エレクトロポレーション閾値を定量化するためのハイスループット対応3次元組織モデル
August 19th, 2025
このプロトコルは、エレクトロポレーションプロトコルのハイスループット分析のために、3次元組織模倣内のトランスフェクトされた細胞の空間分布を使用して、計算モデリングを使用して可逆的および不可逆的なエレクトロポレーション閾値を定量化します。
私たちの研究は、がんを治療するためにエレクトロポレーション、特にバイポーラマイクロ秒パルスを使用することに焦点を当てています。現在、軟部組織のアブレーションを検討していますが、これらのパルスを使用した in vivo トランスフェクションにも移行する予定です。私たちのプロトコルは、実際に、不可逆的および可逆的なエレクトロポレーション閾値をより効率的に表示することを可能にします。
また、2D 環境ではなく 3D で見ることができるため、立方体ベースのシステムよりも少し優れている可能性があります。そして、3D環境は、私たちが組織で見るものとはるかに似ています。将来的には、このモデルで見られるものをin vivoで翻訳しようとすることを検討し、このモデルが実際に行っていることは、DNAワクチン、化学療法、CRISPR-Cas9システムなどを送達しようとするときに行うパラメーターの選択を知らせることです。
まず、細胞懸濁液と必要な試薬をバイオセーフティキャビネットに入れます。調製した細胞懸濁液を1型ウシコラーゲン溶液と1:1の比率で完全に混合します。早期重合を防ぐために、混合物を氷上または冷たいビーズ浴に入れます。
次に、500マイクロリットルの混合溶液をピペットでピペットで取り込み、12ウェルプレートの各ウェルの底をコーティングします。プレートをゆっくりと回転させて、ゲルが各ウェルの壁に接触するようにします。摂氏37度に設定した加湿インキュベーターで、5%二酸化炭素を含む6時間、またはゲルが固まるまでゲルをインキュベートします。
次に、ウェルプレートを傾け、各ウェルに500マイクロリットルの培地をそっと加え、プレートの壁を滑り落ちさせます。2 本の 1.64 ミリメートル 304 ステンレス鋼の鈍い先端シリンジ針からプラスチック製のルアー接続を取り外します。ピン電極として機能する針を1本脇に置きます。
もう一方の針については、一方の端の最後の5ミリメートルを平らにします。次に、ウェルプレートの底と同じ高さに収まるのに十分な長さの直径19mmの316ステンレス鋼チューブのセクションを切断して、リング電極を作成します。CADソフトウェアを使用して、電極コンポーネントに適合する電極ホルダーを設計します。
リング電極とピン電極を電極ホルダーに取り付けて電極を組み立て、端を平らにした針をホルダーに圧入してリング電極を固定します。バイオセーフティキャビネットで、準備したプレートを傾け、各ウェルから400マイクロリットルの培地を吸引します。吸引ウェルに5マイクログラムの5マイクログラムの20マイクロリットルを加えます。
プレートをゆっくりと回転させて、溶液がゲル表面全体に均一に広がるようにします。摂氏37度に設定した加湿インキュベーターで、5%二酸化炭素を含む10分間ゲルをインキュベートします。次に、光ファイバー温度プローブをピン電極に挿入し、温度の記録を開始します。
エレクトロポレーターのプラスリード線をピン電極に接続し、マイナスリード線を針に接続して、リング電極を固定します。次に、ホットプレートの電源を入れ、ゲルを加熱して摂氏37度の温度を維持します。次に、組み立てたリングとピン電極を温度プローブでウェルに挿入し、ゲルが摂氏 37 度の温度に達していることを確認します。
エレクトロポレーターを作動させて治療を行います。次に、乾燥しているように見えるゲルに100マイクロリットルの培地を加え、未処理のゲルの電気操作を続けます。すべての処理が完了したら、ゲルを摂氏37度の加湿インキュベーターで5%二酸化炭素で10分間インキュベートします。
インキュベーション後、プレートの壁に沿って各ウェルに500マイクロリットルの培地をそっと加えます。加湿インキュベーターでゲルを再び24時間インキュベートします。プレートを傾け、各ウェルから培地を吸引します。
次に、プレートの壁に沿って各ウェルに500マイクロリットルのPBSをそっと加えます。ゲルを摂氏37度の加湿インキュベーターで5%二酸化炭素とともに5分間インキュベートします。次に、各ウェルからPBSを吸引します。
500マイクロリットルのPBSをプレートの壁をスライドさせて、各ウェルにそっと加えます。プレートをゆっくりと回転させてから、傾けて各ウェルからPBSを吸引します。次に、各ウェルに100マイクロリットルの新鮮なPBSを加えて、イメージングのためにゲルを水和状態に保ちます。
次に、標準的な蛍光顕微鏡技術を使用してプレートを画像化します。イメージング後、プレートの各ウェルに500マイクロリットルの培地を加え、24時間インキュベートします。指定された時点ごとに、完全なイメージングと回復のワークフローを繰り返します。
計算モデルを作成したら、顕微鏡ソフトウェアを使用して、垂直軸と水平軸に沿ったトーラス形状の領域の外縁と内縁の両方の直径を測定します。外径と内径をそれぞれ平均し、2で割って対応する半径を計算します。最後に、前に作成したルックアップテーブルを使用して、測定された半径での電界強度を導き出します。
トランスフェクト領域の外側の半径を使用して、可逆的エレクトロポレーションまたはRE閾値を計算モデルからの電界強度と相関させることにより定量化しました。一方、内半径は不可逆的なエレクトロポレーションまたはIRE閾値を決定するために使用されました。3つのバイポーラマイクロ秒パルスプロトコルはすべて、REおよびIRE境界がはっきりと見えるトーラス形状のトランスフェクション領域をもたらしました。
テストされた波形の中で、2-1-1バーストバランス波形は最も高いIREしきい値を生成し、2-1-1アンバランス波形は最も低かった。420ボルトを使用した標準的なモノポーラエレクトロポレーションプロトコルでは、RE閾値が642ボルト/センチメートルの円形トランスフェクション領域が得られましたが、細胞死を生じさせず、IRE閾値の決定が妨げられました。ゲル分解による時間の経過に伴う組織の変形により、トランスフェクト領域が円形を失い、正確なREおよびIREの定量が困難になりました。
リング電極とピン電極とウェルの底との位置がずれていると、非対称の非円形トランスフェクションパターンも生成され、閾値測定が複雑になりました。
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概要
このプロトコルは、高スループット分析のための電ポアレーションプロトコルにおける、三次元組織ミミック内のトランスフェクト細胞の空間分布を用いた、可逆および不可逆電ポアレーションしきい値を定量化するために計算モデリングを使用します。
主要な研究構成要素
科学の分野
- 電ポアレーション
- 計算モデリング
- 組織工学
背景
- 電ポアレーションは細胞膜の透過性を高めるために使用される技術です。
- 電ポアレーションしきい値を理解することは、トランスフェクション効率を最適化するために重要です。
- 三次元組織ミミックは、生物学的システムのより正確な表現を提供できます。
- 高スループット分析により、様々な電ポアレーションプロトコルの迅速な評価が可能になります。
研究の目的
- 管理された環境で電ポアレーションしきい値を定量化する。
- 細胞トランスフェクションダイナミクスの理解を向上させる。
- より効果的な電ポアレーションプロトコルの開発を促進する。
使用された方法
- 電ポアレーションをシミュレートするための計算モデリング技術。
