Name: 酵母表面表示タンパク質の酵素修飾およびフローサイトメトリー評価 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-05-30T14:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 54 s
Description: 学ぶ酵母表面表示タンパク質の酵素修飾とフローサイトメトリー評価。SHP-2チロシンホスファターゼの脱リン酸化活性を解析し、酵素基質相互作用の動態学的マッピングを可能にする革新的な手法です。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

1. プラスミドを保有する酵母の細胞増殖とタンパク質発現誘導
<ol>
	<li>表1に記載されているレシピに従って、非プラスミド含有酵母(YPD)、プラスミド含有酵母細胞増殖(SD-CAA)、タンパク質発現誘導(SRG-CAA)、およびSD-CAAプレートの増殖に必要な培地を調製します。</li>
	<li>キナーゼ-基質ペアを含む酵母ディスプレイプラスミドDNAを、リチウムカチオンベースの方法30,31を通じてEBY-100酵母細胞に形質転換します。これは、さまざまなメーカーの酵母形質転換キットで一般的に採用されています。 注:エレクトロポレーション32 または他の好ましい酵母プラスミド形質転換技術は、形質転換されるプラスミドコンストラクトに応じて使用することができる。</li>
	<li>10 mLのYPD培地を含む14 mLの培養チューブを調製します。EBY-100細胞を接種し、30°C、300rpmの振とうインキュベーターで培養物が0.8-1.0(8 x 106- 1 x 107細胞/mL)の光学密度(OD600nm)に達するまで増殖させます。 注:OD600nm は、それぞれの培地に酵母培養物の1:10希釈液を含む3mLサンプルキュベットと、サンプル希釈に使用する培地を含む3mLブランクキュベットを調製することによって測定されます。分光光度計のOD600nm プログラムは、最初にブランクキュベットを測定し、次に各サンプルに対応する希釈を設定して各サンプルキュベットを測定するために使用されます。1 OD600nm は1 ×10 7 酵母/ mLに相当します。</li>
	<li>培養物を1,000 x g で3分間遠心分離して細胞を回収し、酵母形質転換キットに付属の1回目の 洗浄液、またはTE(10 mM Tris-HClおよび1.0 mM EDTA)31で洗浄します。</li>
	<li>細胞を再び1,000 x g で3分間ペレット化し、酵母形質転換キットに付属の形質転換バッファー1 mLまたは滅菌水に再懸濁します。細胞は50μLのアリコートに分注し、-80°Cで最大6ヶ月間保存することができます。</li>
	<li>プラスミド形質転換では、プラスミド1個につき1アリコートを調製し、氷上で解凍した後、酵母ディスプレイコンストラクトを含む0.5〜1.5μgのプラスミドDNAを細胞に直接添加します。酵母形質転換キットで提供される0.5mLの形質転換溶液、または滅菌50%ポリエチレングリコールおよび0.1MLiOAc溶液31の0.5mLを添加する。細胞、プラスミドDNA、形質転換溶液の混合物をピペッティングで完全に混合します。</li>
	<li>形質転換混合物を30°Cで30〜60分間静的にインキュベートし、ボルテックス混合物を15分間隔でインキュベートします。1,000 g× gで3分間遠心分離して細胞を回収します。</li>
	<li>4.5 mLのSD-CAA培地を含む14 mLの培養チューブを調製します。目的のプラスミドを含む細胞を500 μLのSD-CAAに再懸濁し、調製した4.5 mLを接種します。</li>
	<li>寒天に穴を開けないように注意しながら、接種した培養液50 μLを5 mLをSD-CAAプレートに分配し、30°Cで48時間静的にインキュベートして、形質転換効率を決定します。</li>
	<li>5 mLのSD-CAA細胞培養液を振盪インキュベーターで30°C、300 rpmで少なくとも18時間インキュベートします。16時間後および20時間後の光学密度(OD600nm)を監視します。サンプルが6を超えない十分な光学密度まで成長したら、培養物を2,500 × gで3分間遠心分離します。酵母ペレットを乱さずに上清を捨てます。</li>
	<li>SRG-CAA中の酵母ペレットを最終外径600nm (&lt;1 ×10 7 酵母/mL)未満に再懸濁します。</li>
	<li>酵母培養物を30°C、300rpmの振盪インキュベーターで少なくとも8時間、24時間以内でインキュベートします。 注:酵母細胞におけるタンパク質発現の誘導は、20-37°Cの範囲で変化させることができる。30°Cはキナーゼ/基質対29,33の合成に適しているが、研究対象の特定のタンパク質に必要と思われる場合は調整することができる。</li>
	<li>外径600nm を測定して、細胞密度を決定します。 注:この時点で、酵母培養物を4°Cで保存することにより、プロトコールを停止することができます。</li>
</ol>
2. 4G10抗ホスホチロシン抗体のビオチン化
<ol>
	<li>PEG4-NHS-ビオチンの2 mgバイアルを、滅菌PBS680 μLを加えて最終濃度5 mMに再懸濁します。 注:PEG4-NHS-ビオチンの再懸濁は、ビオチン化反応が行われる直前に新たに行う必要があります。NHSは水溶液中で加水分解します。滅菌PBSおよびバイアルの使用は、長期保存用の試薬の調製や、試薬の生存率や実施される高感度アッセイに対する汚染物質の潜在的な影響を軽減するための細胞ベースのアッセイでの使用に重要です。</li>
