マイクロスケール渦アシストシーケンシャル分子送達用エレクトロポ

この手順の全体的な目標は、Vortexアシストマイクロ流体ポラーを使用して、生物学的に意味のある分子の様々なタイプを順番かつ投与量制御可能な方法で高効率で送達することです、これは最初に細胞と生体分子を含むDPBS溶液を個別に含む4つの50ミリリットル遠心分離管を準備し、各チューブを空気圧流量制御システムに接続されたそれぞれのバイアルホルダーに取り付けます。2番目のステップは、15ピン電極が埋め込まれたマイクロ流体デバイスに、それぞれのバイアルからのインレットチューブを挿入することです。次に、細胞はデバイスに流され、エレクトロポレーションチャンバーで形成されたマイクロスケールの渦に閉じ込められます。

最後のステップは、トラップされた細胞に短い電気パルスを速やかに印加し、その後、送達される生体分子を含む溶液をサイトゾルに注入することです。最終的に、このプロセスから得られた細胞を放出し、下流の分析のために収集することができます。この技術が既存の方法と比較した場合の主な利点は、提案された技術が、制御された量の複数の分子を、事前に選択された同一の細胞集団に高い効率と生存率で順次送達できることである。

この方法は、各ソリューションでのコールドフローステップのタイミングのために流体交換ステップを学ぶのが難しいため、視覚的にデモンストレーションすることが重要です。スイッチングステップは、細胞トラップの安定性を決定します。転移性乳がん細胞株M-D-A-M-B 2 31は、この実験プレートで10〜5細胞/1ミリリットルあたり10〜5番目の細胞を10ミリリットル/Tあたり10ミリリットルのボリュームで使用します75組織培養フラスコをLeibovitzのL 15培地に10%ボリュームあたり10%ボリューム、胎児ウシ血清、および1%ペニシリンを補給します。

ストレプトマイシンは、加湿インキュベーターで摂氏37度、二酸化炭素環境が0%の状態で細胞をインキュベートします。播種から2日後、実験のために細胞を採取します。ブコスリン酸緩衝生理食塩水またはDPBSで細胞を洗浄した後、細胞を0.25%tripsin EDTAで2分間処理します。

8ミリリットルの増殖培地を添加して、Gの200倍で5分間の遠心融合により酵素活性ペレット細胞を不活性化し、培地を最終濃度の10倍から1ミリリットルあたり5番目の細胞に再懸濁します。マイクロ流体エレクトロポレーションデバイスの設計と製造は、このビデオでは示されていませんが、添付の原稿で説明されています。このシステムは、細胞、分子、およびフラッシュ溶液の入口で構成されています。

慣性集束が発生する2つの直線チャネル 電極とフロー実験用にセットアップする出口を備えた10のエレクトロポレーションチャンバー。アウトレット、ポリエーテル、エーテルケトン、またはピークチューブ、およびショートパルス、高電圧印加用の15ピンアルミニウム電極をマイクロチャネルの穴を介して指定された場所に挿入します。

15ピン電極は、10個の正極と5個の負極で構成されています。各正極は負極から1.5mm間隔で配置され、同じ極性の各電極は1.35mm間隔で配置されています。高電圧短方形波パルスを生成するための電気機器を、流れる溶液と接触しているアルミニウム電極に接続します。

PDMSの金型では、機器はパルス発生器と社内製の高電圧増幅器で構成する必要があります。DPBSと細胞および分子を含む溶液を個々に含む50ミリリットルの遠心分離チューブを4本調製します。各チューブを、空気圧流量制御システムに接続されたそれぞれのバイアルホルダーに取り付けます。

バイアルホルダーからのインレットピークチューブを、マイクロ流体デバイスのそれぞれのインレットホールに接続します。次に、セットします。矩形波パルスの大きさはボルトから100ボルトです。

エレクトロポレーションチャンバー全体の電界強度を0.7キロボルト/センチメートルと同等にするために。圧力調整器を40 PSIAに設定する 手動で調整可能な単一の窒素源を使用して、すべてのサンプルバイアルを均一に加圧し、高速マニホールドを使用して個々の溶液ポートをタイムリーに活性化します。バルブ制御用のカスタムビルドラボビューソフトウェアを使用します。

