Name: 開発とマウス免疫寛容樹状細胞の機能解析 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-18T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 51 s
Description: 学ぶマウス免疫寛容樹状細胞の開発と機能解析の標準化手法。C57BL/6マウス骨髄由来細胞を用いてTolDCを誘導し、自己免疫疾患治療への細胞免疫療法応用可能性を評価する実験プロトコルです。

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我々 はリアータ医薬品が CDDO DFPA を提供することをありがちましょう。また、ジェーンと小児がんの革新 (ジョン Letterio) 李 Seidman 椅子のサポートを認めます。この作品は、米国防総省 [W81XWH-12-1-0452]; によって支えられました。ケース包括的がんセンターでアンジーの野鳥捕獲者の青年や若い成人期のがん研究イニシアチブHsi じゅ魏/キャラハン財団からキャラハン研究科学者賞を受賞。

ケース ウェスタン リザーブ大学医学部の制度的動物ケアおよび使用委員会によって承認された手続きに準拠してすべての研究を行った。
1. 骨髄由来樹状細胞 (黒谷)
<ol><li>オートクレーブを介してすべての手術器具を滅菌し、クラス II 生物学的安全キャビネット充当安全手順で実験を実行します。</li>
	<li>8-10 週齢の c57bl/6 マウスを安楽死させる CO2箱を用いた。解離性の基板上にマウスを置くし、70% エタノールでリンスします。外科はさみを用いて脛骨腓骨、大腿骨の骨を切除し、10 cm 培養皿の中の 70% のエタノールで配置します。</li>
	<li>ティッシュを解剖する外科ブレードと鉗子を使用して 10 cm の蓋の上可能な限り、料理の文化し、脛骨と大腿骨 6 cm 培養皿の中の 70% のエタノールのそれらを置くに分離します。</li>
	<li>脛骨と大腿骨の両方の端をトリミングするのにには、外科ブレードを使用します。12 ml の PBS を含む円錐管に骨の一方の端から骨髄の内容をフラッシュするのに 23 G 針付き 3 ml シリンジ 3 mL PBS を使用します。骨の両端の 3 倍この手順を繰り返します。</li>
	<li>5 分間 300 x g で細胞懸濁液を遠心します。</li>
	<li>上澄みを除去し、赤の血液細胞を削除する 5 分の 1 ml ACK 溶解バッファーで細胞ペレットを再懸濁します。</li>
	<li>9 ml PBS ACK 溶解バッファーと 300 x g で 5 分間遠心を希釈するを追加します。</li>
	<li>上澄みを除去し、10 ml の培地 (RPMI 1640 プラス L-グルタミン、10 %fbs、1% 非必須アミノ酸 (100 x)、10 mM HEPES、50 nM β-メルカプトエタノール、および 5% ペニシリン/ストレプトマイシン) で再懸濁します。 注: エンドトキシン濃度は、FBS で 0.1 未満 EU/ml をなければなりません。</li>
	<li>細胞懸濁液を 40 μ m の細胞ストレーナを通過しの細胞懸濁液 20 μ l を取るし、トリパン ブルーの cytometer による生きているセルの数をカウントするの 80 μ l で混ぜます。</li>
	<li>1 x 10 の6セル/15 ng/ml GM-CSF と 10 ng/ml IL 4 ml に細胞数を調整します。</li>
	<li>1 x 106セル/6 ウェル プレートの各ウェルに ml の 3 ml をプレートし、37 ° C、5% CO2、および CO2インキュベーターの湿度 95% でセルを孵化させなさい。 注: 1 つのマウスの骨髄細胞は周辺 3 6 ウェル プレート 2 から配置することができることを示す 10 の7セル × 3-5。</li>
	<li>3 日目、各ウェルに 2 ml の新鮮な PBS を追加各ウェルからすべて 3 ml の培養液を削除し、すべての非付着性のセルを削除することを確認するプレートを軽く渦巻き模様します。</li>
	<li>15 ng/ml GM-CSF と 10 ng/ml 各ウェルに IL 4 3 ml の新鮮な培養液を交換してください。37 ° C、5% CO2、および CO2インキュベーターの湿度 95% でセルを孵化させなさい。</li>
	<li>5 日各ウェルで 15 ng/ml GM-CSF と 10 ng/ml IL 4 別 3 ml の新鮮な培養液を直接追加します。37 ° C、5% CO2、および CO2インキュベーターの湿度 95% でセルを孵化させなさい。 注: 各ウェルの容量は 6 ml では今です。</li>
	<li>7 日には、10 分間氷の上プレート全体を置きます。優しく各 Idc として懸濁液に、緩く付着黒谷を取り除くために培養液をピペットします。 注: 付着性マクロファージはまだプレートに接続されています。低温と優しく手順は、さらに実験に影響を与える DC の活性化を避けるためにキーです。</li>