	<li>4G10抗体濃度に基づいて、100 μgの抗体を滅菌済みの1.7 mLバイアルに加えます。</li>
	<li>ステップ2.1で調製した5 mM PEG4-NHS-ビオチン100 μgを保持したバイアルに1 μLを添加し、ビオチンと抗体のモル比を7.5:1にします。混合物を穏やかにピペットで動かして、反応を均質化します。</li>
	<li>反応を室温で少なくとも2時間一定回転させてインキュベートします。</li>
	<li>0.5 mL スピン脱塩カラムの製造元のプロトコルに従って、ビオチン化 4G10(B-4G10)のバッファーを PBS に交換します。 注:分子量カットオフ(MWCO)が7 kDaの脱塩カラムは、抗体のビオチン化に一般的に使用され、未反応のビオチンやその他の低分子を除去しながら、より大きな抗体を保持することができます。</li>
	<li>B-4G10抗体をPBSA(PBSと1 g/Lウシ血清アルブミン)で最終濃度1 μMに希釈します。B-4G10抗体を少量に分注して、凍結融解サイクルの繰り返しを防ぎます。 注:ビオチン化抗体は、4°Cで保存し、最大3ヶ月間毎日使用できますが、効率を大幅に損なうことはありません。使用しない残りのアリコートは、-20°Cで最大2年間保管してください。</li>
</ol>
3. 酵母細胞表面に発現する基質の脱リン酸化
<ol>
	<li>文献34に前述したように、2倍作業緩衝液を調製する。 注:必要な成分の測定を容易にするために、2倍をお勧めします。</li>
	<li>ステップ 3.1 1:2 で調製した 2x バッファー溶液を脱イオン水で希釈することにより、1.7 mL バイアル中のサンプル用のワーキングバッファーを調製します。 注:各サンプルの総反応量は20μLで、各サンプルには10μLから18μLの作業バッファーが必要です。すべてのサンプルまたはコントロールに十分な作業バッファーを準備します。</li>
	<li>表2に記載されている推奨サンプル調製に従って、1.7 mLバイアルに対応するコントロール名またはサンプル名をラベル付けします。</li>
	<li>ステップ1.9で測定したOD600nm に基づいて、各サンプルの対応する酵母培養物から200万個(2 × 106)酵母細胞を回収するために必要な培養量を計算します。</li>
	<li>前のステップで計算した酵母培養液の量を、各サンプルの1.7 mLバイアルに加えます。</li>
	<li>バイアルを4,500 × gで1分間遠心分離します。マイクロピペットで上澄みを丁寧に取り除き、バイオハザード廃棄物として捨ててください。</li>
	<li>ペレット化した細胞を1 mLのPBSAに再懸濁し、 ステップ3.6を繰り返します。 注:ペレット化された細胞を乱さずに、できるだけ多くの上清を除去することが重要です。</li>
	<li>そのストック濃度に基づいて、20 μLの総反応容量で最終濃度が1,000 nMになるために必要な組換えヒトSHP-2の容量を計算します。 注:組換えSHP-2は、各アッセイで使用されるタンパク質が2回以上の凍結融解サイクルを経ないように、少量で分注する必要があります。アッセイのためにすべてのサンプルが準備された後にアリコートから残ったSHP-2は廃棄する必要があります。 組換え酵素のストック濃度は、ロット番号によって異なります。組換えSHP-2は、通常、0.2〜0.4 mg / mLのストック濃度で調製されます。SHP-2のストック濃度が0.324 mg/mLの場合、これは4.696 μMのストック濃度に相当します(SHP-2の分子量は69 kDa)。20 μLの反応でSHP-2ストックを4.26 μLすると、最終反応濃度は1,000 nM SHP-2になります。</li>
	<li>15 mLの円錐形に調製した10 mLの脱イオン水に7.7 mgのDTTを加えて、5 mM DTT溶液を調製します。装置の制限によりミリグラムの秤量が困難な場合は、10 mLの脱イオン水に0.77 gのDTTを加え、100倍希釈してアッセイに使用する5 mM DTT溶液を作成します。 注:DTT溶液は、利用可能な装置を使用してミリグラムスケールの量を測定することができない場合に、5 mMに希釈するために高濃度のストック溶液で調製することができます。DTT溶液は、加水分解の傾向があり、水で希釈すると長期間にわたって不安定になるため、ワーキングバッファーで細胞の再懸濁に先立って新鮮に調製する必要があります。</li>
	<li>ステップ3.2で調製したワーキングバッファーにペレット化した細胞を再懸濁し、各サンプルまたはコントロールの最終反応量が20 μLになるようにします。 注:添加するワーキングバッファーの量は、各サンプルに含まれるDTT(2 μL)およびSHP-2(ステップ3.8で計算)の量に基づいて計算する必要があります。</li>
	<li>ステップ3.9で調製した5 mM DTT溶液2 μLを各サンプルまたはコントロールに添加し、最終反応濃度を0.5 mM DTTにします。</li>
	<li>ステップ3.8で計算したSHP-2の容量を各サンプルに加えて、最終容量を20μLにし、マイクロピペットを使用して穏やかに混合します。</li>
	<li>サンプルバイアルの蓋をパラフィルムで包み、漏れや相互汚染を防ぎます。</li>
	<li>サンプルを37°Cで2時間、ローター上で一定速度でインキュベートします。</li>
	<li>ローターからサンプルを取り出し、各サンプルに1 mLのPBSAを加えて反応を停止します。</li>
	<li>手順3.6を繰り返します。</li>
</ol>
4. 脱リン酸化基質の細胞標識とフローサイトメトリー解析
<ol>