Valve Runnerというラベルの付いたラボビューソフトウェアを開き、OperateというタイトルのドロップダウンメニューからRunをクリックします。対応するバルブアイコンバルブ1をクリックしてDPBSリザーバーのバルブを開き、安定したセルトラッピングボルテックス生成に必要な流速を1.5分間プライミングします。バルブのアイコンは、細胞トラップステップの10秒間前に、洗浄液と細胞溶液の両方を装置内で同時に作動させると、灰色から緑色に変わります。

ソリューション切り替えステップ中に流れが途切れないようにするには、この短いcoフローステップを各ソリューション切り替えステップで繰り返す必要があります。活性溶液ポートを洗浄液から細胞溶液に切り替えて、エレクトロポレーションチャンバーに細胞を30秒間トラップします。この映画では、青色の蛍光シグナルが有効なフックを表しています。

3、3、3、4、5ステージの細胞。洗浄ポートをオンにし、デバイスを20秒間洗い流します。トラップされていない汚染細胞を除去するために、目的の最初の分子を含む溶液を流します。

ヨウ化プロピジウムを可視化するためにデバイスに挿入します。このデモンストレーションでは、蛍光タグ付きDExT鎖の代わりに核酸色素を使用し、分子溶液の注入直後に5つの短いパルスを印加し、オシロスコープを使用して印加された電気パルスの大きさと数をリアルタイムで監視し、分子の蛍光シグナルを顕微鏡で視覚化することができます。 細胞を分子溶液中で100秒間インキュベートします。次に、第2の分子を含む溶液を、核酸色素ヨーヨー1を装置内に

このデモンストレーションでは、追加の電気パルスアプリケーションなしで2番目の分子が送達されます。この動画は、細胞が3つの蛍光シグナルをすべて発現するようになったことを確認しています。緑はヨーヨー、1、赤はプロピジウム、ヨウ化物、青はフック。

3、3、3、4、5。細胞を96ウェルプレートに放出し、操作圧力を5 PSI未満に下げてダウンストリーム分析を行います。各リリースから約100マイクロリットルの溶液と100個の細胞が収集されます。

エレクトロポレーション手順は、フローサイトメトリー遠心分離機に十分な細胞を収集するために、少なくとも3回繰り返す必要があります。処理された細胞を含む96ウェルプレートをGの228倍で5分間。室温で、過剰な蛍光分子を含む上清を除去し、細胞をDPBSに再懸濁します。

蛍光タグ付きDExT鎖が送達された場合、その後、細胞の分子取り込みが分析されます。フローサイトメトリーによる効率。成功した分子送達は、C twoのエレクトロポレーション軌道細胞の蛍光強度の変化を監視することによって定性的に分類され、処理された細胞の90%がイオン性DExT鎖分子である70,000ダルトンを取り込むことを確認しました。

転写された各デキストラン分子の効率は、処理された細胞の総数に対する目的の分子をうまく取り込む細胞の数の比率として定義され、分子量や電荷によって大きく変化しませんでした。試験したすべてのデキストラン分子は、70%を超える効率でサイトゾルに送達されましたエレクトロポレーションで処理されなかった細胞の代表的なフローサイトメトリープロファイルをここに示しています。分子送達が成功したことを示す蛍光閾値は、コントロールサンプルからのシグナルが閾値を下回るようにデータから設定されます。

この代表的なフローサイトメトリーデータは、逐次エレクトロポレーション細胞のフローサイトメトリープロットを蛍光ストリーク画像の隣に表示しており、緑のボックスは3000を取り込む細胞からのシグナル、ダルトン中性デキストランのみ、赤のボックスは細胞からのシグナルを表しています。イオン性DExT鎖である3000ダルトンを取り込み、細胞からの蛍光シグナルのみを取り込み、黄色で示した両DExT鎖分子は、その開発後56%の二重分子送達効率を示している。この技術は、医学、バイオテクノロジー、薬理学の分野の研究者が、複雑な疾患の治療において相乗効果を達成するための治療試薬の組み合わせを探求するのに役立ちます。

高電圧電気パルスでの作業は非常に危険である可能性があるため、この手順を実行するときは、接地されていることを確認するなどの予防措置を常に講じる必要があることを忘れないでください。