	<li>5 分の 300 x g で細胞懸濁液を遠心し、さらに実験のための新鮮な培養液で再懸濁します。 注: 黒谷は、フローサイトメトリーによる CD11c 抗体の蛍光標識で識別できる、図 1でのさらなる実験の黒谷のゲーティング方針を示した。</li>
</ol>2. TolDC 遺伝子とタンパク質のプロファイルを特徴します。
<ol><li>37 ° C、5% CO2および CO2インキュベーターの湿度 95% で 1 時間インキュベート培と 100-400 nM の CDDO DFPA の有無で 1 × 106黒谷/ml 6 ウェル プレートのウェルあたり 2 ml をプレートします。 注: CDDO-DFPA、合成部核因子 (赤血球由来 2) - のようだ - 2 の要因 (Nrf2) 誘導と核因子 κ B (NF-κ B) の阻害剤Idc、IL-10、ビタミン D3、デキサメタゾン湾 11-7085 などから TolDCs の誘導のために他のエージェントを適用し、この手順を各エージェントのための最適な条件を変更します。</li>
	<li>Mdc (インキュベーション時間は mRNA やタンパク質の測定により異なります) を誘発する 4 24 時間インキュベート LPS の 10 または 100 ng/ml を追加します。</li>
	<li>軽く各ウェルに培養液をピペット、1 ml ピペットを用いて細胞懸濁液を収穫します。それぞれ細胞や培養上清を収集するために 5 分の 300 × g で遠心分離機します。</li>
	<li>刺激リガンドなどのフローサイトメトリーによる細胞ペレットから表面配位子を分析: CD40、CD80、CD86、MHC-II、OX40L、ICOSL、または抑制配位子: PD L1、L2 PD、ILT3、ILT4。</li>
	<li>細胞ペレットからの RNA を隔離し、RNA および量的なリアルタイム PCR (qRT PCR)、ELISA、サイトカイン プロフィール、遺伝子やタンパク質の培養上清中のサンプルをそれぞれ分析します。 注: たとえば、炎症性サイトカイン: TNF-α、肝腎、edn 誌 1、IL-6、イリノイ-12 と IL-23、または抗炎症サイトカイン: IL 4, IL-10 IL 15、TGF-β 1 と HO-1。</li>
</ol>3 TolDCs の機能を評価するIn VitroとIn Vivo
<ol><li>
T 細胞の同系の拡散の試金
	<ol>
<li>オートクレーブを介してすべての手術器具を滅菌し、クラス II 生物学的安全キャビネット充当安全手順で実験を実行します。</li>
		<li>0.5% ウシ血清アルブミン (BSA) と 500 ml の PBS に 2 ミリメートルの EDTA を使用して MAC バッファーを準備します。0.2 μ m フィルターを介してフィルタ リング バッファーを滅菌します。 注: は、次の実験中に氷の上バッファーを保持します。</li>
		<li>CD4 を取得する+ T 細胞、安楽死 OT II T 細胞受容体 (TCR) 遺伝子組換えマウス 8-10 週齢 CO2箱を用いた。解離性の基板上にマウスを置くし、70% エタノールでリンスします。外科はさみとピンセットを使用して腹部の左側から脾臓を分離します。</li>
		<li>6 cm 培養皿に 2 ml の PBS で脾臓を入れ、40 μ m の細胞ストレーナーを渡すことによって脾臓をミンチに 3 ml シリンジの押し棒の後ろに使用します。</li>
		<li>細胞懸濁液と 300 x g で 5 分間遠心を収集します。</li>
		<li>MAC バッファーの 400 μ l 細胞ペレットを再懸濁します。</li>
		<li>CD4 の 100 μ l を追加+ T 細胞ビオチン抗体カクテル 4 ° C、5 分で。 注: 抗体カクテル バインド CD4 を除く他のセルタイプに+ T 細胞、CD8a、CD11b、CD11c、CD19、CD25、CD45R など (B220)、CD49b (DX5) CD105、反 MHC クラス II、テル-119、および TCRγ/δ。</li>
		<li>10 分のための 4 ° C での MAC バッファー 300 μ l、200 μ l 抗ビオチン ビーズ (材料表) を追加します。</li>
		<li>強磁性球 (材料表) の列で構成される場所と磁気で一緒に事前色分解フィルター フィールド、MAC バッファーの 3 ml でそれをすすいでください。</li>
		<li>9 ml の MAC バッファーを加えて、細胞と 300 × g で 5 分間遠心します。</li>
		<li>3 ml の MAC バッファーで細胞ペレットを再懸濁します、列に適用されます。収集の流れを含む CD4+ T 細胞。</li>
		<li>MAC バッファーの 3 ml の別列を洗っても流れを収集します。</li>
		<li>脾のパンの Dc を得るためには、CO2箱を用いた 8-10 週齢 c57bl/6 マウスを安楽死します。解離性の基板上にマウスを置くし、70% エタノールでリンスします。外科はさみとピンセットを使用して腹部の左側から脾臓を分離します。D コラゲナーゼ溶液 2 ml を含む 6 cm 培養皿で脾臓を置く (2 mg/ml コラゲナーゼ D はカルシウム、マグネシウムを含む HBSS で解散)。</li>
