Name: マイクロスケール渦アシストシーケンシャル分子送達用エレクトロポ (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-08-07T20:15:00.000+00:00
Duration: 10 min 51 s
Description: 学ぶマイクロスケール渦アシスト電気穿孔法による複数バイオ分子の逐次送達技術。高効率かつ細胞生存性を維持しながら、正確な用量制御で同一細胞集団への分子導入を実現する革新的プラットフォームです。

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この作品は、ローランドジュニア·フェロー· ​​プログラムによってサポートされています。クリス·ストークス特注の、コンピュータ支援圧力制御のセットアップ博士ダイアンSchaak、の開発に彼の助けのため：著者はハーバード大学ローランド研究所の科学者やスタッフに感謝の意を表したいと思います生体試料処理のための彼女の入力、電気セットアップを開発するためのウィンフィールド·ヒル、Alavaroサンチェス博士のための圧力のセットアップに必要な機械の配管部品を機械加工するためのフローサイトメーター、スコットBevis、ケニースペンサーとドンロジャースへのアクセスを許可する。マイクロ流体のマスターは、ハーバード大学のナノスケールシステムセンター（CNS）で作製した。

1。細胞調製<ol><li>リーボビッツL-15培地中で組織培養用T75フラスコあたり10 mlの容量でプレート転移性乳癌細胞株MDA-MB-231 1×10 5細胞/ mlを、10％（v / v）のウシ胎児血清および1を補充％ペニシリン - ストレプトマイシン。 </li><li> 0％CO 2環境下で37℃の加湿インキュベーター中MDA-MB-231細胞をインキュベートします。 </li><li> 2分間0.25％トリプシン-EDTAで細胞を処理し、増殖培地を8mlを添加することによりトリプシンの酵素活性を不活性化することにより2日間播種後の実験のために細胞を回収する。 </li><li> 5×10 5細胞/ mlの最終濃度になるようにダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水（のCa 2 +およびMgなしDPBS、1倍、2 +）で200×gで再懸濁し、5分間の遠心分離により細胞をペレット化。 </li></ol> 2デバイスの設計と製作注：マスク、マスタ金型捏造とプロセスを囲むマイクロチャネルは、ポリジメチルシロキサン（PDMS）マイクロ鋳造法は、通常の実験室ベンチトップ上で実行することができるが、クリーンルームの内部に行われるべきである。 <ol><li> AutoCADのと、図1に示すように、マイクロ流体デバイスを設計します。デバイスは、（L = 7ミリメートルW =40μmであり、H = 70μm）を、複数の注入ポート、粗いフィルターと2平行な長方形の慣性中心にチャンネルの入口で構成する必要があります。個別のストレートチャンネルは、アルミニウム電極用の穴を介して2つとは別に800μmで配置されている5エレクトロポレーションチャンバー（W C = 400μm）で構成されています。二つの横方向に隣接したエレクトロポレーションチャンバーは、負極用の穴を共有しています。二つのストレートチャンネルは、エレクトロポレーション領域の下流にある出口に合流する。 </li><li> LinkCADを使用してGDSIIファイルに微細パターンを持つCADファイルを変換します。 5 &quot;×5&quot;フォトマスクブランク上に微細なパターンを書くレーザーマスク描画装置を用いた。製造業者のプロトコルに従って、マスクを開発する。 NOTE：マスク開発プロセスは、フォトレジストの現像、クロムエッチングおよびレジスト除去を含む。代替的に、高解像度の透明度（&gt;2万解像度）に印刷微細パターンが第三者の製造業者から購入し、フォトマスクとして使用することができる。フォトマスク上の最終的なマイクロスケールの機能は、ネガ型フォトレジストの極性を一致させるために透明でなければならない。 </li><li> 70μmの最終的な厚さを有するように、2000rpmで4インチシリコンウェハー上にネガ型フォトレジストスピンコートを有する標準ソフトリソグラフィー技術23を用いて、デバイス設計の鋳型を製造する。 </li><li> 95℃で20分間、ネガ型フォトレジストを有するウェーハをプリベーク。 </li><li>ウェハマスクに連絡し、マスクアライナを使用して、80秒間UV源（17.4 MJ / cm 2）とにさらす。 </li><li> SU-8現像液中で4分間露光したウェハを開発する。 </li><li>測定表面形状を使用して、フォトレジストの厚さを開発しました。 </li><li>エージェント（シリコーンエラストマーキット）を硬化するエラストマーの1の割合とPDMSレプリカを生成するために、鋳型に混合物を注ぐ。徹底10をミックス。 