マイクロスケール渦アシストシーケンシャル分子送達用エレクトロポ

この手順の全体的な目的は、ボルテックス支援マイクロ流体ポアラーを用いて、生物学的に意味のある様々な種類の分子を、高効率かつ順次、用量を制御しながら届けることです。これはまず、細胞とバイオ分子を含むDPBS溶液を個別に充填した50 mLの遠心チューブを4本用意し、各チューブを空気圧流体制御システムに接続されたそれぞれのバイアルホルダーに取り付けることで達成されます。次のステップは、各バイアルからのインレットチューブを、15ピン電極が組み込まれたマイクロ流体デバイスに挿入することです。次に、細胞をデバイス内に流し、エレクトロポレーション室に形成されたマイクロスケールのボルテックスに細胞をトラップさせます。

最終ステップでは、捕捉した細胞に短時間の電気パルスを印加し、直後に細胞質へ導入するバイオ分子を含む溶液を注入します。最終的に、このプロセスで得られた細胞を放出させ、後続の解析のために回収することができます。既存の手法に対する本手法の主な利点は、事前選択した同一の細胞集団に対して、複数の分子を制御された量で逐次的に、かつ高い効率と生存率で導入できる点にあります。

各溶液でのコールドフローステップのタイミングが細胞トラッピングの安定性を決定するため、溶液交換の手順を習得するのは困難であり、本手法の視覚的な実演が不可欠です。本実験では、転移性乳がん細胞株M-D-A-M-B 2 31を使用します。細胞は、10%（v/v）胎児牛血清および1%ペニシリンを添加した Leibovitz's L 15 培地を用い、T 75 組織培養フラスコ1本あたり 10 mL の容量で 1 × 10⁵ cells/mL の密度で培養します。

ストレプトマイシンを添加し、37°C、CO2濃度0%の加湿インキュベーター内で細胞を培養します。播種から2日後、実験のために細胞を回収します。細胞をPBSまたはDPBSで洗浄した後、0.25%トリプシンEDTAで2分間処理します。

8 mLの増殖培地を加え、200 ×gで5分間遠心分離して細胞ペレットを回収し、最終濃度が5 × 10⁵ cells/mLとなるように培地で再懸濁して酵素活性を不活化します。マイクロ流体エレクトロポレーションデバイスの設計および作製については、本ビデオでは示しませんが、付随する論文に記載されています。このシステムは、細胞、分子、およびフラッシュ用溶液の導入口で構成されています。

慣性フォーカシングが発生する2本の直線チャネル。フロー実験をセットアップするための、電極を備えた10個のエレクトロポレーションチャンバーとアウトレット。マイクロチャネルの穴を通じて、アウトレット、ポリエーテルエーテルケトン（PEEK）チューブ、および短パルス高電圧印加用の15ピンアルミニウム電極を所定の位置に挿入します。

15ピン電極は、10本の正極と5本の負極で構成されています。各正極は負極から1.5 mmの間隔で配置されており、同極性の電極間は1.35 mmの間隔で配置されています。高電圧の短時間方形波パルスを発生させる電気装置を、流動溶液に接しているアルミニウム電極に接続します。

PDMSモールドにおいて、装置はパルスジェネレーターと自作の高電圧アンプリファイアで構成される必要があります。DPBS、および細胞と分子を含む溶液をそれぞれ個別に分注した50 milliliter遠心チューブを4本準備します。各チューブを、空気圧フロー制御システムに接続されたそれぞれのバイアルホルダーに取り付けます。

バイアルホルダーからのインレットピークチューブを、マイクロ流体デバイスの各インレット穴に接続します。次に、矩形波パルスの電圧値を100 voltsに設定します。

エレクトロポレーションチャンバー内の電界強度を0.7 kilovolts per centimeterと同等にするため、圧力レギュレーターを40 PSIAに設定します。単一の手動調整可能窒素源を用いてすべてのサンプルバイアルを均一に加圧し、高速マニホールドを利用して個々の溶液ポートを適時に作動させます。バルブ制御には、カスタム構築したLabVIEWソフトウェアを使用します。