		<li>1 ml シリンジ、25 G 針 2 回脾臓にコラゲナーゼ D 溶液 1 ml を注入します。小さなハサミで小さな断片に脾臓をカットします。</li>
		<li>振るし、25 分間室温でインキュベートします。</li>
		<li>5 分間室温で 0.5 M の EDTA の 500 μ l を追加します。 注: 3.1.13-3.1.14 からのステップは、DCs の収率を増加させるための重要なです。</li>
		<li>今 40 μ m の細胞ストレーナーを渡すことによって脾臓スラリーをミンチし、5 分の 300 × g で遠心分離して細胞懸濁液を収集する 3 ml シリンジの押し棒の裏を使用します。</li>
		<li>350 μ l MAC バッファー、FcR ブロッキング試薬 50 μ l、100 μ l パン樹状細胞ビオチン抗体カクテルの 10 分のための 4 ° C でので細胞ペレットを再懸濁します。 注: カクテルの Dc によって表されない抗原に対する抗体。</li>
		<li>5 分間 300 x g で MAC バッファーおよび遠心分離機の 9 ml を追加してセルを洗浄します。</li>
		<li>MAC バッファーの 800 μ l 細胞ペレットを再懸濁します、10 分のための 4 ° C で反ビオチン ビードの 200 μ l を追加します。</li>
		<li>Dc を収集する 3.1.9-3.1.11 からの手順を繰り返します。</li>
		<li>別 3 ml の MAC バッファーの列 2 回洗っても流れを収集します。</li>
		<li>15 分の 37 ° C で 1 μ M CFSE と 100-400 nM CDDO DFPA 37 ° C で 1 時間別々、ラベル CD4+ T 細胞 (1 x 107/ml) の有無で 2 x 105 Dc/ml を扱う、PBS で洗浄、2 x 106 T 細胞/ml で最終濃度を取得するボリュームを再調整するとします。</li>
		<li>次に、96 ウェル プレートで共培養 CD4 の CFSE ラベルの同じボリュームの処理樹状細胞の 100 μ l+ T 細胞、1:10 を取得する上記の手順から収集した両方の比率。今孵化の 2 〜 3 日後 100 ng/mL 卵白アルブミン (OVA) ペプチド 323-329 あたりとフローサイトメトリーによる T 細胞の CFSE 強度測定を追加します。 注: セル番号と比による Dc の T 細胞に私たちの以前の仕事37から最適化されています。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
パッシブを誘発する黒谷を注入することにより EAE パルス ミエリン オリゴデンドロ サイト糖タンパク質 (モグ) (35-55)
	<ol>
<li>板 1 × 106黒谷/ml 6 ウェル プレートのウェルあたり 2 ml 培養液 100-400 nM の CDDO DFPA の有無で 1 時間インキュベート。</li>
		<li>追加 10 ng/ml LPS のインキュベーターの 24 時間。</li>
		<li>100 μ g/ml 追加 MOG (35-55) のインキュベーターの 4 時間。</li>
		<li>細胞懸濁液を収穫、300 x g で 5 分間遠心します。</li>
		<li>PBS の細胞ペレットを再懸濁し、セルをカウントします。</li>
		<li>8-10 週古い女性 c57bl/6 マウス (各後ろ足に 100 μ l) に 2 x 10 の6セルの 200 μ l を皮下注入します。</li>
		<li>腎不全注入と 48 日に時間。200 を注入後、百日咳毒素 (PTX) それぞれのマウスの ng。</li>
		<li>4 週連続で毎週 1 回の手順 3.2.6-3.2.7 を繰り返します。</li>
		<li>標準的な基準37 (0.5 ぐったり最後尾、1 ぐったり尾、2 適当な後肢虚弱、3 重度後肢虚弱、4-完全な後肢麻痺、5 四肢または瀕死状態、6 死) を使用して毎日 EAE の臨床症状を評価します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>

Idc を生成し、その後 TolDCs にそれらを区別するために再現性をもって使用できる効率的なプロトコルについて述べるし、この可能性があります、TolDC を誘導する新規分子標的薬の能力の評価に適用することを提案します。表現型。このレポートに記載されている、我々 は、我々 まず表面配位子の TolDC 式フローサイトメトリーで分析した、qRT PCR および elisa 法で測定された DC サイトカイン プロフィールの評価が続くシーケンスを追った。最後に、TolDCs の免疫調節機能は T 細胞増殖体外と体内は、MS の臨床マウス EAE モデルを用いた自己免疫を抑制する効力を削減するための能力を示すことによって確認されました。
プロトコル、Idc が生成され、GM-CSF と il-4 によると組み合わせてマウス骨髄前駆体から区別されます。他のプロトコルは、培養液中で Idc44を生成するのにフォームのようなチロシン キナーゼ 3 配位子 (Flt3L) を使用しています。Flt3L の使用には、Idc の収量...