30分間の鋳造エラストマーを脱ガスし、2時間70℃のオーブン中で、脱気したエラストマーとの鋳型を硬化させる。 </li><li>ピンバイスを使って入口、出口及び電極挿入用の金型とパンチ穴からマイクロ流路パターンを硬化したPDMSレプリカを剥離する。注：ピンバイスの通常の切刃径がしっかりと所定の位置にPEEKチューブ（1/32のOD」）とアルミニウム電極（0.029のOD」）を保持するための十分な0.76ミリメートル、である必要があります。 </li><li>それぞれ、ガラス75 Wの高周波電力および酸素分圧で7秒間の酸素プラズマクリーナーで処理スライド500ミリトールにPDMSレプリカを接合することによって囲まれたマイクロ流体チャネルを作成する。 </li></ol> 3フロー実験<ol><li>インサートアルミニウム電極マイクロチャネル内のホールを介して指定の場所へ（0.029 &quot;OD）と出口PEEKチューブ（1/32「OD）（ 図3Bを参照）。 </li><li>アルミニウム電極への高電圧短方形波パルスを生成するための18責任の電気機器を接続PDMSモールド中の溶液を流すと接触している（ 図3C参照 ）。注：装置は、パルス発生器と、社内に構築高電圧アンプで構成する必要があります18。 </li><li> （ 図3A参照 ）は、4つの50ml遠心個別DPBSを含むチューブに、細胞および生体分子の溶液、および空気式流量制御システムに接続されたそれぞれのバイアルホルダーに各チューブを取り付けるを準備する。18 </li><li>マイクロ流体デバイス内の各入口穴にバイアルホルダーから入口PEEKチューブを接続します。 </li><li>電気FIEを有するために100 Vに、方形波パルス、Vの大きさを設定するldは強度は、E = V / Lの電子 、電気室全体で0.7 kVの/ cmのと同等である。注：ここで、L eは正および負の電極が流動する溶液と接触している2点間の距離である（ 図1を参照）。 </li><li> 40 psiの圧力調整器を設定します。注：単一の手動調整可能な窒素源が均一にすべてのサンプルバイアルを加圧するために使用され、高速マニホールドが適時特注のLabVIEWソフトウェアを使用して、個別のソリューションポートを活性化するために利用される18 </li><li>バルブ制御のために、 バルブランナーラベル特注のLabVIEWソフトウェアを開き、操 ​​作する権利を有するドロップダウンメニューから実行]をクリックします。 </li><li>各対応するバルブのアイコンをクリックすることで、バルブの電源をオンにします。注：それが活性化されると、バルブのアイコンが緑色に点灯します。アクティブなアイコンをクリックすると、非アクティブにし、バルブを閉じます。閉弁アイコンがグレーに変わります。 </li><li> （DPBSリザーバー用のバルブを開けすなわち、1.5分間の安定な細胞トラップ渦発生に必要な主要な流速に洗浄液）。 </li><li> 30秒（ すなわち 、細胞捕捉ステップ）のためのエレクトロポレーションチャンバー内のトラップ細胞に対する細胞溶液を洗浄溶液から活性溶液ポートを切り替えます。 </li><li>ソリューション切り替えステップ中の破壊されていない流れを確保するために、細胞捕捉工程の前に10秒間、同時にデバイスを介して両方の洗浄および細胞のソリューションフロー。注：この簡潔な並行流ステップは、各ソリューション切り替えステップで繰り返されるべきである。 </li><li>洗浄ポートの電源を入れ、非捕捉された混入細胞を除去するために、20秒間のデバイスをフラッシュします。 </li><li>デバイスに関心のある第一の分子（3,000 Daの中性及びアニオン性デキストラン分子の0.2 mg / mlの70,000 Daのニュートラルデキストラン分子の1.5 mg / mlの）を含有する溶液を注入する。 </li><li>速やかに注入した後5短パルス（Δtは2秒間隔で30ミリ秒=）を適用分子溶液およびオシロスコープを使用してリアルタイムに印加される電気パルスの大きさおよび持続時間を監視します。 </li><li>配信される追加の分子の数な回数だけ繰り返し手順3.10。各分子送達のために、余分な分子を除去するために100秒間洗浄溶液でデバイスをフラッシュし、その後、分子溶液に100秒間細胞をインキュベート。 </li><li> 5 psiの下の運転圧力を低下させることにより、下流解析のために、96ウェルプレート内の細胞を解放します。注：100細胞を用いた溶液約100μlを各リリースから収集されます。 </li><li>実験的には、フローサイトメトリーのために十分な細胞を収集するために3.16三回を通じて3.9ステップ実行します。 </li><li> 228×gで5分間処理された細胞を含む96ウェルプレートを遠心する。 </li><li>過剰な蛍光分子を含有する上清を取り除きます。 </li><li>フローサイトメトリー分析のためにDPBSで細胞を再懸濁します。 </li><li>分子のuのためのフローサイトメーターでのロードセル効率分析をptake。 </li></ol>

