Name: エレクトロポレーション閾値を定量化するためのハイスループット対応3次元組織モデル (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-08-19T13:20:00.000+00:00
Duration: 8 min 23 s
Description: 学ぶ 電気穿孔の可逆・不可逆閾値を3次元組織モデルと計算モデリングで定量化する方法。ハイスループット解析により細胞膜透過性の最適化と遺伝子導入効率の向上を実現します。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

<table><tbody><tr><td>0.25%トリプシン-EDTA</td><td>ギブコ</td><td>25200056</td><td></td></tr><tr><td>1000 uLピペットチップ</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>13-811-164</td><td></td></tr><tr><td>15 mLコニカルチューブ</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>14-959-70C</td><td></td></tr><tr><td>200 uLピペットチップ</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>13-811-139</td><td></td></tr><tr><td>304ステンレス鋼の鈍い先端針</td><td>マクマスター・カー</td><td>75165A753</td><td></td></tr><tr><td>316ステンレス鋼チューブ</td><td>マクマスター・カー</td><td>89785K319</td><td></td></tr><tr><td>アクリル</td><td>マクマスター・カー</td><td>8505K754</td><td></td></tr><tr><td>バイオセーフティキャビネット</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>13-261-312</td><td></td></tr><tr><td>CADソフトウェア</td><td>ダッソーシステムズ</td><td>ソリッドワークス</td><td></td></tr><tr><td>遠心機</td><td>ヌエア</td><td>NU-C200R型</td><td></td></tr><tr><td>エレクトロポレーター</td><td>Hbio</td><td>45-0662</td><td>この研究では、カスタムビルドのデバイスと BTX ECM 830 システムが使用されました</td></tr><tr><td>エメム</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>MT10009CV</td><td>これは異なる場合があります&nbsp;HEK293以外の細胞株を使用している場合</td></tr><tr><td>Falcon 12ウェルクリアフラットボトムTC処理マルチウェル細胞培養プレート、蓋付き</td><td>コーニング</td><td>353043</td><td>任意の12ウェルプレートを使用できますが、電極ホルダーを製造する際にウェルの寸法が考慮されていることを確認してください。</td></tr><tr><td>FBSの</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>A5670701</td><td></td></tr><tr><td>光ファイバー温度プローブ</td><td>マイクロノール株式会社</td><td>TS5-20MM-02</td><td></td></tr><tr><td>GFP-プラスミド</td><td>アルデベロン</td><td>gWiz-GFP</td><td></td></tr><tr><td>HEK293細胞</td><td>ATCCの</td><td>CRL-1573</td><td>他の細胞株を使用することもできますが、正しい培地が使用されていることを確認してください</td></tr><tr><td>ホットプレート</td><td>熱電冷却アメリカコーポレーション</td><td>AHP-301CPV</td><td></td></tr><tr><td>氷または冷蔵ビーズバス</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>10-876-001</td><td></td></tr><tr><td>画像解析ソフトウェア</td><td>ライカ</td><td>ラスエックス</td><td></td></tr><tr><td>孵卵器</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>15-015-2633</td><td></td></tr><tr><td>倒立蛍光顕微鏡</td><td>ライカ</td><td>DMi8</td><td></td></tr><tr><td>レーザーカッター</td><td>マクマスター・カー</td><td>7344N11</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン-ストレプトマイシン</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>ピペットキット</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>14-388-100</td><td></td></tr><tr><td>シミュレーションソフトウェア</td><td>コンソル</td><td>COMSOL マルチフィジックス 6.2</td><td></td></tr><tr><td>T75フラスコ</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>156499</td><td></td></tr><tr><td>I型ウシコラーゲン溶液</td><td>高度なバイオマトリックス</td><td>5005</td><td>3 mg/mL</td></tr></tbody></table>

エレクトロポレーション閾値を定量化するためのハイスループット対応3次元組織モデル

High-Throughput Capable Three-Dimensional Tissue Model for Quantification of Electroporation Thresholds

リングとピンの電極は、緑色蛍光タンパク質(GFP)をコードするDNAプラスミドを、HEK293細胞が埋め込まれた3Dコラーゲン組織模倣物に送達することに成功しました。図 2 に示すように、トランスフェクト領域の外側半径を測定し、実験セットアップの計算モデルから対応する電界強度を導き出すことで、RE 閾値の定量化に成功しました。IRE閾値は、トランスフェクト領域の内径を測定することによって同様に定量化されました。図3A-Cは、バイポーラマイクロ秒PEFを使用した3つのプロトコルについて、結果として得られるREおよびIREのしきい値(それぞれ白と赤で概説)を示しています。プロトコルでは、「PND」表記を使用して、波形の正(P)と負(N)のパルス持続時間、およびこれら2つの成分間の遅延(D)を記述しました。各波形を複数回配信してバーストを作成し、約100μsのオンタイムを構成します(たとえば、...

Electroporation is a promising technology utilizing electrical pulses for macromolecule delivery and soft-tissue ablation, with applications that include ...