樹状細胞 (Dc) 生来の免疫システムの不可欠な部分し最初発見され1主プロフェッショナルな抗原提示細胞として、1973 年にラルフ ・ スタインマンと Zanvil コーンによって特徴付けられます。Dc リンク自然免疫と適応免疫システム2に二次リンパ器官の T 細胞と B 細胞で主要組織適合遺伝子複合体 (MHC) に処理された抗原提示することで免疫活性化に重要な役割を果たすことが示されています。哺乳類の免疫系に骨髄の Dc、Dc (Pdc)3形質としてされている Dc の少なくとも 2 つのカテゴリがあります。従来の Dc (cDCs) CD11c 表現によって特徴付けられる未熟な Dc (Idc)体外骨髄前駆細胞や末梢血単球を用いたからと区別することができますと呼ばれ、また、骨髄性の Dc顆粒球マクロファージ ・ コロニー刺激因子 (GM-CSF) と IL-4 マウスや人間種、それぞれ4で。
『 危険 』 を活性化信号を病原体関連分子パターン (種緑化) または損傷関連分子パターン (湿気がある)、様々 なパターン認識受容体結合を介して成熟した Dc (Mdc) として免疫原性 Dc に向けて Idc 成熟をドライブするなど、DC の表面5。さらに免疫原性 Dc プライム ナイーブ T 細胞の増殖・分化アップレギュレーションを介して MHCII2、共刺激リガンド (CD80、CD86、CD40)6サイトカイン、その他水溶性メディエーター7。免疫原性 DCs からプロ炎症性仲介人の生産のカスケードは、サイトカインを介した T 細胞の分化に不可欠です。たとえば、IFN-γ および il-12 が th1 細胞分化8と IL-1, 必要な IL-6 と IL-23 は重要ナイーブ T 細胞 Th17 細胞9に向かって偏光です。成熟した Dc は、外国の抗原に反応する、自己抗原による自由な DC の活性化が耐アブレーションを原因し、その活性化組織破壊10 につながる自己反応性 T 細胞を生成することによって自己免疫疾患の開発の促進.
最近の報告では、DC の可塑性、その組織微小環境の内で異なるキューとやり取りして異なるエフェクター/サプレッサー DC サブセットに区別するために彼らの能力によって例示の明確な証拠を提供しています。IL-1011TGF-β12HO 113などの抗炎症メディエーターは、Dc (TolDCs) 免疫寛容を誘導することによって免疫抑制に重要な役割を再生する示されています。これらの TolDCs は、規制機能を取得し、14T 細胞増殖を抑制します。また、Dc による共刺激の欠如と TolDCs から抗炎症メディエーターの生産両方は制御性 T 細胞 (Treg) の誘導に貢献、Th1 と th17 細胞分化と拡大15も効果的に抑制します。過去の二十年でに、TolDCs の治療の可能性はいくつかの調査で、報告されています。これらの研究でex vivoの管理自己免疫疾患16の異なる前臨床モデルで TolDCs の改善だけでなく病的症状を生成がまた17 の患者で免疫の許容の開発につながった ,18。興味深いことに、今日 TolDCs 療法として考えられている代替または補助アプローチを含む、いくつかの臨床試験で自己免疫疾患のタイプ 1 糖尿病19、関節リウマチ20, 21、多発性硬化症 (MS)22,23,24Crohn 病25。
各種 TolDCs の開発に採用されているプロトコルがあり、いくつかの研究所は、生成と TolDCs の表現型特性の方法を報告しています。造血前駆細胞からの in vitro TolDCs 再現性をもって生成し、安定して免疫寛容状態体内26,27,28,29でそれらを維持するために、これらのメソッドを使用することができます。Idc は、様々 な免疫調節薬剤や抗炎症性サイトカインへの露出によって TolDCs に変換できます。たとえば、ビタミン D3 は IL-10 生産を増大させる、DCs から IL 12 分泌を抑制し、それにより免疫抑制機能30を後押しする知られているよく知られている薬剤です。また、Dc がリポ多糖 (LPS) などの強力な炎症性刺激にさらされるデキサメタゾン31、ラパマイシン32、コルチコステロイド33などいくつかの薬剤が示されているを誘発する、CD40、CD80、CD86、MHCII34DC 表面発現を減らすことによって TolDC の表現型。IL-10 および TGF-β が DC 耐性35とこれらのサイトカインの両方に複合暴露を誘導するためにほとんど研究抗炎症性サイトカインが Dc36抗原の表現型を誘導するために示されています。
免疫寛容の表現型マーカーではなく、DC は機能特性によって定義される偉大な TolDCs の細胞および機能特性評価のための一貫した方法を開発する必要があります。厳格かつ一貫性のあるプロトコルが一貫性のある評価と免疫寛容 DC 表現型の特性の確立必要があります我々 効果的かつ再現性をもって TolDC の表現型を誘導する新しいエージェントの能力を比較している場合さらに、実験室。ここで提供詳細なプロトコル マウスの造血前駆細胞から Idc を分離してその後 TolDCs、Idc に変換する能力の評価の下で新しいエージェントの有効性を分析するステップ バイ ステップのメソッドを提供する堅牢ですTolDCs の機能および表現型特性の in vitroとin vivoの両方。この説明には、その表面配位子、サイトカインのプロファイル、および体外免疫機能によって TolDCs を特徴づける精巧なメソッドが含まれています。我々 も MS、実験的自己免疫性脳脊髄炎 (EAE) の前臨床モデルでこれらの TolDCs の潜在的な治療上のアプリケーションを探索する方法の例を提供します。この確立されたプロトコルは TolDCs の誘導を促進するために新しいエージェントのキャパシティを評価する調査官を助け、TolDC 治療開発の範囲を拡大するための努力を容易に。

<table><tbody><tr><td>CDDO-DFPA(RTA-408)</td><td>レアタ・ファーマシューティカル</td><td>ズ・イン・ハウスシンセシス</td><td>細胞培養</td></tr><tr><td>マウス GM-CSF</td><td>ペプロテック(株)</td><td>315-03</td><td>BMDC 分化</td></tr><tr><td>マウス IL-4</td><td>ペプロテック</td><td>214-14</td><td>BMDC 分化</td></tr><tr><td>脂肪多糖類 (LPS)</td><td>Sigma Aldrich Inc.</td><td>L2880</td><td>細胞培養</td></tr><tr><td>&β-メルカプトエタノール</td><td>Sigma Aldrich Inc.