負傷したゼブラフィッシュ幼生における持続性 緑膿菌 感染のモデル化

緑膿菌によって引き起こされる慢性感染症は抗生物質に耐性があり、治療が非常に困難です。私たちの目的は、効率的な治療法の発見を加速する in vivo モデルを開発することです。抗菌薬は主にin vitroでスクリーニングされ、慢性感染マウスでの薬剤の試験は複雑な課題です。これら2つのアプローチの間のギャップを埋めるために、負傷したゼブラフィッシュの幼虫を使用した代替の前臨床モデルを提案します。緑膿菌の臨床株の使用に基づくゼブラフィッシュの持続感染のモデルは、抗生物質耐性を再現します。マイクロインジェクションはゼブラフィッシュの幼虫に感染するために一般的に使用されていますが、私たちの創傷方法は自然な感染モードを反映しており、治療用化合物のスクリーニングに適しています。

[ナレーター]まず、取り扱いを容易にするために、25 本の箸の上に 2 ゲージの針を置きます。実体顕微鏡を使用して、異常な発育を示す胚や生存不能な胚を特定して除去します。皿を円を描くように動かして、残りの胚を中央に集めます。次に、垂直方向の 2 本の針を使用して各胚を分離し、左の針を尾に配置して体をまっすぐに保ちます。正しい針で、脊索の端に1つの切り込みを入れてヒレを取り除きます。各切断を迅速に完了し、すべての胚が 10 分以内に細菌溶液に浸されるようにします。感染手順では、緑膿菌溶液をタイプ2の生物学的安全キャビネットの下でボルテックスし、1ミリリットルあたり7コロニー形成単位の約10乗で6ウェルプレートに加えます。使い捨てのガラス製パスツールピペットを使用して、傷ついた胚を収集し、細菌溶液に移します。6ウェルプレートを摂氏28度で1.5時間インキュベートします。インキュベーション後、感染した胚を回収し、洗浄のために微生物学的安全性の下に置きます。次に、ガラスピペットで胚をメチレンブルーを含まない10ミリリットルの魚水に移し、移送量を最小限に抑え、室温で30分間インキュベートします。次に、ガラスピペットで胚をメチレンブルーを含まない4ミリリットルの魚水に再度移し、短時間インキュベートします。次に、ピペットを使用して、感染した胚を個別に24ウェルプレートに移し、各ウェルにメチレンブルーを含まない1ミリリットルの魚水を加えます。24ウェルプレートを摂氏28度に設定したインキュベーターに入れます。感染した幼虫ごとに95マイクロリットルの1X PBSを含む1.5ミリリットルの微量遠心チューブを準備します。幼虫をメチレンブルーを含まない4ミリリットルの魚水を含む6ウェルプレートに移し、浮遊菌を洗浄して除去します。洗浄した各胚をPBSを含む微量遠心チューブに入れ、できるだけ少ない液体を移します。次に、乳棒を使用して各胚を微量遠心分離管の側面に押し付け、その後乳棒をチューブ内に残します。次に、乳棒を持ち上げ、100マイクロリットルの2%PBSトリトンを加えて乳棒から残留細菌を洗い流し、最終濃度1%を達成します。チューブをボルテックスし、10分間インキュベートします。次に、各胚から10マイクロリットルの原液ライセートをLB寒天プレートに3滴分注します。マルチチャンネルピペットを使用して、96ウェルプレート内の各ライセートを10までの希釈をマイナス3乗まで連続的に希釈します。最後に、原液のスポットの隣に10マイクロリットルの希釈液を3滴注ぎます。そして摂氏37度で一晩インキュベートします。4つの嚢胞性線維症緑膿菌分離株はすべて、PAO1参照株と比較して、損傷した胚モデルで有意に毒性が低かった。2つの分離株に感染した胚では、細菌量が3日間で著しく減少し、細菌の除去を示しました。対照的に、他の2つの分離株、B6513とRP73は、最初の低下後、感染後18時間から65時間まで比較的安定した細菌量を維持し、持続性を示唆しました。感染後1.5時間にトブラマイシンによる30分間の短い治療により、分離株B6513に感染した胚の細菌負荷が大幅に減少しました。トブラマイシンは、感染後24時間または48時間に投与した場合、細菌量に有意な影響を及ぼさず、持続的な感染段階で耐性を示しました。