増殖に基​​づく決定とタンパク質分解に対する遺伝的要件の生化学的確認でサッカロマイセス·セレビシエ

次の実験の全体的な目標は、Croce Visierの不安定なタンパク質の分解のための遺伝的要件を迅速に決定することです。これは、特定の選択条件下での増殖に必要なレポーター酵素を目的の不安定なタンパク質に融合させることによって達成されます。次に、融合タンパク質を発現する野生型または変異型細胞の両方を、選択的な培地寒天プレート上で培養します。

このプレーティングアッセイは、酵母細胞の増殖に基づくタンパク質の安定化の便利な指標を提供し、タンパク質の存在量の違いを生化学的に確認すると同時に、融合タンパク質を保有する変異細胞のタイプをウェスタンブロット分析のための迅速で非効率的なタンパク質抽出法で溶解します。その結果、分解に必要な遺伝子に変異がある細胞では、不安定なタンパク質の存在量が増加することが示されています。逆に、分解能力のある野生型株には当てはまります。

パルスチェイス解析やサイクハイデチェイス解析などの既存の方法と比較した場合、この手法の主な利点は、労働集約的で時間がかからず、タンパク質分解の遺伝的要件を迅速かつ高スループットで決定できることです。しかし、この方法では、さまざまな不安定なタンパク質の分解要件に関する洞察を得ることができます。また、転写や翻訳など、遺伝子発現の他の側面の調節因子を特定するためにも使用できます。

手順を実演するのは、シェルドン・ワッツとジャスティン・クラウダーです。私の研究室の学生は、アッセイに先立って、不安定なタンパク質と代謝レポーター酵素からなる融合タンパク質をコードするプラスミドを変異酵母株に変換します。コントロールとしてタンパク質分解の制御に関する遺伝的欠陥が疑われる場合、同じプラスミドを野生型酵母株に形質転換する。

形質転換体を、プラスミド分子を保有する細胞を選択する最小培地の5ミリリットルに接種します。試験管を傾斜したローテーターに入れ、翌日に摂氏30度で一晩インキュベートします。一晩培養した培養液の光学密度を測定し、新鮮な培地と滅菌済みの個々の1.5ミリリットル遠心分離管で各培養物をOD 600 0.2に希釈することにより、すべての細胞の細胞濃度を均等化します。

メインアッセイを開始するには、まず、OD 600 0.2 の 0.2 から開始して、各予め希釈された株の 200 マイクロリットルを滅菌 96 ウェルプレートの指定ウェルに移し、その後の希釈に備えて 6 倍希釈シリーズマトリックスを設定し、マルチチャンネルピペットを使用して 125 マイクロリットルの滅菌水を列 2 の空のウェルに追加します。 3つ、そして4つ。次に、25マイクロリットルの酵母をカラム1からカラム2に移し、ピペットを数回上下させて細胞を均一に混合し、カラム2からカラム3に25マイクロリットルの細胞を移します。カラム4のウェルが細胞スポッティングの視覚的補助として十分に混合されるまで、連続希釈ステップを繰り返します。

グリッドテンプレートを印刷し、ペトリ皿の蓋の内側にテープで貼り付けます(段階希釈マトリックスの最も低濃度のカラムから順に)。各カラムから4マイクロリットルの細胞を移します。96ウェルプレート上で、細胞内プラスミドの維持を選択するコントロール最小培地寒天プレートに 各カラムからさらに4マイクロリットルの細胞を、両方の細胞内プラスミドを選択する別々の最小培地寒天プレートにスポットします。

不安定な融合タンパク質の維持と発現。両方のプレートをベンチで5〜10分間乾燥させます。脱水症状を防ぐために蓋をパラムで密封し、細胞を摂氏30度で2〜6日間インキュベートします。

最も急速に成長している培養物のコロニーが、特定のプレートの最も希薄な場所に最初に見えるようになったら、プレートをインキュベーターから取り出し、成長の程度を記録します。写真を撮ることで、異なる日に異なるプレートを撮影したり、同じプレートを複数の日に撮影したりする必要がある場合があります。増殖速度の範囲が広い異なる酵母株の場合、生化学的に確認された成長アッセイで同定された遺伝子がタンパク質の存在量を調節していることを生化学的に確認した野生型および変異酵母株を前述の融合タンパク質をコードするプラスミドで形質転換し、細胞内プラスミドの維持を選択する最小培地5ミリリットルで形質転換体を接種し、チューブを摂氏30度の傾斜回転子で一晩インキュベートします。