</td><td>516732</td><td>細胞培養</td></tr><tr><td>百日咳毒素(PTX)</td><td>R&Dシステム</td><td>3097</td><td>EAE誘導</td></tr><tr><td>MOG(35&ndash;55) ペプチド</td><td>21stCentury Biochemicals</td><td>in house synthesis</td><td>EAE induction</td></tr><tr><td>Trypan blue</td><td>Gibco, Life Technologies</td><td>15250-061</td><td>細胞培養</td></tr><tr><td>RPMI-1640 plus L-glutamine</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11875-093</td><td>細胞培養</td></tr><tr><td>非必須アミノ酸 (100X)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11140050</td><td>細胞培養</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15630080</td><td>細胞培養</td></tr><tr><td>ペニシリン/ストレプトマイシン</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15140122</td><td>Cell culture</td></tr><tr><td>40 &#956;m細胞ストレーナー</td><td>Corning</td><td>352340</td><td>細胞単離</td></tr><tr><td>PE標識CD80</td><td>BD Biosciences</td><td>557227</td><td>フローサイトメトリー</td></tr><tr><td>PE標識CD86</td><td>BD Biosciences</td><td>555665</td><td>フローサイトメトリー</td></tr><tr><td>PE標識PD-L1</td><td>BioLegend</td><td>124307</td><td>フローサイトメトリー</td></tr><tr><td>APC標識 MHCII</td><td>Biotec Inc.</td><td>130-112-388</td><td>フローサイトメトリー</td></tr><tr><td>APC標識CD11c</td><td>BD Biosciences</td><td>340544</td><td>フローサイトメトリー</td></tr><tr><td>アイソタイプマッチドPE</td><td>Miltenyi Biotec Inc.</td><td>130-091-835</td><td>フローサイトメトリー</td></tr><tr><td>アイソタイプはAPC</td><td>Miltenyi Biotec Inc.</td><td>130-091-836</td><td>フローサイトメトリー</td></tr><tr><td>CFSE</td><td>BioLegend</td><td>423801</td><td>T細胞増殖アッセイ</td></tr><tr><td>汎樹状細胞単離キット</td><td>Miltenyi Biotec Inc.</td><td>130-100-875</td><td>T細胞増殖アッセイ</td></tr><tr><td>FcRブロッキング試薬</td><td>Miltenyi Biotec Inc.</td><td>130-100-875</td><td>T細胞増殖アッセイ</td></tr><tr><td>Pan Dendritic Cell Biotin-Antibody Cocktail</td><td>Miltenyi Biotec Inc.</td><td>130-100-875</td><td>T細胞増殖アッセイ</td></tr><tr><td>抗ビオチンマイクロビーズ</td><td>Miltenyi Biotec Inc.</td><td>130-100-875</td><td>T細胞増殖アッセイ</td></tr><tr><td>CD4+ T細胞分離キット</td><td>Miltenyi Biotec Inc.</td><td>130-104-454</td><td>T細胞増殖アッセイ</td></tr><tr><td>CD4+ T細胞ビオチン抗体カクテル</td><td>Miltenyi Biotec Inc.</td><td>130-104-454</td><td>T細胞増殖アッセイ</td></tr><tr><td>抗ビオチンマイクロビーズ</td><td>Miltenyi Biotec Inc.</td><td>130-104-454</td><td>T細胞増殖アッセイ</td></tr><tr><td>ACK溶解バッファー</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>A1049201</td><td>BMDC 分化</td></tr><tr><td>1 mlシリンジ</td><td>BD Biosciences</td><td>309626</td><td>T細胞増殖アッセイ</td></tr><tr><td>3 mlシリンジ</td><td>BD Biosciences</td><td>309588</td><td>BMDC 分化</td></tr><tr><td>25G ニードル</td><td>BD Biosciences</td><td>309626</td><td>T細胞増殖アッセイ</td></tr><tr><td>23Gニードル</td><td>BDバイオサイエンス</td><td>309588</td><td>BMDC 分化</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma Aldrich Inc.</td><td>A2058</td><td>T細胞増殖アッセイ</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>15575020</td><td>T細胞増殖アッセイ</td></tr><tr><td>LSカラム</td><td>Miltenyi Biotec Inc.</td><td>130-042-401</td><td>T細胞増殖アッセイ</td></tr><tr><td>Pre-Separation Filter</td><td>Miltenyi Biotec Inc.</td><td>130-095-823</td><td>T細胞増殖アッセイ</td></tr><tr><td>コラゲナーゼ D</td><td>Sigma Aldrich Inc.