	<li>ステップ 3.16 のサンプルを 、表 2 に記載されているように、対応する一次試薬の 20 μL 混合物に再懸濁します。サンプルを室温で20分間インキュベートします。 注:使用されるすべての試薬濃度は、酵母細胞の表面に発現するタンパク質の数に対して過剰であると計算されています。この計算は、サンプル35中のすべての2×106酵母から10,000タンパク質/細胞が発現すると仮定しているが、通常はそのうちの~50%しか発現していない。表3は、表2で表される各試薬の過剰標識試薬比率を次のように計算したものである。 
	<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/68208/68208eq1v3.jpg" style="margin: auto;"></li>
	<li>4,500 × g でサンプルを1分間遠心分離し、上清をバイオハザード廃棄物として廃棄します。</li>
	<li>1mLのPBSAに再懸濁して細胞を一度洗浄します。手順4.2を繰り返します。</li>
	<li>表2に記載されているように、対応する二次試薬の混合物である20 μLにサンプルを再懸濁します。光が当たらない状態でサンプルを15分間インキュベートします。</li>
	<li>手順4.2を繰り返します。</li>
	<li>手順4.3を繰り返します。</li>
	<li>洗浄したサンプルを300〜500 μLのPBSAに再懸濁し、5 mLのポリスチレンチューブに移して、適切なフローサイトメーターを使用してすぐに分析します。 注:サンプルを輸送する必要がある場合は、濡れた氷の上に置いてください。推奨されませんが、サンプルは湿ったペレットとして4°Cで最大2時間保存できます。</li>
	<li>新しい実験に必要なサイトメーターの起動と準備を行った後、File(ファイル)メニュー内のNew Experiment(新規実験)ボタンをクリックし、実験に名前を付けてSave(保存)をクリックし、取得したデータが目的のファイルパスに保存されていることを確認します。</li>
	<li>上部ツールバー内のドットプロットアイコンを選択して、実行するサンプルごとに2つ以上のドットプロットを作成します。ドットプロットの 1 つで、X 軸名を選択して FSC-A チャネルを表示し、Y 軸名を選択して SSC-A チャネルを表示します。このプロットは、側散乱光 - 面積と前方散乱 - 面積を示しており、さらなる分析のために酵母細胞をゲートするために使用されます。</li>
	<li>別のドットプロットで、X軸の名前を選択して、一次抗エピトープタグ抗体を標的とする二次試薬が蛍光を発するチャネルを表示します。Y軸名を選択すると、ストレプトアビジン二次試薬が蛍光を発するチャンネルが表示されます。このプロットは、酵母細胞として横方散布図と前方散布図プロットからゲートされたイベントのみを表示し、Y軸にチロシンリン酸化、X軸に基質表面発現を表示するために使用されます。 注:この例では、一次抗エピトープタグ抗体を標的とする二次試薬はFITC(AF-488)チャネルで蛍光を発し、ストレプトアビジン二次試薬はAF-647チャネルで蛍光を発します。使用されるチャネルは、標識中に使用される一次試薬および二次試薬によって異なる場合があります。</li>
	<li>各サンプルチューブをサイトメーターのチューブホルダーにセットし、サイトメーターの[Run]を選択して、サンプルのロードとデータの取得を開始します。必要に応じて、表示するイベント、記録するイベント、記録する時間、およびサンプル流量を調整します。</li>
	<li>ステップ4.9で作成したSSC-A対FSC-Aのプロットで健康な酵母細胞を囲むゲートを定義します。 図 1 は、適用するゲーティング戦略の説明的表現を示しています。 注:SSC-A対FSC-Aのプロットでは、定義された酵母ゲート内で100,000のイベントを表示し、50,000のイベントを記録することが、さらなる分析のために十分なデータを視覚化して収集するための適切なガイドラインです。一重項酵母に対して選択するためのより厳密なゲーティング戦略は、最近報告された36のように、前方散乱高さと前方散乱面積のプロットに基づいて適用することができる。 図1 に示すゲーティング戦略は、スキャッターゲーティングによる一重項および一部のダブレット酵母を含む、それほど厳密でないアプローチに対応しています。</li>
	<li>フローサイトメトリーアナライザーを使用して、すべてのコントロールサンプルの蛍光を記録します。コントロールサンプルは、以下のステップ4.14で説明するように、ゲーティング戦略を定義するために最初に定期的に収集されます。</li>
	<li>処理したサンプルを分析する前に、ステップ4.10で作成したプロットのゲーティング戦略を定義します。 図 1 は、適用するゲーティング戦略の説明的表現を示しています。</li>
	<li>フローサイトメーターとステップ4.12および4.14で定義されたゲーティング戦略を使用して、脱リン酸化サンプルの蛍光を記録します。</li>
	<li>フローサイトメトリー解析ソフトウェアを使用して取得したフローサイトメトリーデータを解析します。</li>
	<li>表面でタンパク質を発現する細胞のY軸中央値と、サンプルとコントロール間で非表示細胞によって提供されるベースラインリン酸化を測定および比較することにより、脱リン酸化を評価します。リン酸化差の中央値の割合を次のように計算します。 
	<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/68208/68208eq2v5.jpg" style="margin: auto;"></li>
</ol>

