開発とマウス免疫寛容樹状細胞の機能解析

このプロトコルの全体的な目標は、多発性硬化症などの自己免疫疾患の治療における免疫療法の有用性を評価するためのマウス寛容性樹状細胞を開発し、特徴付けることです。この方法は、寛容性樹状細胞を開発し、機能的に特徴付けるための標準化された方法を提供することにより、寛容性樹状細胞療法分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、寛容性樹状細胞の正常な発生と機能的寛容性樹状細胞の有効性試験に使用できることです。

この手法の影響は重要です。これらは、寛容性樹状細胞が固有の免疫制御メカニズムの影響を受けたまま異常な免疫応答をリセットできるため、自己免疫疾患の細胞免疫療法の開発に向けて拡張されています。標準的なプロトコルに従って、8週齢から10週齢のC57BL / 6マウスから後肢の骨を採取した後、外科用ブレードと鉗子を使用してできるだけ多くの組織を解剖し、きれいな脛骨と大腿骨を70%エタノールを含む6センチメートルの培養皿に入れます。

手術用ブレードで骨の両端をトリミングし、23ゲージの針を備えた3ミリリットルの注射器を使用して、最初の骨から3ミリリットルのPBSを含む骨髄を15ミリリットルの円錐管に洗い流します。すべての骨髄が採取されたら、細胞懸濁液を遠心分離し、ペレットを1ミリリットルの赤血球溶解緩衝液に再懸濁します。5分後、9ミリリットルのPBSで溶解を停止し、遠心分離により細胞を回収します。

白骨髄細胞ペレットを10ミリリットルの培養培地に再懸濁し、40μメートルの細胞ストレーナーで細胞をろ過して新しいチューブに入れます。GM-CSFおよびIL-4を添加した培養培地中の細胞を1ミリリットルあたり10〜6細胞の濃度の1倍に調整する。そして、3ミリリットルの細胞を6ウェルプレートの各ウェルにプレートし、摂氏37度と5%の二酸化炭素で3日間のインキュベーションを行います。

3日目に、各ウェルの細胞を2ミリリットルのPBSで洗浄し、穏やかに渦巻いて非接着性細胞を除去します。次に、GM-CSFとIL-4を添加した3ミリリットルの新鮮培地を細胞に供給し、細胞を細胞培養インキュベーターに戻し、さらに3ミリリットルの新鮮培地を追加し、2日後に各ウェルにサイトカインを補給します。培養の7日目に、プレートを氷の上に置きます。

10分後、各ウェルで培地を静かにピペットで動かし、緩く付着した未熟な骨髄由来樹状細胞を懸濁液に取り除きます。次に、遠心分離による回収のために細胞をプールし、その後の下流分析のためにペレットを適切な量の新鮮培地に再懸濁します。同系T細胞の増殖を測定するには、まず3ミリリットルのシリンジプランジャーの後端を使用して、生後8〜10週齢のOT2 C57BL/6マウスの脾臓を40マイクロメートルの細胞ストレーナでつぶし、PBSでストレーナーをすすぎます。

プールした細胞懸濁液を遠心分離によりペレット化し、400マイクロリットルの磁気細胞ソーティングバッファーと100マイクロリットルのCD4陽性T細胞ビオチン抗体カクテルに摂氏4度で5分間再懸濁します。インキュベーションの最後に、300マイクロリットルのソーティングバッファーと200マイクロリットルの抗ビオチンビーズを細胞に加え、摂氏4度の10分間のインキュベーションを行い、磁気ビーズカラムとプレセパレーションフィルターを適切なサイズの細胞分離磁石に入れます。カラムを3ミリリットルのソーティングバッファーですすぎ、9ミリリットルのソーティングバッファーを細胞に加えます。

遠心分離後、細胞とビーズペレットを3ミリリットルのソーティングバッファーに再懸濁し、細胞懸濁液をカラムに加えて、CD4陽性T細胞溶出液を適切な容器に回収します。次に、さらに3ミリリットルのソーティングバッファーでカラムを洗浄し、フロースルーを収集してT細胞を氷上に置きます。同系脾臓汎樹状細胞の単離では、8週齢から10週齢のC57BL/6マウスの脾臓を6cmの培養皿に入れ、25ゲージの針を備えた1ミリリットルの注射器を使用して、1ミリリットルのコラゲナーゼD溶液を脾臓に2回注入します。