- トランスフェクト細胞の空間分布の分析。
- 実験検証のための三次元組織ミミックの使用。
- 電ポアレーション条件の高スループットスクリーニング。
主要な結果
- 可逆および不可逆電ポアレーションの特定のしきい値の特定。
- 計算モデルの有効性の実証。
- トランスフェクト細胞の空間分布に関する洞察。
- 調査結果に基づく電ポアレーションプロトコルの最適化の推奨。
結論
- この研究は電ポアレーションしきい値を理解するための枠組みを提供します。
- 計算モデリングは実験設計を大幅に向上させることができます。
- 将来の研究は、これらの発見を基にトランスフェクション方法を改善することができます。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Quantifying electroporation thresholds in a high-throughput, three-dimensional tissue model addresses a critical bottleneck in optimizing macromolecule delivery for therapeutic development. This approach enhances predictive confidence for in vivo translation and accelerates protocol refinement for gene delivery and tissue ablation strategies. The model's efficiency and physiological relevance support risk-adjusted advancement decisions across discovery and preclinical pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables systematic interrogation of electroporation parameters for biological de-risking.
- Supports functional validation of delivery mechanisms in physiologically relevant 3D systems.
- Facilitates predictive assessment of protocol efficacy for target engagement.
Screening & Assay Development
- Provides a high-throughput platform for rapid evaluation of electroporation conditions.
- Delivers quantitative, reproducible readouts of transfection efficiency and cell viability.
- Standardizes assay conditions for downstream screening and protocol optimization.
Translational & Preclinical Research
- Aligns in vitro findings with in vivo relevance through 3D tissue mimicry.
- Enables risk-adjusted selection of electroporation protocols for preclinical validation.
- Supports translational continuity by modeling tissue-level responses to electrical fields.
Pipeline & Workflow Integration
This 3D tissue model integrates into the discovery-to-preclinical continuum by enabling robust hypothesis testing and protocol optimization for electroporation-based delivery systems.
- Discovery Biology: Quantifies reversible and irreversible electroporation thresholds to clarify delivery mechanisms.
- Screening: Offers high-throughput, reproducible assessment of protocol parameters and outcomes.
- Analytics: Provides spatially resolved, quantitative measurements of transfected cell populations.
- Translational Research: Bridges in vitro and in vivo protocol performance through physiologically relevant modeling.
- Enterprise Reuse: Establishes a scalable platform for ongoing protocol development and cross-program standardization.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in delivery optimization.
- Operational Value: Enhances throughput, reproducibility, and standardization of electroporation protocol assessment.
- Strategic Value: Supports efficient go/no-go decisions and reduces late-stage biological risk.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of delivery strategies across therapeutic programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in 3D tissue culture and electroporation instrumentation.
- Demands access to quantitative imaging and analytical infrastructure for spatial analysis.
- Benefits from standardized protocols for cross-team reproducibility.
- Adaptable to various cell types and tissue mimics with protocol-specific adjustments.
- Limitations may include model-specific constraints on tissue complexity and scalability.