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</ol>

著者らは、開示することは何もない。

スループットおよび多分子送達の効率の新しい並列化エレクトロポレーションプラットフォーム、10倍の増強に以前に開発単室システムが提供する全ての利点に加えて、達成された。18以前は利用可能なメリットは、（i）予備精製が含まれる生存能力増強のための均一なサイズ分布、（ii）の正確かつ個別分子の投薬管理、および（iii）低い運用電流を有する細胞を標的とする。これらは、分子量、共役フルオロフォアの種類、及び電荷の広い範囲で容易に利用可能であるため、蛍光標識デキストランは、目的の分子として選択した。彼らは生きている細胞のための不透過性の本質的に膜であり、細胞毒性を示さないので、これらのマクロ分子は、そのような研究のための良好な候補である。24最適な蛍光デキストランの濃度、インキュベーション時間、および電気的パラメータは、従来トン、現在のシステムのために同定されたエレクトロポレーション実験O。最適化プロセスによるリアルタイムでの分子の取り込みプロセスを監視するためのプラットフォームの能力をかなり単純かつ効率的であった。少しツーなしエレクトロポレーションパラメータの知識を有する分子または細胞型が試験されている...

近年では、細胞外分子のサイトゾル送達を容易にするために、電気パルスの使用は、哺乳動物細胞を操作する魅力的な手段となっている。1もエレクトロポレーションと呼ばれるこのプロセスは、可逆的にアクセスするために、本 ​​質的に膜不透過性分子を可能にする、細胞膜を透過性に細胞の細胞内環境に。実質的に任意の分子がエレクトロポレーションを用いた細胞の任意のタイプの膜に一時的に作成細孔を介してサイトゾルに導入することができ、この技術はより再現性であると報告されており、普遍的に適用、およびウイルス媒介化学を含む他の方法よりも効率的であるため細胞が生存し、そのまま保ちながら光学的ア ​​プローチ2-3この技術は、蛍光分子を導入する4医薬品5および核酸6-7利用されている。これらの利点を考えると、エレクトロポレーションは、一般的な労働力として採用されているDNAトランスフェクションのためのatory技術、 インビボ遺伝子治療8および細胞ワクチン接種の研究。成功したエレクトロポレーションに必要な電界強度が密接に細胞の直径と相関するので、従来のエレクトロポレーションシステムは、同時に、サイズが大きな不均一性を有するサンプルのための実用的な効率および生存率を達成することは依然としては困難である。さらに、これらのシステムは、複数の分子量の正確な制御は、バルク確率的分子送達プロセスへの依存に起因して配信されることはできない。9にこれらの問題に対処するために、多くのグループが、より低いポレーション電圧の利点を提供する、マイクロ流体エレクトロポレーション·プラットフォームを開発したより良いトランスフェクション効率、細胞死亡率の大幅な削減、および複数の分子を送達する能力。10〜13これらの利点は、電極ピッチマイクロエレクトロポレーションシステムの小さなフットプリントにより可能となった長さは飛躍的に成功した配信のために必要な電圧を減少させ、サブミリメートルである。さらに、これらのマイクロエレクト​​ロポレーションシステムは、均一な電界分布を得ることができ、迅速に送達効率を高めつつ、縮小細胞死を生じ、発生した熱を放散する。これらのマイクロチップのための透明な材料を利用し、さらに迅速なパラメータ変更のためのエレクトロポレーションプロセスのその場観察ができます。2,12しかし、投与量の制御とmolecular-と携帯依存のパラメータ制御の正確な新興研究および治療 ​​用途のために必要、6、 14-16は依然として未解決のまま。 この研究は、標的細胞の予め選択された同一集団に順次複数の分子を送達することができるマイクロ流体渦アシストエレクトロポレーションシステムを提示する。均一なサイズ分布を有する細胞は、以前に報告されたSiを用いたエレクトロポレーションの前に単離されるぜ選択的捕捉機構。17-18与えられた電界強度あたりのエレクトロポレーションの効率および拡張生存率の小さい変化が達成された、均一なサイズ分布を有することにより、 図19さらに、連続的に横切る分子の均一な送達のために許可されたマイクロスケールの渦を用いて捕捉された細胞を撹拌結果と一致する全体細胞質ゾルは、以前に別の渦アシストエレクトロポレーションプラットフォームを使用して報告した。20このシステムは広範囲の分子量を有する巨大分子をに配信された、一般的に生物学的用途で利用される分子の広い範囲に適用可能であることを示すために転移性乳癌細胞。また、リアルタイムのプロセス監視の助けを借りて、この作品はelectrporation中の分子配信のメカニズムについての長年の論争に終止符を打つためのより多くの証拠を提供し、主に拡散媒介対電気泳動媒介されている。14 </sup&gt;他のエレクトロポレーションシステムとは異なり、このプラットフォームは、一意的に正確なマルチ分子送達、高分子送達効率、最小の細胞死、サイズ、送達分子の電荷の広いスパン、ならびにエレクトロポレーションのリアルタイム可視化を組み合わせた利点を提供するプロセス。これらの機能を考えると、開発したエレクトロポレーションシステムは、セルラーリプログラミング研究、6,14,21-22薬物送達用途10,19およびエレクトロ分子配信メカニズムの深い理解のために必要とするアプリケーションのための汎用ツールとして実用的な可能性を秘めています。