</td><td>11088858001</td><td>T細胞増殖アッセイ</td></tr><tr><td>HBSS</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>14025076</td><td>T細胞増殖アッセイ</td></tr><tr><td>オボアルブミン(OVA)ペプチド323&ndash;329</td><td>シグマ・アルドリッチ</td><td>O1641</td><td>T細胞増殖アッセイ</td></tr><tr><td>マウスIFN-&γ;TaqMan プローブ</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Mm01168134_m1</td><td>qRT-PCR</td></tr><tr><td>マウス IL-12a TaqMan プローブ</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Mm00434165</td><td>qRT-PCR</td></tr><tr><td>マウス IL-12 p70 DuoSet ELISA</td><td>R&Dシステム</td><td>DY419-05</td><td>ELISA</td></tr><tr><td>マウスEDN-1 ELISA</td><td>RayBiotech</td><td>ELM-EDN1-1</td><td>ELISA</td></tr><tr><td>TNF-&alpha;TaqMan プローブ</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Mm00443258</td><td>qRT-PCR</td></tr><tr><td>マウス TNF-&alpha;Quantikine ELISA キット</td><td>R&D systems</td><td>MTA00B</td><td>ELISA</td></tr><tr><td>IL-6 TaqMan プローブ</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Mm00446190</td><td>qRT-PCR</td></tr><tr><td>マウス IL-6 Quantikine ELISA キット</td><td>R&D systems</td><td>M6000B</td><td>ELISA</td></tr><tr><td>IL-23a TaqMan プローブ</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Mm01160011</td><td>qRT-PCR</td></tr><tr><td>マウス IL-23 DuoSet ELISA</td><td>R&D systems</td><td>DY1887-05</td><td>ELISA</td></tr><tr><td>IL-4 TaqMan プローブ</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Mm99999154_m1</td><td>qRT-PCR</td></tr><tr><td>IL-10 TaqMan プローブ</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Mm01288386_m1</td><td>qRT-PCR</td></tr><tr><td>TGF-&beta;TaqMan プローブ</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Mm01178820_m1</td><td>qRT-PCR</td></tr><tr><td>Anti-Heme Oxygenase 1 抗体</td><td>Abcam</td><td>ab13248</td><td>ウェスタンブロッティング</td></tr><tr><td>アンチベータ-アクチン抗体</td><td>Abcam</td><td>ab8226</td><td>ウェスタンブロッティング</td></tr><tr><td>CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System</td><td>Bio-Rad Inc.</td><td></td><td>qRT-PCR</td></tr><tr><td>BD FACSCalibur Cell Analyzer</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>フローサイトメトリー</td></tr></tbody></table>

開発とマウス免疫寛容樹状細胞の機能解析

Development and Functional Characterization of Murine Tolerogenic Dendritic Cells

外国の抗原に対する調整の応答のタイトなバランスを維持することによって免疫システムが作動して共生生物に由来する抗原と同様に自己抗原に対する応答のない状態を維持します。この免疫恒常性の中断は、慢性炎症、自己免疫疾患の開発につながることができます。樹状細胞 (Dc) は、外国の抗原に対する免疫応答を開始するナイーブ T 細胞を活性化に関与する生得の免疫組織のプロフェッショナルな抗原提示細胞です。しかし、Dc は行動を維持し T 細胞寛容を促進し、どちらか自己免疫または慢性炎症状態の発展に貢献するエフェクター細胞を抑制する TolDCs にも区別できます。TolDCs の私達の理解の最近の進歩は、その分化条件を調節することによって DC 耐性が得られることを示唆しています。この現象は、多数の免疫疾患で免疫寛容を破る原因の TolDC 療法の開発の途方もない成長につながっています。臨床免疫マウスモデルで成功した研究はさらに自己免疫疾患の治療に TolDCs の免疫療法の有用性を検証しました。今日、TolDCs 防御免疫をそのまま残しながら病原性自己免疫反応をターゲットに様々 な免疫疾患における免疫寛容を回復のための診療所で有望な免疫療法のツールとなっています。TolDCs を誘導するために複数のラボで戦略の配列が提案されているが、これらの細胞の機能的な細胞の表現型を特徴付けることは一貫性はありません。このプロトコルは、大量合成部の 2-cyano-3,12-dioxooleana-1,9-dien-28-oic と TolDCs にそれらを区別するために使用される一意のメソッド内の骨髄由来の Dc の開発のステップ バイ ステップ ガイドを提供します酸-フッ素-プロピル-アミド (CDDO DFPA)、および TolDCs の必須の分子シグネチャの分析を含む、彼らの表現型を確認するための技術。最後に、我々 は多発性硬化症の前臨床モデルでの免疫応答の in vitroとin vivoのテストで TolDC 関数を評価する手法を示す.

