ヒト単球由来マクロファージにおけるカスパーゼ活性化の可視化

免疫細胞では、炎症性カスパーゼであるカスパーゼ-1 は、不活性な形で存在する重要な免疫応答性成分です。これらの不活性型は、触媒ドメインと融合したプロドメインで構成され、近接誘起二量体化を介して活性になります。

in vivoでのカスパーゼ活性化を視覚化するには、赤色蛍光タンパク質と一対の蛍光相補レポータータンパク質を発現するトランスフェクトされたヒト単球由来マクロファージの培養から始めます。レポータータンパク質には、Venusタンパク質の非蛍光フラグメント(Venus-NまたはVenus-C)と融合したカスパーゼ-1のプロドメインが含まれています。

リ

ポ多糖類(細菌由来の炎症刺激剤)とカリウムイオノフォア(ニゲリシン)を含むイメージング培地で細胞を処理します。

リポ多糖類はマクロファージ上のパターン認識受容体と相互作用し、インフラマソーム複合体の集合を開始する

ニゲリシン分子は細胞内に入り、カリウムイオンに結合し、細胞外培地への流出を引き起こし、細胞内カリウムイオン濃度を低下させます。これにより、インフラマソームセンサータンパク質がアダプタータンパク質(センサータンパク質とプロカスパーゼ-1の間の架橋タンパク質)でプライミングされ、複合体が形成されます。

ヴィーナスフラグメントを含むプロドメインは、複合体のアダプタータンパク質と相互作用します。これにより、2つのフラグメントが近接し、強制的に再折り畳みして蛍光を発します。

落射蛍光顕微鏡で細胞を視覚化します。

トランスフェクトされた細胞は赤色に現れ、緑色の蛍光スポットがあり、カスパーゼの活性化を確認します。

トランスフェクションごとに1.5ミリリットルの滅菌マイクロチューブを取り、適切なレポータープラスミドとカスパーゼ-BiFCプラスミドをフードに入れます。ピペットステーション、デバイス、チップ、エレクトロポレーションチューブ、およびピペットを滅菌層流フードに入れます。核フェクション装置を接続して電源を入れます。

表示された起動画面でトランスフェクションパラメータを入力します。[電圧] を押し、1,000 と入力し、[完了] を押して 1000 ボルトに設定します。[幅] を押し、40 と入力し、[完了] を押してパルスを 40 ミリ秒に設定します。最後に、#パルスを押して2つを入力し、完了を押して電気パルスの数を2に設定します。

エレクトロポレーションチューブの1つを取り、室温で3ミリリットルの電解バッファーEで満たします。エレクトロポレーションチューブをピペットステーションのピペットホルダーに挿入し、チューブの側面の電極が内側を向いており、チューブを挿入するとカチッという音が聞こえるようにします。

細胞ペレットを取り、10〜2回10番目の細胞に10マイクロリットルの予熱した再懸濁Rバッファーを5番目の細胞