ヒトCD14⁺ 単球から寛容性樹状細胞を作製するための免疫調節剤を試験するための簡便で効率的な方法

私たちは、すでに分化した単球由来の樹状細胞から忍容性樹状細胞を生成できる免疫調節治療を理解しようとしており、これは自己免疫および移植研究にとって非常に価値があります。製造の進歩により自己療法はより実用的になりつつあり、寛容原性樹状細胞は前臨床研究で有望であることが示されています。それらは抗原特異的耐性を生成することができます。最も一般的なのはサイトメトリーです。これにより、寛容化された細胞を分析するための迅速かつアクセスしやすい方法が提供されます。in vivoで両方の機能を持続する寛容原性樹状細胞を生成することは困難です。これが、忍容性に対する臨床的に承認された樹状細胞療法がない理由です。大規模なスクリーニング研究から、耐性樹状細胞機能の改善を示す免疫調節化合物の新しい組み合わせを特定しました。また、ナノ粒子製剤の公差も設計しています。

[講師]まず、濃縮ヒト単球とT細胞を含む15ミリリットルのチューブを遠心分離機に入れます。遠心分離が完了したら、ピペットを使用してチューブから上清を吸引します。1ミリリットルのMODC培地を単球ペレットに加え、1ミリリットルのT細胞培養培地をT細胞の入ったチューブに加え、細胞計数前によく混合します。次に、9ミリリットルの温かいMODC培地を単球懸濁液に加え、最終容量を10ミリリットルにします。次に、GM-CSFとIL-4のストック溶液をそれぞれ100マイクロリットルずつピペットで取り入れます。懸濁液をMODCとマークされたラベル付きペトリ皿に移し、インキュベートします。次に、1ミリリットルのT細胞凍結培地をT細胞懸濁液に加えます。混合物を2つの2ミリリットルのクライオバイアルに分けます。密封されたクライオバイアルを、未使用のウェル内のバランスチューブを備えた凍結チャンバーに入れます。4日目に、5ミリリットルの新鮮なMODC培地を単球チューブに加えます。次に、GM-CSFとIL-4ストック溶液7をそれぞれ100マイクロリットルずつピペットで取り、7日目までインキュベートします。7日目に、分化した単球由来樹状細胞(MDOC)を50ミリリットルのチューブに移し、以前と同様に遠心分離します。1ミリリットルの温かいMODC培地を細胞ペレットに加え、ピペットで上下に調和してよく混合します。血球計算盤を使用して細胞をカウントします。目的の細胞濃度が得られるまで、GM-CSFおよびIL4を含む温かいMODC培地で懸濁液を希釈します。30,000個の細胞を含む懸濁液100マイクロリットルを、平底の96ウェル組織培養プレートの各ウェルに分注します。1マイクロリットルの免疫調節薬を指定されたウェルに加え、インキュベートします。翌日、MODCプレートを300 Gで5分間遠心分離します。上清をそっと除去した後、200マイクロリットルの温かいHBSSをプレートの側面にそっと加え、遠心分離します。再び、上清吸引後にGM-CSFおよびIL4を含む100マイクロリットルの温かいMODC培地を加えます。免疫刺激を使用する場合は、1マイクロリットルの100Xリポ多糖類ストックを指定されたウェルに加え、インキュベートします。8日目に、2つのクライオバイアルを摂氏37度のホットビーズバスで内容物が溶け始めるまで解凍します。部分的に解凍したら、バイアルを細胞培養フードに移します。次に、1ミリリットルの温かいT細胞培養培地を加えて、細胞を急速に解凍します。内容物を50ミリリットルのチューブに移し、クライオバイアルをさらに1ミリリットルのT細胞培養培地ですすぎ、すべての細胞を収集します。懸濁液に15ミリリットルのフロー染色液を補充し、遠心分離します。ペレットを5ミリリットルのフロー染色液に再懸濁し、再度遠心分離し、上清をピペッティングした後、細胞ペレットを1ミリリットルの温かいT細胞培養培地に再懸濁します。9ミリリットルの温かいT細胞培地を加えて、最終容量を10ミリリットルにします。懸濁液を再解凍したT細胞として標識されたペトリ皿に移し、インキュベートします。8日目に、MODCプレートを300 Gで5分間遠心分離します。上清をピペッティングした後、各ウェルに200マイクロリットルのフロー染色溶液を加え、インキュベートします。