<ol><li>Lea, M. A., Weber, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+enzymes+in+homeostasis%3A+VIII.+Inhibition+of+the+activity+of+glycolytic+enzymes+by+free+fatty+acids%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Role of enzymes in homeostasis: VIII. Inhibition of the activity of glycolytic enzymes by free fatty acids.</a> J Biol Chem. 243 (6), 1096-1102 (1968).</li>
<li>Mahé, M., Rios-Fuller, T. J., Karolin, A., Schneider, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetics+of+enzymatic+dysfunctions+in+metabolic+disorders+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Oncol%22%5BJournal%5D)">Genetics of enzymatic dysfunctions in metabolic disorders and cancer.</a> Front Oncol. 13, 1230934(2023).</li>
<li>Fernandez-de-Cossio-Diaz, J., Vazquez, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+physical+model+of+cell+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">A physical model of cell metabolism.</a> Sci Rep. 8 (1), 8349(2018).</li>
<li>Metallo, C. M., Vander Heiden, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Understanding+metabolic+regulation+and+its+influence+on+cell+physiology%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Understanding metabolic regulation and its influence on cell physiology.</a> Mol Cell. 49 (3), 388-398 (2013).</li>
<li>Mildvan, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+signaling+and+related+enzymes%5BTitle%5D)+AND+%22Proteins%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of signaling and related enzymes.</a> Proteins. 29 (4), 401-416 (1997).</li>
<li>Frosina, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overexpression+of+enzymes+that+repair+endogenous+damage+to+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Biochem%22%5BJournal%5D)">Overexpression of enzymes that repair endogenous damage to DNA.</a> Eur J Biochem. 267 (8), 2135-2149 (2000).</li>
<li>Schärer, O. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemistry+and+biology+of+DNA+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Angew+Chem+Int+Ed%22%5BJournal%5D)">Chemistry and biology of DNA repair.</a> Angew Chem Int Ed. 42 (26), 2946-2974 (2003).</li>
<li>de la Fuente, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzyme+therapy%3A+Current+challenges+and+future+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Enzyme therapy: Current challenges and future perspectives.</a> Int J Mol Sci. 22 (17), 9181(2021).</li>
<li>Robertson, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymes+as+a+special+class+of+therapeutic+target%3A+clinical+drugs+and+modes+of+action%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">Enzymes as a special class of therapeutic target: clinical drugs and modes of action.</a> Curr Opin Struct Biol. 17 (6), 674-679 (2007).</li>
<li>Goddard, J. -P., Reymond, J. -L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzyme+assays+for+high-throughput+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Enzyme assays for high-throughput screening.</a> Curr Opin Biotechnol. 15 (4), 314-322 (2004).</li>
<li>Helm, J. S., Hu, Y., Chen, L., Gross, B., Walker, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+active-site+inhibitors+of+MurG+using+a+generalizable%2C+high-throughput+glycosyltransferase+screen%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Chem+Soc%22%5BJournal%5D)">Identification of active-site inhibitors of MurG using a generalizable, high-throughput glycosyltransferase screen.</a> J Am Chem Soc. 125 (37), 11168-11169 (2003).</li>
<li>Veldhuyzen, W. F., Nguyen, Q., McMaster, G., Lawrence, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+light-activated+probe+of+intracellular+protein+kinase+activity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Chem+Soc%22%5BJournal%5D)">A light-activated probe of intracellular protein kinase activity.</a> J Am Chem Soc. 125 (44), 13358-13359 (2003).</li>
<li>Torres, M., Forman, H. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aTorres%2C+M+%22Encyclopedia+of+Respiratory%22">Encyclopedia of Respiratory</a>. Laurent, G. J., Shapiro, S. D. , Academic Press. 10-18 (2006).</li>
<li>Blume-Jensen, P., Hunter, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oncogenic+kinase+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Oncogenic kinase signalling.</a> Nature. 411 (6835), 355-365 (2001).</li>
<li>Martin, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+signaling+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Cell signaling and cancer.</a> Cancer Cell. 4 (3), 167-174 (2003).</li>
<li>Lothrop, A. P., Torres, M. P., Fuchs, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deciphering+post-translational+modification+codes%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Deciphering post-translational modification codes.</a> FEBS Lett. 587 (8), 1247-1257 (2013).</li>