私たちの研究は、がんを治療するためにエレクトロポレーション、特にバイポーラマイクロ秒パルスを使用することに焦点を当てています。現在、軟部組織のアブレーションを検討していますが、これらのパルスを使用した in vivo トランスフェクションにも移行する予定です。私たちのプロトコルは、実際に、不可逆的および可逆的なエレクトロポレーション閾値をより効率的に表示することを可能にします。また、2D 環境ではなく 3D で見ることができるため、立方体ベースのシステムよりも少し優れている可能性があります。そして、3D環境は、私たちが組織で見るものとはるかに似ています。将来的には、このモデルで見られるものをin vivoで翻訳しようとすることを検討し、このモデルが実際に行っていることは、DNAワクチン、化学療法、CRISPR-Cas9システムなどを送達しようとするときに行うパラメーターの選択を知らせることです。まず、細胞懸濁液と必要な試薬をバイオセーフティキャビネットに入れます。調製した細胞懸濁液を1型ウシコラーゲン溶液と1:1の比率で完全に混合します。早期重合を防ぐために、混合物を氷上または冷たいビーズ浴に入れます。次に、500マイクロリットルの混合溶液をピペットでピペットで取り込み、12ウェルプレートの各ウェルの底をコーティングします。プレートをゆっくりと回転させて、ゲルが各ウェルの壁に接触するようにします。摂氏37度に設定した加湿インキュベーターで、5%二酸化炭素を含む6時間、またはゲルが固まるまでゲルをインキュベートします。次に、ウェルプレートを傾け、各ウェルに500マイクロリットルの培地をそっと加え、プレートの壁を滑り落ちさせます。2 本の 1.64 ミリメートル 304 ステンレス鋼の鈍い先端シリンジ針からプラスチック製のルアー接続を取り外します。ピン電極として機能する針を1本脇に置きます。もう一方の針については、一方の端の最後の5ミリメートルを平らにします。次に、ウェルプレートの底と同じ高さに収まるのに十分な長さの直径19mmの316ステンレス鋼チューブのセクションを切断して、リング電極を作成します。CADソフトウェアを使用して、電極コンポーネントに適合する電極ホルダーを設計します。リング電極とピン電極を電極ホルダーに取り付けて電極を組み立て、端を平らにした針をホルダーに圧入してリング電極を固定します。バイオセーフティキャビネットで、準備したプレートを傾け、各ウェルから400マイクロリットルの培地を吸引します。吸引ウェルに5マイクログラムの5マイクログラムの20マイクロリットルを加えます。プレートをゆっくりと回転させて、溶液がゲル表面全体に均一に広がるようにします。摂氏37度に設定した加湿インキュベーターで、5%二酸化炭素を含む10分間ゲルをインキュベートします。次に、光ファイバー温度プローブをピン電極に挿入し、温度の記録を開始します。エレクトロポレーターのプラスリード線をピン電極に接続し、マイナスリード線を針に接続して、リング電極を固定します。次に、ホットプレートの電源を入れ、ゲルを加熱して摂氏37度の温度を維持します。次に、組み立てたリングとピン電極を温度プローブでウェルに挿入し、ゲルが摂氏 37 度の温度に達していることを確認します。エレクトロポレーターを作動させて治療を行います。次に、乾燥しているように見えるゲルに100マイクロリットルの培地を加え、未処理のゲルの電気操作を続けます。すべての処理が完了したら、ゲルを摂氏37度の加湿インキュベーターで5%二酸化炭素で10分間インキュベートします。インキュベーション後、プレートの壁に沿って各ウェルに500マイクロリットルの培地をそっと加えます。加湿インキュベーターでゲルを再び24時間インキュベートします。プレートを傾け、各ウェルから培地を吸引します。次に、プレートの壁に沿って各ウェルに500マイクロリットルのPBSをそっと加えます。ゲルを摂氏37度の加湿インキュベーターで5%二酸化炭素とともに5分間インキュベートします。次に、各ウェルからPBSを吸引します。500マイクロリットルのPBSをプレートの壁をスライドさせて、各ウェルにそっと加えます。プレートをゆっくりと回転させてから、傾けて各ウェルからPBSを吸引します。次に、各ウェルに100マイクロリットルの新鮮なPBSを加えて、イメージングのためにゲルを水和状態に保ちます。次に、標準的な蛍光顕微鏡技術を使用してプレートを画像化します。イメージング後、プレートの各ウェルに500マイクロリットルの培地を加え、24時間インキュベートします。指定された時点ごとに、完全なイメージングと回復のワークフローを繰り返します。計算モデルを作成したら、顕微鏡ソフトウェアを使用して、垂直軸と水平軸に沿ったトーラス形状の領域の外縁と内縁の両方の直径を測定します。外径と内径をそれぞれ平均し、2で割って対応する半径を計算します。最後に、前に作成したルックアップテーブルを使用して、測定された半径での電界強度を導き出します。トランスフェクト領域の外側の半径を使用して、可逆的エレクトロポレーションまたはRE閾値を計算モデルからの電界強度と相関させることにより定量化しました。一方、内半径は不可逆的なエレクトロポレーションまたはIRE閾値を決定するために使用されました。3つのバイポーラマイクロ秒パルスプロトコルはすべて、REおよびIRE境界がはっきりと見えるトーラス形状のトランスフェクション領域をもたらしました。テストされた波形の中で、2-1-1バーストバランス波形は最も高いIREしきい値を生成し、2-1-1アンバランス波形は最も低かった。420ボルトを使用した標準的なモノポーラエレクトロポレーションプロトコルでは、RE閾値が642ボルト/センチメートルの円形トランスフェクション領域が得られましたが、細胞死を生じさせず、IRE閾値の決定が妨げられました。ゲル分解による時間の経過に伴う組織の変形により、トランスフェクト領域が円形を失い、正確なREおよびIREの定量が困難になりました。リング電極とピン電極とウェルの底との位置がずれていると、非対称の非円形トランスフェクションパターンも生成され、閾値測定が複雑になりました。