<table><tbody><tr><td>MDA-MB-231 がん細胞株</td><td>American Type Culture Collection (ATCC)</td><td>HTB-26</td><td></td></tr><tr><td>Leibovitz's L-15 Medium</td><td>Cellgro, メディアテック</td><td>10-045-CV</td><td></td></tr><tr><td>ウシ胎児血清 (FBS)</td><td>Gibco, Life Technologies</td><td>16000-044</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン-ストレプトマイシン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4333</td><td></td></tr><tr><td>ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水 (DPBS)</td><td>Cellgro, Mediatech, Inc.</td><td>21-030</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Gibco, Life Technologies</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td>Flow Cytometer easyCyte HT</td><td>Millipore</td><td>0500-4008</td><td></td></tr><tr><td>酸素プラズマクリーナー</td><td>Technics Micro-RIE</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dektak 6M 表面プロファイラー</td><td>Veeco</td><td></td><td></td></tr><tr><td>KMPR 1050</td><td>Microchem</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SYLGARD 184 シリコーンエラストマーKIT</td><td>ダウ コーニング</td><td></td><td></td></tr><tr><td>圧縮窒素ガス</td><td>エアガス</td><td>NI 300</td><td></td></tr><tr><td>高圧レギュレータ</td><td>McMaster-Carr</td><td>6162K22</td><td></td></tr><tr><td>ダウンストリームレギュレータ</td><td>McMaster-Carr</td><td>4000K563</td><td></td></tr><tr><td>高速 3/2way-8 バルブマニホールド</td><td>Festo</td><td></td><td></td></tr><tr><td>インラインチェックバルブ</td><td>Idex Health and Science</td><td>CV3320</td><td></td></tr><tr><td>5/32" OD x 3/32" ID ポリウレタンチューブ</td><td>Pneumadyne</td><td>PU-156F-0</td><td></td></tr><tr><td>1/4" OD X 0.17" ID ポリウレタンチューブ</td><td>Pneumadyne</td><td>PU-250PB-4</td><td></td></tr><tr><td>1/16" PEEK チューブ</td><td>Festo</td><td>P1533</td><td></td></tr><tr><td>1/32" PEEK チューブ</td><td>Idex Health and Science</td><td>P1569</td><td></td></tr><tr><td>PEEK チューブユニオン</td><td>Idex Health and Science</td><td>P881</td><td></td></tr><tr><td>パルス発生器</td><td>HP</td><td>8110A</td><td></td></tr><tr><td>アルミワイヤー</td><td>ボブマーティン</td><td>カンパニー6061ミョウバン</td><td></td></tr><tr><td>オシロスコープ</td><td>Agilent</td><td>DSO3062A</td><td></td></tr><tr><td>50ml遠心分離管VWR</td><td></td><td>21008-178</td><td></td></tr><tr><td>15ml遠心分離管</td><td>VWR</td><td>21008-216</td><td></td></tr><tr><td>T75培養フラスコ</td><td>VWR</td><td>82050-862</td><td></td></tr><tr><td>デキストラン、テトラメチルローダミン、3,000 MW、アニオン性</td><td>ギブコ、Life Technologies</td><td>D3307</td><td></td></tr><tr><td>デキストラン、テトラメチルローダミン、70,000 MW、中性&nbsp;</td><td>Gibco, Life Technologies</td><td>D1819</td><td></td></tr><tr><td>Dextran, Texas Red, 3,000 MW, Neutral</td><td>Gibco, Life Technologies</td><td>D3329</td><td></td></tr></tbody></table> (英語)