<li>Graves, J. D., Krebs, E. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+phosphorylation+and+signal+transduction%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacol+Ther%22%5BJournal%5D)">Protein phosphorylation and signal transduction.</a> Pharmacol Ther. 82 (2), 111-121 (1999).</li>
<li>Hafen, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinases+and+phosphatases--A+marriage+is+consummated%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Kinases and phosphatases--A marriage is consummated.</a> Science. 280 (5367), 1212-1213 (1998).</li>
<li>Westphal, R. S., Anderson, K. A., Means, A. R., Wadzinski, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+signaling+complex+of+Ca2%2B-calmodulin-dependent+protein+kinase+IV+and+protein+phosphatase+2A%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A signaling complex of Ca2+-calmodulin-dependent protein kinase IV and protein phosphatase 2A.</a> Science. 280 (5367), 1258-1261 (1998).</li>
<li>Barford, D., Das, A. K., Egloff, M. -P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+structure+and+mechanism+of+protein+phosphatases%3A+Insights+into+catalysis+and+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biophys+Biomol+Struct%22%5BJournal%5D)">The structure and mechanism of protein phosphatases: Insights into catalysis and regulation.</a> Annu Rev Biophys Biomol Struct. 27, 133-164 (1998).</li>
<li>Liu, Q., Qu, J., Zhao, M., Xu, Q., Sun, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+SHP2+as+a+promising+strategy+for+cancer+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacol+Res%22%5BJournal%5D)">Targeting SHP2 as a promising strategy for cancer immunotherapy.</a> Pharmacol Res. 152, 104595(2020).</li>
<li>Pan, J., Zhou, L., Zhang, C., Xu, Q., Sun, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+protein+phosphatases+for+the+treatment+of+inflammation-related+diseases%3A+From+signaling+to+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Signal+Transduct+Targeted+Ther%22%5BJournal%5D)">Targeting protein phosphatases for the treatment of inflammation-related diseases: From signaling to therapy.</a> Signal Transduct Targeted Ther. 7 (1), 177(2022).</li>
<li>Denard, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((YESS+2.0%2C+a+tunable+platform+for+enzyme+evolution%2C+yields+highly+active+TEV+protease+variants%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synth+Biol%22%5BJournal%5D)">YESS 2.0, a tunable platform for enzyme evolution, yields highly active TEV protease variants.</a> ACS Synth Biol. 10 (1), 63-71 (2021).</li>
<li>Lim, S., Glasgow, J. E., Filsinger Interrante, M., Storm, E. M., Cochran, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual+display+of+proteins+on+the+yeast+cell+surface+simplifies+quantification+of+binding+interactions+and+enzymatic+bioconjugation+reactions%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+J%22%5BJournal%5D)">Dual display of proteins on the yeast cell surface simplifies quantification of binding interactions and enzymatic bioconjugation reactions.</a> Biotechnol J. 12 (5), (2017).</li>
<li>Yi, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+of+TEV+protease+variants+by+yeast+ER+sequestration+screening+%28YESS%29+of+combinatorial+libraries%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Engineering of TEV protease variants by yeast ER sequestration screening (YESS) of combinatorial libraries.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 110 (18), 7229-7234 (2013).</li>
<li>Yi, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yeast+endoplasmic+reticulum+sequestration+screening+for+the+engineering+of+proteases+from+libraries+expressed+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Yeast endoplasmic reticulum sequestration screening for the engineering of proteases from libraries expressed in yeast.</a> Methods Mol Biol. 1319, 81-93 (2015).</li>
<li>Semenza, J. C., Hardwick, K. G., Dean, N., Pelham, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ERD2%2C+a+yeast+gene+required+for+the+receptor-mediated+retrieval+of+luminal+ER+proteins+from+the+secretory+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">ERD2, a yeast gene required for the receptor-mediated retrieval of luminal ER proteins from the secretory pathway.</a> Cell. 61 (7), 1349-1357 (1990).</li>
<li>Mei, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+aromatic+residue-controlled+protein+retention+in+the+endoplasmic+reticulum+of+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Characterization of aromatic residue-controlled protein retention in the endoplasmic reticulum of Saccharomyces cerevisiae.</a> J Biol Chem. 292 (50), 20707-20719 (2017).</li>
