エレクトロポレーション閾値を定量化するためのハイスループット対応3次元組織モデル

私たちの研究は、がんを治療するためにエレクトロポレーション、特にバイポーラマイクロ秒パルスを使用することに焦点を当てています。現在、軟部組織のアブレーションを検討していますが、これらのパルスを使用した in vivo トランスフェクションにも移行する予定です。私たちのプロトコルは、実際に、不可逆的および可逆的なエレクトロポレーション閾値をより効率的に表示することを可能にします。

また、2D 環境ではなく 3D で見ることができるため、立方体ベースのシステムよりも少し優れている可能性があります。そして、3D環境は、私たちが組織で見るものとはるかに似ています。将来的には、このモデルで見られるものをin vivoで翻訳しようとすることを検討し、このモデルが実際に行っていることは、DNAワクチン、化学療法、CRISPR-Cas9システムなどを送達しようとするときに行うパラメーターの選択を知らせることです。

まず、細胞懸濁液と必要な試薬をバイオセーフティキャビネットに入れます。調製した細胞懸濁液を1型ウシコラーゲン溶液と1:1の比率で完全に混合します。早期重合を防ぐために、混合物を氷上または冷たいビーズ浴に入れます。

次に、500マイクロリットルの混合溶液をピペットでピペットで取り込み、12ウェルプレートの各ウェルの底をコーティングします。プレートをゆっくりと回転させて、ゲルが各ウェルの壁に接触するようにします。摂氏37度に設定した加湿インキュベーターで、5%二酸化炭素を含む6時間、またはゲルが固まるまでゲルをインキュベートします。

次に、ウェルプレートを傾け、各ウェルに500マイクロリットルの培地をそっと加え、プレートの壁を滑り落ちさせます。2 本の 1.64 ミリメートル 304 ステンレス鋼の鈍い先端シリンジ針からプラスチック製のルアー接続を取り外します。ピン電極として機能する針を1本脇に置きます。

もう一方の針については、一方の端の最後の5ミリメートルを平らにします。次に、ウェルプレートの底と同じ高さに収まるのに十分な長さの直径19mmの316ステンレス鋼チューブのセクションを切断して、リング電極を作成します。CADソフトウェアを使用して、電極コンポーネントに適合する電極ホルダーを設計します。

リング電極とピン電極を電極ホルダーに取り付けて電極を組み立て、端を平らにした針をホルダーに圧入してリング電極を固定します。バイオセーフティキャビネットで、準備したプレートを傾け、各ウェルから400マイクロリットルの培地を吸引します。吸引ウェルに5マイクログラムの5マイクログラムの20マイクロリットルを加えます。

プレートをゆっくりと回転させて、溶液がゲル表面全体に均一に広がるようにします。摂氏37度に設定した加湿インキュベーターで、5%二酸化炭素を含む10分間ゲルをインキュベートします。次に、光ファイバー温度プローブをピン電極に挿入し、温度の記録を開始します。

エレクトロポレーターのプラスリード線をピン電極に接続し、マイナスリード線を針に接続して、リング電極を固定します。次に、ホットプレートの電源を入れ、ゲルを加熱して摂氏37度の温度を維持します。次に、組み立てたリングとピン電極を温度プローブでウェルに挿入し、ゲルが摂氏 37 度の温度に達していることを確認します。

エレクトロポレーターを作動させて治療を行います。次に、乾燥しているように見えるゲルに100マイクロリットルの培地を加え、未処理のゲルの電気操作を続けます。すべての処理が完了したら、ゲルを摂氏37度の加湿インキュベーターで5%二酸化炭素で10分間インキュベートします。

インキュベーション後、プレートの壁に沿って各ウェルに500マイクロリットルの培地をそっと加えます。加湿インキュベーターでゲルを再び24時間インキュベートします。プレートを傾け、各ウェルから培地を吸引します。

次に、プレートの壁に沿って各ウェルに500マイクロリットルのPBSをそっと加えます。ゲルを摂氏37度の加湿インキュベーターで5%二酸化炭素とともに5分間インキュベートします。次に、各ウェルからPBSを吸引します。

500マイクロリットルのPBSをプレートの壁をスライドさせて、各ウェルにそっと加えます。プレートをゆっくりと回転させてから、傾けて各ウェルからPBSを吸引します。次に、各ウェルに100マイクロリットルの新鮮なPBSを加えて、イメージングのためにゲルを水和状態に保ちます。

次に、標準的な蛍光顕微鏡技術を使用してプレートを画像化します。イメージング後、プレートの各ウェルに500マイクロリットルの培地を加え、24時間インキュベートします。指定された時点ごとに、完全なイメージングと回復のワークフローを繰り返します。

計算モデルを作成したら、顕微鏡ソフトウェアを使用して、垂直軸と水平軸に沿ったトーラス形状の領域の外縁と内縁の両方の直径を測定します。外径と内径をそれぞれ平均し、2で割って対応する半径を計算します。最後に、前に作成したルックアップテーブルを使用して、測定された半径での電界強度を導き出します。

トランスフェクト領域の外側の半径を使用して、可逆的エレクトロポレーションまたはRE閾値を計算モデルからの電界強度と相関させることにより定量化しました。一方、内半径は不可逆的なエレクトロポレーションまたはIRE閾値を決定するために使用されました。3つのバイポーラマイクロ秒パルスプロトコルはすべて、REおよびIRE境界がはっきりと見えるトーラス形状のトランスフェクション領域をもたらしました。

テストされた波形の中で、2-1-1バーストバランス波形は最も高いIREしきい値を生成し、2-1-1アンバランス波形は最も低かった。420ボルトを使用した標準的なモノポーラエレクトロポレーションプロトコルでは、RE閾値が642ボルト/センチメートルの円形トランスフェクション領域が得られましたが、細胞死を生じさせず、IRE閾値の決定が妨げられました。ゲル分解による時間の経過に伴う組織の変形により、トランスフェクト領域が円形を失い、正確なREおよびIREの定量が困難になりました。

リング電極とピン電極とウェルの底との位置がずれていると、非対称の非円形トランスフェクションパターンも生成され、閾値測定が複雑になりました。