翌日、各一晩の培養物の600で光学密度を測定します。すべての菌株が0.4以上のOD 600に達したら、各菌株の最終容量が10ミリリットルになるように、すべての培養物を新鮮な培地で0.2に希釈します。すべての培養物が中期対数期成長OD 600(0.8〜1.2)に達するまで、摂氏30度のプラットフォームシェーカーで細胞をインキュベー

合計2.5個のOD単位の細胞を新鮮な15ミリリットルの円錐管に移すことにより、細胞を採取します。細胞を室温で5分間遠心分離し、S上清を除去します。次に、1ミリリットルの蒸留水ボルテックスまたはピペットを上下に追加して口蓋を再懸濁し、細胞懸濁液を新鮮な1.5ミリリットルのチューブに移します。

室温で30秒間の2回目の遠心分離で細胞を分離し、スナットを取り外し、細胞を100マイクロリットルの蒸留水に再懸濁します。細胞懸濁液に100マイクロリットルの0.2モル水酸化ナトリウムを加え、数回上下にピペットでサンプルを混合し、室温で5分間インキュベートして、早期の細胞溶解を避ける。セルをボルテックスしないでください。

3回目の遠心分離で30秒間、細胞を再度単離します。室温で、細胞から上清を取り除き、ペレットを50〜100マイクロリットルの1×ランビーサンプルバッファーに懸濁させて細胞を溶解し、懸濁液を摂氏95度で5分間インキュベートすることによりすべてのタンパク質を変性させ、次いで全細胞ライセートを氷上で5分間冷却する。複数の膜貫通セグメントを持つタンパク質など、凝集しやすいタンパク質の存在量をアッセイするために、摂氏95度で5分間ではなく、摂氏70度で10分間開始することにより、最適な変性インキュベーション、温度、および時間を経験的に決定します。

最後に、ライセートを室温で1分間遠心分離して可溶性画分を単離し、スナットを新しいチューブに移し、不溶性ペレット画分を廃棄します。可溶性画分は、SDSページやゲルに直接ロードしたり、酵母増殖ベースのタンパク質分解アッセイを設定する際にマイナス20°Cで保存することができます。不安定な三重融合タンパク質は、同じ代謝遺伝子を欠く酵母株の背景を補完する追加の代謝酵素と融合しています。

融合タンパク質が酵母で発現すると、小胞体膜で不毛の転座イベントが発生しやすくなります。この異常な転座は、代謝酵素を含むタンパク質全体のユビキチンを介した分解を引き起こし、細胞増殖を防ぎます。しかし、ユビキチンリガーゼを欠く酵母株では、融合タンパク質は分解から保護され、細胞の増殖を可能にする平均的な転座でも保護されます。

したがって、ユビキチンリガーゼの存在下では、細胞内で起こるタンパク質分解と、代謝物が枯渇した寒天プレート上で酵母細胞が増殖しないこととの間には対応関係があります。一方、ユビキチンリガーゼ細胞増殖に欠陥があるか、または存在しない状況では、融合タンパク質がバックグラウンドまたは偽の増殖を減少させ、このアッセイのストリンジェンシーを高めるために分解から保護されていたことを示しています。代謝酵素の競合阻害剤を増殖培地に添加して、酵母増殖アッセイで観察された結果を確認することができます。

融合タンパク質の分解の直接的な証拠は、ウェスタンブロットでも確認することができます。ユビキチンリガーゼの存在下または非存在下では、融合タンパク質はそれぞれ分解されるか、または破壊を免れます。これらの手順は、目的のタンパク質の定常状態の存在量に最も直接的に報告することを覚えておくことが重要です。

これらの手順を実施した後、パルスまたはシクロヘキシミドチェイス分析を実施して、タンパク質分解速度論および研究状態のタンパク質レベルを増加させることが判明した突然変異の存在を直接分析することができます。