マイクロスケール渦アシストシーケンシャル分子送達用エレクトロポ

Microscale Vortex-assisted Electroporator for Sequential Molecular Delivery

それは物理的に細胞内に非浸透性の外因性分子プローブを導入するための非常に強力な技術であるため、エレクトロポレーションは、過去数年間でますます注目を受けている。この作品は、精密な分子に依存するパラメータ制御で、哺乳動物細胞への複数の分子送達を行うことが可能なマイクロ流体電気穿孔プラットフォームを報告します。均一なサイズ分布を有する細胞を単離するシステムの能力は、与えられた電界強度あたりのエレクトロポレーション効率のより少ない変動を可能にする;したがって、サンプルの生存率を高めた。また、そのプロセスの可視化機能は、効率向上のために、その場で迅速な分子デリバリーパラメータ調整を可能にする、リアルタイムで蛍光分子の取り込み過程を観察することができます。報告されたプラットフォームの膨大な機能を表示するには、異なるサイズおよび電荷（3,000 70,000 DaでMWを有する、例えばデキストラン）を持つ巨大分子であったすべての試験した分子に対して高い送達効率（&gt; 70％）で転移性乳癌細胞に送達する。開発プラットフォームは、オンチップエレクトロポレーション技術は有益である研究分野の拡大に使用するための可能性を証明した。

開発された並列マイクロ流体エレクトロは、転移性乳癌細胞を生きたに多様なサイズと電荷を持つ高分子を送達した。成功した分子の送達は、定性的にその場で電気穿孔周回細胞の蛍光強度の変化を監視することによって決定し、フローサイトメトリー分析によって定量的測定によって確認した。 図4Aは、処理された細胞の90％が70,000 Daの中性デキストランを取り込むことを示している。統計分析のために、各フルオロフォアについての強度閾値は、未処理の生きた細胞の大部分（&gt; 99％）が閾値以下にカウントされるように確立された（図4（c）参照 ）。効率は、正常に処理された細胞の総数に対する目的の分子を取り上げる細胞数の比として定義される。 図4Bは効率が実質的分子に依存して変化しないことを示して重量または電荷（P&gt; 0.1）。すべての試験されたデキストラン分子は、70％よりも高い効率で細胞質ゾルに送達された。また、 図4Dは、シーケンシャルな分子の送達に成功し、同一の分子量（MW = 3000ダルトン...

マイクロ流体渦補助エレクトロポレーション·プラットフォームは、正確かつ独立した投与量制御を備え​​た同一の細胞集団への複数の分子の順次配信のために開発されました。分子の送達効率および加工細胞の生存率を向上させるために支援エレクトロポレーションの前に、システムのサイズベースの標的細胞精製工程。

Electroporation has received increasing attention in the past years, because it is a very powerful technique for physically introducing non-permeant ...