<li>Ezagui, J., Russell, B., Mairena, Y., Stern, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endoplasmic+reticulum+sequestration+empowers+phosphorylation+profiling+on+the+yeast+surface%5BTitle%5D)+AND+%22AIChE+J%22%5BJournal%5D)">Endoplasmic reticulum sequestration empowers phosphorylation profiling on the yeast surface.</a> AIChE J. 68 (12), e17931(2022).</li>
<li>Kawai, S., Murata, K. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKawai%2C+S+%22Genetic+Transformation+Systems+in+Fungi%22">Genetic Transformation Systems in Fungi</a>. van den Berg, M. A., Maruthachalam, K. 1, Springer International Publishing. 187-192 (2015).</li>
<li>Kawai, S., Hashimoto, W., Murata, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transformation+of+Saccharomyces+cerevisiae+and+other+fungi%3A+methods+and+possible+underlying+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Bioeng+Bugs%22%5BJournal%5D)">Transformation of Saccharomyces cerevisiae and other fungi: methods and possible underlying mechanism.</a> Bioeng Bugs. 1 (6), 395-403 (2010).</li>
<li>Loock, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-efficiency+transformation+and+expression+of+genomic+libraries+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Protoc%22%5BJournal%5D)">High-efficiency transformation and expression of genomic libraries in yeast.</a> Methods Protoc. 6 (5), 89(2023).</li>
<li>Huang, D., Gore, P. R., Shusta, E. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increasing+yeast+secretion+of+heterologous+proteins+by+regulating+expression+rates+and+post-secretory+loss%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Increasing yeast secretion of heterologous proteins by regulating expression rates and post-secretory loss.</a> Biotechnol Bioeng. 101 (6), 1264-1275 (2008).</li>
<li>Yu, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+protein+tyrosine+phosphatase+SHP2+for+the+treatment+of+PTPN11-associated+malignancies%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cancer+Ther%22%5BJournal%5D)">Targeting protein tyrosine phosphatase SHP2 for the treatment of PTPN11-associated malignancies.</a> Mol Cancer Ther. 12 (9), 1738-1748 (2013).</li>
<li>Stern, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Geometry+and+expression+enhance+enrichment+of+functional+yeast-displayed+ligands+via+cell+panning%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Geometry and expression enhance enrichment of functional yeast-displayed ligands via cell panning.</a> Biotechnol Bioeng. 113 (11), 2328-2341 (2016).</li>
<li>Pan, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+single-cell+gates+for+yeast+display+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Eng+Design+Sel%22%5BJournal%5D)">Optimized single-cell gates for yeast display screening.</a> Protein Eng Design Sel. 38, gzae018(2025).</li>
<li>Margittai, É, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+H2O2+in+the+endoplasmic+reticulum+promotes+in+vivo+disulfide+bond+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Antioxid+Redox+Signal%22%5BJournal%5D)">Production of H2O2 in the endoplasmic reticulum promotes in vivo disulfide bond formation.</a> Antioxid Redox Signal. 16 (10), 1088-1099 (2012).</li>
<li>Werner-Washburne, M., Braun, E., Johnston, G. C., Singer, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stationary+phase+in+the+yeast+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Stationary phase in the yeast Saccharomyces cerevisiae.</a> Microbiol Rev. 57 (2), 383-401 (1993).</li>
<li>Ezagui, J., Stern, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tyrosine+phosphorylation+screening+on+the+yeast+surface+by+magnetic+bead+selection+and+FACS%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Tyrosine phosphorylation screening on the yeast surface by magnetic bead selection and FACS.</a> Methods Mol Biol. 2681, 275-290 (2023).</li>
<li>Yarnall, M. T. N., Kim, S. H., Korntner, S., Bishop, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Destabilization+of+the+SHP2+and+SHP1+protein+tyrosine+phosphatase+domains+by+a+non-conserved+%E2%80%9Cbackdoor%E2%80%9D+cysteine%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Rep%22%5BJournal%5D)">Destabilization of the SHP2 and SHP1 protein tyrosine phosphatase domains by a non-conserved “backdoor” cysteine.</a> Biochem Biophys Rep. 32, 101370(2022).</li>
<li>Dustin, C. M., Heppner, D. E., Lin, M. J., van der Vliet, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Redox+regulation+of+tyrosine+kinase+signalling%3A+more+than+meets+the+eye%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biochem%22%5BJournal%5D)">Redox regulation of tyrosine kinase signalling: more than meets the eye.</a> J Biochem. 167 (2), 151-163 (2020).</li>
<li>Stern, L. A., Csizmar, C. M., Woldring, D. R., Wagner, C. R., Hackel, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Titratable+avidity+reduction+enhances+affinity+discrimination+in+mammalian+cellular+selections+of+yeast-displayed+ligands%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Comb+Sci%22%5BJournal%5D)">Titratable avidity reduction enhances affinity discrimination in mammalian cellular selections of yeast-displayed ligands.</a> ACS Comb Sci. 19 (5), 315-323 (2017).</li>