次に、ハサミを使って脾臓を細かく切り、室温で25分間振とうしながらインキュベートします。インキュベーションの終了時に、500マイクロリットルの0.5モルEDTAを組織スラリーに加えて、室温で最後の5分間インキュベーションします。インキュベーションの終了時に、3ミリリットルのシリンジプランジャーの後端を使用して、脾臓スラリーを40マイクロメートルのセルストレーナーでつぶし、遠心分離によって細胞を収集します。

ペレットを350マイクロリットルの磁気細胞ソーティングバッファー、50マイクロリットルのFc受容体ブロッキング試薬、および100マイクロリットルの汎樹状細胞ビオチン-抗体カクテルに再懸濁し、摂氏4度で10分間インキュベートします。インキュベーションの終了時に、細胞を9ミリリットルの選別緩衝液で洗浄し、ペレットを800マイクロリットルの新鮮な選別緩衝液に200マイクロリットルの抗ビオチンビーズで摂氏4度で10分間再懸濁し、磁気ビーズ選別による脾臓汎樹状細胞集団の単離を行います。細胞をミリリットル濃度あたり10〜5番目の樹状細胞の2倍で再懸濁し、目的のトリテルペノイドの適切な実験濃度で摂氏37度で1時間処理します。

インキュベーションの最後の3分の1の間に、T細胞を1マイクロモルCFSE中の1ミリリットルあたり10〜7番目の細胞濃度で摂氏37度で15分間再懸濁します。次に、細胞をPBSで洗浄し、容量を最終濃度の2×10〜6番目のT細胞/mLに再調整します。処理した樹状細胞100マイクロリットルを、96ウェルプレートの各ウェルでCFSE標識CD4陽性T細胞100マイクロリットルと共培養し、OVAペプチド323-329の1ミリリットルあたり100ナノグラムを細胞に添加し、インキュベーションの2〜3日後にフローサイトメトリーによりT細胞のCFSE強度を測定する。

GM-CSFおよびIL-4の存在下で完全培地で培養された骨髄前駆細胞は、培養6日後に未熟な樹状細胞形態を示します。未熟な7日目の骨髄由来樹状細胞の解析により、培養細胞の大部分が特異的なマウス樹状細胞マーカーであるCD11cを強力に発現していることが明らかになりました。LPS誘発性成熟マーカーの発現に対する影響がないにもかかわらず、骨髄由来樹状細胞は、CDDO-DFPA治療に応答して寛容性樹状細胞プロファイルを示し、LPS刺激後でも炎症誘発性遺伝子発現の有意な減少および抗炎症性サイトカイン遺伝子発現の増強によって証明されます。

さらに、OVAがCDDO-DFPA処理樹状細胞によって提示されるin vitro共培養およびMOGパルスCDDO-DFPA処理樹状細胞の注射後の実験的自己免疫性脳脊髄炎への進行の遅延によって証明されるように、in vivoでは、同系OVA特異的T細胞増殖の有意な減少が観察され、これらの細胞の寛容性表現型がさらに確認されます。この技術を習得すると、実験が適切に行われれば、8日以内に寛容性樹状細胞を開発できます。この手順を試みる際には、寛容性樹状細胞は均質ではないことを覚えておくことが重要です。

それらの細胞表現型は、それらの耐性の誘導に使用される薬剤の性質に依存します。この手順に続いて、詳細なフローサイトメトリー解析などの他の方法を実行して、寛容性樹状細胞誘導抗原特異的T細胞エネルギーまたはアポトーシス、またはT細胞分化の能力に関する追加の質問に答えることができます。このビデオを見れば、既知の薬剤を使用して機能活性な寛容性樹状細胞を開発する方法や、これらの細胞を誘導する新しい物質の能力をテストする方法についてよく理解できるはずです。