この手順の全体的な目的は、ボルテックス支援マイクロ流体ポアラーを用いて、生物学的に意味のある様々な種類の分子を、高効率かつ順次、用量を制御しながら届けることです。これはまず、細胞とバイオ分子を含むDPBS溶液を個別に充填した50 mLの遠心チューブを4本用意し、各チューブを空気圧流体制御システムに接続されたそれぞれのバイアルホルダーに取り付けることで達成されます。次のステップは、各バイアルからのインレットチューブを、15ピン電極が組み込まれたマイクロ流体デバイスに挿入することです。次に、細胞をデバイス内に流し、エレクトロポレーション室に形成されたマイクロスケールのボルテックスに細胞をトラップさせます。最終ステップでは、捕捉した細胞に短時間の電気パルスを印加し、直後に細胞質へ導入するバイオ分子を含む溶液を注入します。最終的に、このプロセスで得られた細胞を放出させ、後続の解析のために回収することができます。既存の手法に対する本手法の主な利点は、事前選択した同一の細胞集団に対して、複数の分子を制御された量で逐次的に、かつ高い効率と生存率で導入できる点にあります。各溶液でのコールドフローステップのタイミングが細胞トラッピングの安定性を決定するため、溶液交換の手順を習得するのは困難であり、本手法の視覚的な実演が不可欠です。本実験では、転移性乳がん細胞株M-D-A-M-B 2 31を使用します。細胞は、10%（v/v）胎児牛血清および1%ペニシリンを添加した Leibovitz's L 15 培地を用い、T 75 組織培養フラスコ1本あたり 10 mL の容量で 1 × 10⁵ cells/mL の密度で培養します。ストレプトマイシンを添加し、37°C、CO2濃度0%の加湿インキュベーター内で細胞を培養します。播種から2日後、実験のために細胞を回収します。細胞をPBSまたはDPBSで洗浄した後、0.25%トリプシンEDTAで2分間処理します。8 mLの増殖培地を加え、200 ×gで5分間遠心分離して細胞ペレットを回収し、最終濃度が5 × 10⁵ cells/mLとなるように培地で再懸濁して酵素活性を不活化します。マイクロ流体エレクトロポレーションデバイスの設計および作製については、本ビデオでは示しませんが、付随する論文に記載されています。このシステムは、細胞、分子、およびフラッシュ用溶液の導入口で構成されています。慣性フォーカシングが発生する2本の直線チャネル。フロー実験をセットアップするための、電極を備えた10個のエレクトロポレーションチャンバーとアウトレット。マイクロチャネルの穴を通じて、アウトレット、ポリエーテルエーテルケトン（PEEK）チューブ、および短パルス高電圧印加用の15ピンアルミニウム電極を所定の位置に挿入します。15ピン電極は、10本の正極と5本の負極で構成されています。各正極は負極から1.5 mmの間隔で配置されており、同極性の電極間は1.35 mmの間隔で配置されています。高電圧の短時間方形波パルスを発生させる電気装置を、流動溶液に接しているアルミニウム電極に接続します。PDMSモールドにおいて、装置はパルスジェネレーターと自作の高電圧アンプリファイアで構成される必要があります。DPBS、および細胞と分子を含む溶液をそれぞれ個別に分注した50 milliliter遠心チューブを4本準備します。各チューブを、空気圧フロー制御システムに接続されたそれぞれのバイアルホルダーに取り付けます。バイアルホルダーからのインレットピークチューブを、マイクロ流体デバイスの各インレット穴に接続します。次に、矩形波パルスの電圧値を100 voltsに設定します。エレクトロポレーションチャンバー内の電界強度を0.7 kilovolts per centimeterと同等にするため、圧力レギュレーターを40 PSIAに設定します。単一の手動調整可能窒素源を用いてすべてのサンプルバイアルを均一に加圧し、高速マニホールドを利用して個々の溶液ポートを適時に作動させます。バルブ制御には、カスタム構築したLabVIEWソフトウェアを使用します。Valve Runnerと表記されたLabVIEWソフトウェアを開き、[Operate]ドロップダウンメニューから[Run]をクリックします。対応するバルブアイコン（Valve 1）をクリックしてDPBSリザーバーのバルブを開き、安定した細胞トラッピングおよびボルテックス生成に必要な流速にするため、1.5分間プライミングを行います。