分化と黒谷の選択:
骨髄前駆細胞は、GM-CSF と il-4 による (図 1 a) の 7 日間の Idc に分化するの存在下で完全 RPMI 培地で培養しました。1 日目、セル サイズが小さかったと球状の形態を示した。3 日目の新鮮な媒体の交換クラスターを形成する細胞を助け、また CD11c の人口を増加する前に PBS で洗浄+細胞。4 日目、黒谷はサイズに拡大された、クラスターの形成を開始しました。付着マクロファージも変換され下部に細長い形状を有する板の観察。5 日に黒谷の大規模なサイズのクラスターが形成されます。6 日半付着性と浮動黒谷の多数も観察されました。黒谷は 7 日で収穫され、マウス Dc の特異的マーカーとして CD11c 表現のためのフローサイトメトリーで分析しました。図 ...

ここでは、開発し免疫寛容樹状細胞 (TolDCs) の特徴し、その免疫療法の有用性を評価するためのプロトコルを提案する.

The immune system operates by maintaining a tight balance between coordinating responses against foreign antigens and maintaining an unresponsive state ...

このプロトコルの全体的な目標は、多発性硬化症などの自己免疫疾患の治療における免疫療法の有用性を評価するためのマウス寛容性樹状細胞を開発し、特徴付けることです。この方法は、寛容性樹状細胞を開発し、機能的に特徴付けるための標準化された方法を提供することにより、寛容性樹状細胞療法分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、寛容性樹状細胞の正常な発生と機能的寛容性樹状細胞の有効性試験に使用できることです。この手法の影響は重要です。これらは、寛容性樹状細胞が固有の免疫制御メカニズムの影響を受けたまま異常な免疫応答をリセットできるため、自己免疫疾患の細胞免疫療法の開発に向けて拡張されています。標準的なプロトコルに従って、8週齢から10週齢のC57BL / 6マウスから後肢の骨を採取した後、外科用ブレードと鉗子を使用してできるだけ多くの組織を解剖し、きれいな脛骨と大腿骨を70%エタノールを含む6センチメートルの培養皿に入れます。手術用ブレードで骨の両端をトリミングし、23ゲージの針を備えた3ミリリットルの注射器を使用して、最初の骨から3ミリリットルのPBSを含む骨髄を15ミリリットルの円錐管に洗い流します。すべての骨髄が採取されたら、細胞懸濁液を遠心分離し、ペレットを1ミリリットルの赤血球溶解緩衝液に再懸濁します。5分後、9ミリリットルのPBSで溶解を停止し、遠心分離により細胞を回収します。白骨髄細胞ペレットを10ミリリットルの培養培地に再懸濁し、40μメートルの細胞ストレーナーで細胞をろ過して新しいチューブに入れます。GM-CSFおよびIL-4を添加した培養培地中の細胞を1ミリリットルあたり10〜6細胞の濃度の1倍に調整する。そして、3ミリリットルの細胞を6ウェルプレートの各ウェルにプレートし、摂氏37度と5%の二酸化炭素で3日間のインキュベーションを行います。3日目に、各ウェルの細胞を2ミリリットルのPBSで洗浄し、穏やかに渦巻いて非接着性細胞を除去します。次に、GM-CSFとIL-4を添加した3ミリリットルの新鮮培地を細胞に供給し、細胞を細胞培養インキュベーターに戻し、さらに3ミリリットルの新鮮培地を追加し、2日後に各ウェルにサイトカインを補給します。培養の7日目に、プレートを氷の上に置きます。10分後、各ウェルで培地を静かにピペットで動かし、緩く付着した未熟な骨髄由来樹状細胞を懸濁液に取り除きます。次に、遠心分離による回収のために細胞をプールし、その後の下流分析のためにペレットを適切な量の新鮮培地に再懸濁します。同系T細胞の増殖を測定するには、まず3ミリリットルのシリンジプランジャーの後端を使用して、生後8〜10週齢のOT2 C57BL/6マウスの脾臓を40マイクロメートルの細胞ストレーナでつぶし、PBSでストレーナーをすすぎます。プールした細胞懸濁液を遠心分離によりペレット化し、400マイクロリットルの磁気細胞ソーティングバッファーと100マイクロリットルのCD4陽性T細胞ビオチン抗体カクテルに摂氏4度で5分間再懸濁します。インキュベーションの最後に、300マイクロリットルのソーティングバッファーと200マイクロリットルの抗ビオチンビーズを細胞に加え、摂氏4度の10分間のインキュベーションを行い、磁気ビーズカラムとプレセパレーションフィルターを適切なサイズの細胞分離磁石に入れます。