<li>Waldman, A. C., Rao, B. M., Keung, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+the+residue+specificities+of+epigenome+enzymes+by+yeast+surface+display%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Mapping the residue specificities of epigenome enzymes by yeast surface display.</a> Cell Chem Biol. 28 (12), 1772-1779.e4 (2021).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>1 Lメディアボトル&nbsp;</td><td>Corning</td><td>06-414-1D</td><td></td></tr><tr><td>1.7/2.0 mL マイクロチューブ</td><td>Axygen</td><td>MCT-175-C</td><td></td></tr><tr><td>10 & micro;L SureOne ピペットチップ</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>02-707-438</td><td></td></tr><tr><td>1000 & micro;L SureOne ピペットチップ</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-707-408</td><td></td></tr><tr><td>12 mL ポリスチレン丸底チューブ</td><td>Greiner</td><td>07-000-212</td><td></td></tr><tr><td>3 mL プラティックキュベット</td><td>ブランド</td><td>759076D</td><td></td></tr><tr><td>300 & micro;L SureOne ピペットチップ</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-707-411</td><td></td></tr><tr><td>5 mL 血清ピペット</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-11D</td><td></td></tr><tr><td>酸性カゼイン (カサミノ酸)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP-1424-500</td><td></td></tr><tr><td>分析天びん&nbsp;</td><td>メトラー・トレド30243397</td><td></td><td></td></tr>細菌<tr><td>学用ペトリ皿&nbsp;</td><td>Corning</td><td>Falcon 351008</td><td></td></tr><tr><td>バイオセーフティキャビネット</td><td>Labconco</td><td>Logic Class II, Type A2&nbsp; 302310102</td><td></td></tr><tr><td>Biospectrometer</td><td>Eppendorf</td><td>Kinetic 6136000010</td><td></td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン</td><td>フィッシャーバイオ試薬</td><td>BP1600-100</td><td></td></tr><tr><td>クエン酸</td><td>フィッシャー サイエンティフィック</td><td>A940-500</td><td></td></tr><tr><td>CytoFLEX フローサイトメトリーアナライザー&nbsp;</td><td>Beckam Coulter</td><td>Cytoflex C09745</td><td>CytExpert ソフトウェア</td></tr><tr><td>Dextrose</td><td>Fisher Scientific</td><td>D16-1</td><td></td></tr><tr><td>ジチオスレイトール</td><td>Fisher バイオ試薬</td><td>BP172-5</td><td></td></tr><tr><td>ロバ抗ヤギ FITC</td><td>Invitrogen</td><td>A16000</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Alfa Aesar</td><td>H56165.30</td><td></td></tr><tr><td>Ez-Link PEG4-NHS-Biotin</td><td>Thermo Scientific</td><td>A39259</td><td></td></tr><tr><td>冷凍EZ酵母形質転換IIキット&nbsp;</td><td>Zymo Research</td><td>T2001</td><td></td></tr><tr><td>ガラクトース</td><td>フィッシャー サイエンティフィック</td><td>BP656-500</td><td></td></tr><tr><td>汎用冷蔵庫</td><td>マーベル サイエンティフィ</td>ック <td>MS24RAS4RW</td><td></td></tr><tr><td>ヤギ抗 myc タグ抗体 &nbsp;</td><td>ベチル</td><td>A190-104A</td><td></td></tr><tr><td>ミクロチューブ遠心分離機&nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>5425 R 5406000313</td><td></td></tr><tr><td>ミニ低温冷蔵インキュベーター</td><td>Fisher Scientific</td><td>15-015-2632</td><td></td></tr><tr><td>マウス抗ホスホチロシン抗体 4G10</td><td>BioXcell</td><td>BE0194</td><td></td></tr><tr><td>パラフィルム M</td><td>Bemis</td><td>M PM999</td><td></td></tr><tr><td>リン酸緩衝生理食塩水&nbsp;</td><td>フィッシャーバイオ試薬</td><td>BP399-500</td><td></td></tr><tr><td>ピペットコントローラー&nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>easypet 3 4430000018</td><td></td></tr><tr><td>ラフィノース</td><td>Thermo Scientific</td><td>J21060-36</td><td></td></tr><tr><td>組換えヒト活性 SHP-2 タンパク質</td><td>R&D Systems</td><td>1894-SH</td><td></td></tr><tr><td>冷蔵遠心分離機&nbsp;</td><td>エッペンドルフ</td><td>5910 R</td><td></td></tr><tr><td>サッカロミセス セレビシエ 酵母表面表示株 EBY 100</td><td>ATCC</td><td>MYA-4941</td><td></td></tr><tr><td>シェーカー インキュベーター</td><td>エッペンドルフ</td><td>M1335-0002 ニューブランズウィック イノーバ 42&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>シングルチャンネルピペットセット&nbsp;</td><td>エッペンドルフ</td><td>05-403-151</td><td></td></tr><tr><td>塩化ナトリウム</td><td>フィッシャーサイエンティフィ</td>ック <td>S671-500</td><td></td></tr><tr><td>クエン酸ナトリウム二水和物</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>S279-500</td><td></td></tr><tr><td>リン酸ナトリウム二塩基性七水和物</td>フィ<td>ッシャーサイエンティフィ</td>ック <td>S373-500</td><td></td></tr><tr><td>リン酸ナトリウム一塩基性一水和物</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>S468-500</td><td></td></tr><tr><td>ストレプトアビジン Alexa Fluor 647</td><td>Invitrogen</td><td>S32357</td><td></td></tr><tr><td>トップローディング天びん</td><td>メトラー トレド</td><td></td><td></td></tr><tr><td>トリス塩酸塩</td><td>EMD ミリポア</td><td>648317-100GM</td><td></td></tr><tr><td>チューブ リボルバー ローテーター</td><td>フィッシャー サイエンティフィック</td><td>11-676-341</td><td></td></tr><tr><td>計量ペーパー&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>09-898-12B</td><td></td></tr><tr><td>酵母窒素ベース</td><td>BD Difco</td><td>291940</td><td></td></tr><tr><td>ゼバ スピン脱塩カラム&nbsp;</td><td>サーモサイエンティ</td>フィック <td>89883</td><td></td></tr></tbody></table>