バルブが有効になると、アイコンの色がグレーからグリーンに変わります。細胞トラッピングのステップに進む前に、洗浄液と細胞溶液の両方をデバイスに同時に10秒間流します。溶液の切り替え時に流れを途切れさせないため、この短い共流ステップを各溶液切り替えステップで繰り返してください。アクティブな溶液ポートを洗浄液から細胞溶液に切り替え、電極導入室内に細胞を30秒間トラップします。この動画では、青色の蛍光シグナルは生存しているフックを示しています。3, 3, 3, 4, 5段階の細胞。洗浄ポートをオンにし、デバイス内を20秒間フラッシュします。捕捉されていない汚染細胞を除去するため、目的の最初の一分子を含む溶液を流します。可視化を目的として、プロピジウムヨードをデバイス内に導入します。本デモンストレーションでは、染料のS/N比が優れているため、蛍光タグ付きDExTストランドの代わりに核酸染料を使用しています。分子溶液の注入直後に5回の短いパルスを速やかに印加し、オシロスコープを用いて印加した電気パルスの強度と回数をリアルタイムでモニターします。これにより、分子の蛍光信号を顕微鏡下で可視化できます。細胞を分子溶液中で100秒間インキュベートします。次に、2番目の分子である核酸染料YOYO-1を含む溶液をデバイス内に流します。このデモンストレーションでは、2つ目の分子は追加の電気パルスを適用せずに導入されます。このビデオにより、細胞が現在、3つすべての蛍光シグナルを発現していることが確認できます。yo-yo 1は緑色、プロピジウムヨウ化物は赤色、Hooksは青色で示されています。3, 3, 3, 4, 5. 動作圧力を5 PSI未満に下げて、細胞を96ウェルプレートに放出し、ダウンストリーム解析に供します。1回の放出につき、100個の細胞を含む約100 µLの溶液が回収されます。フローサイトメトリー用遠心分離に十分な細胞数を回収するため、エレクトロポレーションの手順を少なくとも3回繰り返す必要があります。処理済みの細胞を含む96ウェルプレートを228 ×gで5分間遠心分離します。室温で、余剰な蛍光分子を含む上清を取り除き、細胞をDPBSで再懸濁します。蛍光標識したDExT鎖を導入した場合、続いて細胞の分子取り込みを分析します。フローサイトメトリーを用いて効率を測定します。エレクトロポレーション後の細胞における蛍光強度の変化をモニタリングすることで、分子導入の成功を定性的に判定した結果、処理した細胞の90%が70,000 Daltonのアニオン性DExT鎖分子を取り込んでいることが確認されました。目的分子を正常に取り込んだ細胞数と処理した全細胞数の比として定義される、転移した各デキストラン分子の効率は、分子量や電気的電荷によって大幅に変動しませんでした。テストしたすべてのデキストラン分子は、70%以上の効率で細胞質に導入されました。ここに、エレクトロポレーション処理を行わなかった細胞の代表的なフローサイトメトリープロファイルを示します。分子導入の成功を示す蛍光しきい値は、対照サンプルの信号がしきい値を下回るようにデータに基づいて設定されています。逐次的にエレクトロポレーションされた細胞の代表的なフローサイトメトリーデータである本図では、フローサイトメトリーのプロットと蛍光ストリーク画像が並べて表示されています。緑色の枠は3000 Daltonの中性デキストランのみを取り込んだ細胞からの信号を、赤色の枠は3000 Daltonのイオン性DExT鎖のみを取り込んだ細胞からの信号を表しています。黄色の蛍光信号は両方のDExT鎖分子を取り込んだ細胞を示しており、デュアル分子の導入効率は56%であったことを示しています。本手法の開発により、医学、バイオテクノロジー、薬理学分野の研究者が、複雑な疾患の治療において相乗効果を得るための治療試薬の組み合わせを探索する際に有用となるでしょう。高電圧パルスを用いた操作は極めて危険であるため、本手順の実施中は、必ず接地（アース）を確認するなど、適切な予防措置を講じてください。

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Research

JoVE Journal

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マイクロスケール渦アシストシーケンシャル分子送達用エレクトロポ

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