カラムを3ミリリットルのソーティングバッファーですすぎ、9ミリリットルのソーティングバッファーを細胞に加えます。遠心分離後、細胞とビーズペレットを3ミリリットルのソーティングバッファーに再懸濁し、細胞懸濁液をカラムに加えて、CD4陽性T細胞溶出液を適切な容器に回収します。次に、さらに3ミリリットルのソーティングバッファーでカラムを洗浄し、フロースルーを収集してT細胞を氷上に置きます。同系脾臓汎樹状細胞の単離では、8週齢から10週齢のC57BL/6マウスの脾臓を6cmの培養皿に入れ、25ゲージの針を備えた1ミリリットルの注射器を使用して、1ミリリットルのコラゲナーゼD溶液を脾臓に2回注入します。次に、ハサミを使って脾臓を細かく切り、室温で25分間振とうしながらインキュベートします。インキュベーションの終了時に、500マイクロリットルの0.5モルEDTAを組織スラリーに加えて、室温で最後の5分間インキュベーションします。インキュベーションの終了時に、3ミリリットルのシリンジプランジャーの後端を使用して、脾臓スラリーを40マイクロメートルのセルストレーナーでつぶし、遠心分離によって細胞を収集します。ペレットを350マイクロリットルの磁気細胞ソーティングバッファー、50マイクロリットルのFc受容体ブロッキング試薬、および100マイクロリットルの汎樹状細胞ビオチン-抗体カクテルに再懸濁し、摂氏4度で10分間インキュベートします。インキュベーションの終了時に、細胞を9ミリリットルの選別緩衝液で洗浄し、ペレットを800マイクロリットルの新鮮な選別緩衝液に200マイクロリットルの抗ビオチンビーズで摂氏4度で10分間再懸濁し、磁気ビーズ選別による脾臓汎樹状細胞集団の単離を行います。細胞をミリリットル濃度あたり10〜5番目の樹状細胞の2倍で再懸濁し、目的のトリテルペノイドの適切な実験濃度で摂氏37度で1時間処理します。インキュベーションの最後の3分の1の間に、T細胞を1マイクロモルCFSE中の1ミリリットルあたり10〜7番目の細胞濃度で摂氏37度で15分間再懸濁します。次に、細胞をPBSで洗浄し、容量を最終濃度の2×10〜6番目のT細胞/mLに再調整します。処理した樹状細胞100マイクロリットルを、96ウェルプレートの各ウェルでCFSE標識CD4陽性T細胞100マイクロリットルと共培養し、OVAペプチド323-329の1ミリリットルあたり100ナノグラムを細胞に添加し、インキュベーションの2〜3日後にフローサイトメトリーによりT細胞のCFSE強度を測定する。GM-CSFおよびIL-4の存在下で完全培地で培養された骨髄前駆細胞は、培養6日後に未熟な樹状細胞形態を示します。未熟な7日目の骨髄由来樹状細胞の解析により、培養細胞の大部分が特異的なマウス樹状細胞マーカーであるCD11cを強力に発現していることが明らかになりました。LPS誘発性成熟マーカーの発現に対する影響がないにもかかわらず、骨髄由来樹状細胞は、CDDO-DFPA治療に応答して寛容性樹状細胞プロファイルを示し、LPS刺激後でも炎症誘発性遺伝子発現の有意な減少および抗炎症性サイトカイン遺伝子発現の増強によって証明されます。さらに、OVAがCDDO-DFPA処理樹状細胞によって提示されるin vitro共培養およびMOGパルスCDDO-DFPA処理樹状細胞の注射後の実験的自己免疫性脳脊髄炎への進行の遅延によって証明されるように、in vivoでは、同系OVA特異的T細胞増殖の有意な減少が観察され、これらの細胞の寛容性表現型がさらに確認されます。この技術を習得すると、実験が適切に行われれば、8日以内に寛容性樹状細胞を開発できます。この手順を試みる際には、寛容性樹状細胞は均質ではないことを覚えておくことが重要です。それらの細胞表現型は、それらの耐性の誘導に使用される薬剤の性質に依存します。この手順に続いて、詳細なフローサイトメトリー解析などの他の方法を実行して、寛容性樹状細胞誘導抗原特異的T細胞エネルギーまたはアポトーシス、またはT細胞分化の能力に関する追加の質問に答えることができます。このビデオを見れば、既知の薬剤を使用して機能活性な寛容性樹状細胞を開発する方法や、これらの細胞を誘導する新しい物質の能力をテストする方法についてよく理解できるはずです。

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開発とマウス免疫寛容樹状細胞の機能解析

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