細菌が細胞間コミュニケーションに関与する膜結合ナノ構造である細胞外小胞(EV)を放出するためにインキュベートし、蛍光タンパク質を組み込みます。

培養物をボトルに移し、低速で遠心分離して細胞をペレット化します。

EV、細胞タンパク質、細胞破片を含む上清を移します。高速で遠心分離し、破片を含む上清を除去します。

上清を膜を通してろ過し、残っている細菌や破片を除去します。

寒天にサンプルを接種し、インキュベートします。細菌のコロニー形成がないことは、細菌が存在しないことを確認します。

溶液を半透膜と遠心分離機を備えた限外ろ過装置に移し、より小さなタンパク質を除去しながらEVを捕捉します。

濃縮されたEVをチューブに集めて下流分析を行います。

まず、滅菌ループを使用して、大 腸菌 の単一コロニーを250〜1000ミリリットルのルリアベルタニまたはLBブロスに接種します。次に、培養物を振とうインキュベーターで毎分300回転、摂氏37度で好気的にインキュベートします。48時間のインキュベーション後、細胞培養物を洗浄した500ミリリットルのポリプロピレン遠心分離機ボトルに移し、大容量の固定角ローターで摂氏4度、5,000倍Gで15分間遠心分離することにより、細菌培養培地を清澄化します。

上清を清潔な遠心分離機ボトルに移し、10,000 倍 G で 15 分間遠心分離機に注ぎます。次に、上清を適切なサイズの0.2ミクロンのポリエーテルスルホン真空駆動フィルター装置に移し、ろ過装置を真空壁供給装置に接続します。ろ過率が大幅に低下した場合は、ろ過されていない材料を新しい装置に移動します。

ろ過された培地は、摂氏4度で一晩保存することも、すぐにさらに処理することもできます。生細胞の完全な除去を確認するには、ろ過した上清のアリコートを適切な寒天プレートに広げ、細菌株に最適な条件でインキュベートした後、コロニーがないことを確認します。ろ過培地を100ミリリットルの容量で濃縮するには、90ミリリットルのろ過培地を100キロダルトンの分子量カットオフで遠心限外ろ過装置のリザーバーにロードし、上部リザーバー内の培地の体積が0.5ミリリットル未満に濃縮されるまで、摂氏4度および2,000倍Gのスイングバケットローターで培地を15〜30分間隔で遠心分離します。

残りのろ過培地をリザーバーに補充するには、デバイスの底部にあるフロースルーを取り外してバランスを取り戻します。リザーバー内の濃縮培地の粘度が目に見えて増加した場合は、培地をPBSで希釈し、遠心分離によって再濃縮して、分子量カットオフの100キロダルトンよりも小さい非細胞外小胞またはEVタンパク質を減らします。次に、濃縮培地を低タンパク質結合チューブに移し、摂氏4度で一晩保存します。