酵母表面表示タンパク質の酵素修飾およびフローサイトメトリー評価

Enzymatic Modification and Flow Cytometry Assessment of Yeast Surface Displayed Proteins

1,000 nM SHP-2 なし(図 1A)および(図 1B)の 1,000 nM SHP-2 を 2 時間インキュベートしたモデルシステムの個々の複製からのフローサイトメトリー解析では、リン酸化差の中央値は 63.6% であり、これは、表面に表示されたすべてのイベントからの Y 軸中央値(リン酸化)から、処理されたサンプルと未処理のコントロールとの間の非表示イベントの Y 軸中央値として定義されるベースラインリン酸化シグナルを差し引いた比として定義されますプロトコルのステップ 4.12 で定義されています。中央値を分析する前に、サンプルはサイズ(前方散乱)と複雑さ(側散乱)に基づいてゲート化され、健康な細胞グループを包含していました。定義された条件下では、サンプルの脱リン酸化は一目瞭然で区別できるはずです(図1C)。
このアッセイは、4つの主要な方法からなる簡単な手順で定義されます(<strong c...

Yeast surface display is a genotype-phenotype linkage strategy that empowers high-throughput screening of protein function. Traditionally, yeast surface ...

enzymatic-modification-flow-cytometry-assessment-yeast-surface

Research

JoVE Journal

Bioengineering

バイオエンジニアリング（生体工学）

劣化とリサイクルのための酵母の液胞の酸性内腔に細胞小器官の配信を監視するための堅牢なアプローチが説明されています。方法は、遺伝的に符号化されたデュアルエミッション蛍光のpHバイオセンサー、及び蛍光顕微鏡を使用して、個々の細胞の可視化とターゲットの細胞小器官の特定のラベルに依存しています。...

酵母でMitophagyを監視するための蛍光顕微鏡アッセイサッカロマイセスセレビシエ

分裂酵母の定量的なライブセル蛍光-顕微鏡解析

フローサイトメトリーおよび顕微鏡検査に基づいて、二つの相補的な方法は、酵母におけるMAPK経路の活性化によって誘導される遺伝子発現の動態を、単一細胞レベルで、定量化を可能にする提示されている。...

シングル酵母細胞中のMAPK誘導発現の時間的な定量

この記事では、タンパク質分解の遺伝的要件を決定するための酵母増殖ベースのアッセイについて説明します。また、ウェスタンブロッティングに適した酵母タンパク質の迅速な抽出方法を示し、分解要件を生化学的に確認します。これらの技術は、さまざまなタンパク質の分解を監視するために適応させることができます。...

増殖に基​​づく決定とタンパク質分解に対する遺伝的要件の生化学的確認で<em&gt;サッカロマイセス·セレビシエ</em

特定のタンパク質の役割や突然変異の影響について、しばしば重要な洞察を得ることができます。この論文では、定量的蛍光顕微鏡法とフローサイトメトリーを使用して、生細胞のエンドサイトーシスイベントを定量化するためのツールとして、pH感受性GFPバリアントである超黄道pHluorinを使用する方法を示します。...

出芽酵母におけるエンドサイトーシスの定量的、動力学的およびハイスループット分析のためのpHluorinの応用

本稿では、S.セレビシエ細胞とHEK293T細胞の両方でタンパク質自己集合を定量するFRETベースのフローサイトメトリープロトコルについて説明する。...

フローサイトメトリーによる生体内におけるタンパク質自己集合体の検出と特性特性

ここでは、分裂酵母を異種宿主として利用し、FtsZやMreBなどの細菌細胞骨格タンパク質をGFPとの翻訳融合タンパク質として発現させ、それらの重合を可視化します。また、重合に影響を与える化合物は、蛍光顕微鏡を用いたイメージングによって同定されます。...

細菌の細胞骨格タンパク質を標的とする抗菌薬スクリーニングのプラットフォームとしての分裂酵母

このプロトコールは、目的の抗原に結合するタンパク質変異体を濃縮するための酵母表面ディスプレイ選択キャンペーンを実施するための重要なステップを説明しています。...

酵母表面ディスプレイによるタンパク質工学

ここでは、酵母サンプルにおけるストレス後の生存を定量化するためのプロトコルを提示します。このアッセイでは、原形質膜の完全性を定量するために、SYTO 9 とヨウ化プロピジウム (PI) の 2...

酵母細胞におけるストレス後生存を定量化するためのフローサイトメトリーと組み合わせた最適化されたLIVE/DEADアッセイ

マルチスペクトルイメージングフローサイトメトリーによるナノ粒子と細菌の細胞内在化を分析する

学ぶ酵母表面表示タンパク質の酵素修飾とフローサイトメトリー評価。SHP-2チロシンホスファターゼの脱リン酸化活性を解析し、酵素基質相互作用の動態学的マッピングを可能にする革新的な手法です。

酵母表面表示タンパク質の酵素修飾およびフローサイトメトリー評価

さらに動画を探す