Valve Runnerと表記されたLabVIEWソフトウェアを開き、[Operate]ドロップダウンメニューから[Run]をクリックします。対応するバルブアイコン（Valve 1）をクリックしてDPBSリザーバーのバルブを開き、安定した細胞トラッピングおよびボルテックス生成に必要な流速にするため、1.5分間プライミングを行います。バルブが有効になると、アイコンの色がグレーからグリーンに変わります。細胞トラッピングのステップに進む前に、洗浄液と細胞溶液の両方をデバイスに同時に10秒間流します。

溶液の切り替え時に流れを途切れさせないため、この短い共流ステップを各溶液切り替えステップで繰り返してください。アクティブな溶液ポートを洗浄液から細胞溶液に切り替え、電極導入室内に細胞を30秒間トラップします。この動画では、青色の蛍光シグナルは生存しているフックを示しています。

3, 3, 3, 4, 5段階の細胞。洗浄ポートをオンにし、デバイス内を20秒間フラッシュします。捕捉されていない汚染細胞を除去するため、目的の最初の一分子を含む溶液を流します。

可視化を目的として、プロピジウムヨードをデバイス内に導入します。本デモンストレーションでは、染料のS/N比が優れているため、蛍光タグ付きDExTストランドの代わりに核酸染料を使用しています。分子溶液の注入直後に5回の短いパルスを速やかに印加し、オシロスコープを用いて印加した電気パルスの強度と回数をリアルタイムでモニターします。これにより、分子の蛍光信号を顕微鏡下で可視化できます。細胞を分子溶液中で100秒間インキュベートします。次に、2番目の分子である核酸染料YOYO-1を含む溶液をデバイス内に流します。

このデモンストレーションでは、2つ目の分子は追加の電気パルスを適用せずに導入されます。このビデオにより、細胞が現在、3つすべての蛍光シグナルを発現していることが確認できます。yo-yo 1は緑色、プロピジウムヨウ化物は赤色、Hooksは青色で示されています。

3, 3, 3, 4, 5. 動作圧力を5 PSI未満に下げて、細胞を96ウェルプレートに放出し、ダウンストリーム解析に供します。1回の放出につき、100個の細胞を含む約100 µLの溶液が回収されます。

フローサイトメトリー用遠心分離に十分な細胞数を回収するため、エレクトロポレーションの手順を少なくとも3回繰り返す必要があります。処理済みの細胞を含む96ウェルプレートを228 ×gで5分間遠心分離します。室温で、余剰な蛍光分子を含む上清を取り除き、細胞をDPBSで再懸濁します。

蛍光標識したDExT鎖を導入した場合、続いて細胞の分子取り込みを分析します。フローサイトメトリーを用いて効率を測定します。エレクトロポレーション後の細胞における蛍光強度の変化をモニタリングすることで、分子導入の成功を定性的に判定した結果、処理した細胞の90%が70,000 Daltonのアニオン性DExT鎖分子を取り込んでいることが確認されました。

目的分子を正常に取り込んだ細胞数と処理した全細胞数の比として定義される、転移した各デキストラン分子の効率は、分子量や電気的電荷によって大幅に変動しませんでした。テストしたすべてのデキストラン分子は、70%以上の効率で細胞質に導入されました。ここに、エレクトロポレーション処理を行わなかった細胞の代表的なフローサイトメトリープロファイルを示します。分子導入の成功を示す蛍光しきい値は、対照サンプルの信号がしきい値を下回るようにデータに基づいて設定されています。

逐次的にエレクトロポレーションされた細胞の代表的なフローサイトメトリーデータである本図では、フローサイトメトリーのプロットと蛍光ストリーク画像が並べて表示されています。緑色の枠は3000 Daltonの中性デキストランのみを取り込んだ細胞からの信号を、赤色の枠は3000 Daltonのイオン性DExT鎖のみを取り込んだ細胞からの信号を表しています。黄色の蛍光信号は両方のDExT鎖分子を取り込んだ細胞を示しており、デュアル分子の導入効率は56%であったことを示しています。本手法の開発により、医学、バイオテクノロジー、薬理学分野の研究者が、複雑な疾患の治療において相乗効果を得るための治療試薬の組み合わせを探索する際に有用となるでしょう。

高電圧パルスを用いた操作は極めて危険であるため、本手順の実施中は、必ず接地（アース）を確認するなど、適切な予防措置を講じてください。