次に、ピペットを上下にピペットで移動して、付着した細胞と細胞懸濁液を新しい96ウェルVボトムプレートに除去してから、再度遠心分離します。上清を吸引した後、50マイクロリットルのFC受容体結合阻害剤抗体を各ウェルにピペットで入れて、非特異的結合をブロックします。プレートを室温で30分間インキュベートした後、調製したバリデーションパネル抗体カクテル50マイクロリットルを各ウェルに加えます。50マイクロリットルの補償ビーズと50マイクロリットルの希釈抗体を1.5ミリリットルのチューブに混合し、インキュベートします。プレートを300 Gで5分間遠心分離します。ペレットを200マイクロリットルのフロー染色液に再懸濁して細胞を洗浄します。最終洗浄および遠心分離後、フローサイトメトリー分析のために細胞を110マイクロリットルのフロー染色溶液に再懸濁します。 寛容性MODCの場合は、抗体カクテルを耐性パネルカクテルに置き換えます。9日目に、再解凍したT細胞ペトリ皿を50ミリリットルのチューブに移し、チューブにフロー染色液を補充します。未染色のT細胞を含む2番目のチューブを三角分析に使用します。チューブを250 Gで5分間回転させます。上清を除去した後、細胞を温かい細胞培養培地に再懸濁します。T細胞をカウントし、最低400万個の細胞が得られることを確認します。MODCプレートを300 Gで5分間遠心分離します。上清を吸引した後、各ウェルに200マイクロリットルのT細胞を加えます。トライグ分析プレート用の未染色T細胞を追加します。1ミリリットルあたり25マイクロリットルの抗CD3/CD28抗体カクテルをネガティブコントロールウェルを除くすべてのグループに加えて、T細胞を刺激し、12日目までインキュベートします。次に、すべての細胞懸濁液を96ウェル培養プレートからフロー染色液を含むVボトムプレートに移します。細胞を200マイクロリットルのフロー染色液で2回洗浄します。補正コントロール用にいくつかのセルを確保します。2回目の洗浄後、プレートを遠心分離します。次に、50マイクロリットルの希釈FC受容体結合阻害剤抗体を各ウェルに加え、インキュベートします。インキュベーションが完了したら、調製したトリグパネル抗体カクテル50マイクロリットルを各ウェルに加えます。代償対照の場合は、50マイクロリットルの未染色代償細胞と50マイクロリットルの各染色抗体を混合します。プレートと補償コントロールを摂氏4度で1時間インキュベートし、遠心分離する前にフロー染色液で洗浄します。次に、コールドインキュベーションの前に、HBSSで200マイクロリットル/ウェルで希釈したLive/Dead近赤外色素で細胞を染色します。プレートを洗浄して遠心分離してから、Fox P3とフローサイトメトリー分析で染色します。1日目には、未分化単球は主にHLA-DRマイナスで、CD14マイナスが小さく、7日目の分化単球は、ほとんどの細胞がHLA-DRプラスCD14マイナス、CD1cプラス、CD141プラスとして示されました。リポ多糖類の有無にかかわらず、ラパマイシンによる治療は、DC-SIGNとCD1cプラスの集団を大幅に減少させ、LPS治療単独で観察されたCD86およびCD40マーカーのアップレギュレーションを阻害しました。FOX P3とT調節細胞集団は、MDCをT細胞と共培養すると増加しました。しかし、4つのMODC治療群間で有意差は観察されませんでした。T細胞増殖は、Rapa処理MDOCと共培養した後、CD4プラスおよびCD8プラスの両方のT細胞集団で減少しました。インターロイキン-10を処理したサンプルは、24時間でインターロイキン-10の産生を有意に増加させました。デックス処理されたMDOCは、インターロイキン-10の産生を有意に増加させましたが、それは72時間休んだ後でした。デキサメタゾンの前処理により、24 時間での LPS 治療時の平均 TNF アルファ生成が減少しました。PDL1 と MDOC の有意な増加は、Dex と LPS および Rapa 治療群で 72 時間で観察されました。CD86発現の抑制は、24時間と72時間の両方で、すべての免疫調節剤治療群から観察されました。免疫調節剤で処理されたMDOCは、CD4とT細胞の増殖を増加させませんでした。