high-throughput-capable-three-dimensional-tissue-model-for

Research

JoVE Journal

Bioengineering

バイオエンジニアリング（生体工学）

発現とHEK - 293T細胞における組換え電位依存性イオンチャネルの電気生理学的記録用に最適化されたトランスフェクション戦略

マイクロ流体渦補助エレクトロポレーション·プラットフォームは、正確かつ独立した投与量制御を備え​​た同一の細胞集団への複数の分子の順次配信のために開発されました。分子の送達効率および加工細胞の生存率を向上させるために支援エレクトロポレーションの前に、システムのサイズベースの標的細胞精製工程。...

マイクロスケール渦アシストシーケンシャル分子送達用エレクトロポ

このプロトコルでは、ラボオンチップのマイクロ流体エレクトロポレーションデバイスを構築するために必要な微細加工技術について説明します。実験セットアップは、制御された単一細胞レベルのトランスフェクションを連続フローで実行し、集団ベースの制御により、より高いスループットに拡張することができます。細胞膜透過の程度をリアルタイムで電気的に監視する機能を示す分析が提供されます。...

透過処理検出機能付き連続フローマイクロエレクトロポレーションシステムの構築と運用

この研究では、3D脳腫瘍モデル、すなわち in vitro 培養、in ovo モデル、 およびin vivo...

膠芽腫のパルス電界治療のための柔軟な有機電子デバイス

多孔質基質エレクトロポレーション(PSEP)は、一貫したハイスループットデリバリーと高い細胞生存率を兼ね備えています。経上皮電気インピーダンス(TEEI)測定の導入により、PSEPの中間プロセスに関する洞察が得られ、ラベルフリーの送達が可能になります。この記事では、PSEP送達実験とTEEI測定解析を同時に行う方法について説明します。...

経上皮電気インピーダンスモニタリングによる多孔質基板ベースのエレクトロポレーション

遺伝子改変Tet-OnスパイキングHEK細胞におけるエレクトロポレーション誘発性活動電位生成の変化のモニタリング

ここでは、エレクトロポレーションによるスライスされたヒト皮質オルガノイドの急性遺伝子操作について紹介します。これらの皮質オルガノイドモデルは、スライス後に心室のような構造を容易に特定できるため、特に注射に適しており、ヒトの皮質発達、神経発達障害、および皮質進化の機能的研究を可能にします。...

遺伝子機能研究のためのスライスヒト皮質オルガノイドのエレクトロポレーション

エレクトロポレーションとは、パルス電界(PEF)を使用して細胞培養に一過性の細孔を作り、分子カーゴを導入することです。この技術は、最近、研究や臨床現場で広く使用されるようになりました。ここでは、最近開発された「エレクトロポレーションサイトメトリーシステム」を用いた、生細胞の蛍光顕微鏡法を用いたエレクトロポレーション技術について述べます。...

U2 OS細胞培養を用いた生細胞、蛍光顕微鏡法のためのエレクトロポレーションサイトメトリープロトリー

ここでは、上皮組織恒常性の電気機械的調節を研究するために、独自の2層マイクロ流体デバイスを製造するためのプロトコルを提示します。この装置は、組織面に垂直な静的な生理学的電流を印加し、細胞間の接着、増殖、および押し出しに影響を与えます。生細胞イメージングと機械的ストレス測定により、これらのプロセスのメカニズムが明らかになります。...

2層マイクロ流体デバイスを用いた組織恒常性の電気機械制御の解明

このプロトコルは、患者特異的な電場シミュレーションおよび脊髄転移のための電気化学療法(ECT)の完全かつ再現可能なワークフローを記述しています。ワークフローは、マルチモーダルイメージング、半自動および手動のセグメンテーション、組織伝導率モデリング、線形有限要素電場シミュレーション、そして術後のMRIに基づく壊死重複解析による実験的検証を統合しています。...

脊椎転移電気化学療法における患者特異的電場シミュレーション

学ぶ 電気穿孔の可逆・不可逆閾値を3次元組織モデルと計算モデリングで定量化する方法。ハイスループット解析により細胞膜透過性の最適化と遺伝子導入効率の向上を実現します。

エレクトロポレーション閾値を定量化するためのハイスループット対応3次元組織モデル

さらに動画を探す