低コヒーレンスホロトモグラフィーによる腸管オルガノイドのラベルフリー、高解像度3Dイメージングおよび機械学習解析

私たちは、開発中および薬物に反応した生きたオルガノイドの生物物理学的変化をモニタリングする際に、リアルタイムでラベルフリーのイメージング法を確立することを目指しています。このプロトコルは、生物医学研究のためのAI駆動の突然変異と定量的テクスチャー選択に支えられた生きたオルガノイドにおけるイメージングと非侵襲的薬物試験の合理化された規模を容易にします。疾患モデリングと精密医療における高解像度の非侵襲的オルガノイド研究のために、ラベルフリーの3Dイメージングと年間分析をさらに統合することをプロットします。

まず、細胞外マトリックスを含む48ウェルプレートの各ウェルから使用済み培地を吸引します。各ウェルに200マイクロリットルの細胞回収液を加え、摂氏4度で30分間インキュベートします。ピペットを使用して、オルガノイド懸濁液をそっと収集し、微量遠心チューブに移します。

チューブを150gで3分間遠心分離し、上清を慎重に取り除きます。ペレットを機械的に解離するには、200マイクロリットルの培地に再懸濁し、P200ピペットを使用して懸濁液を上下に20〜30回ピペットで3分間遠心分離します。遠心分離して上清を除去した後、培地と新鮮な細胞外マトリックス(ECM)をペレットに1対4の比率で加え、ピペットで静かに混ぜて完全に混合します。

ドームあたり15マイクロリットルの混合物を48ウェルプレートの各ウェルに分注します。プレートを逆さまにして摂氏37度、5%二酸化炭素のインキュベーターに1時間入れ、ECMの重合を可能にします。重合後、各ウェルに200マイクロリットルの新鮮な培地を加え、空の外側のウェルをPBSで満たします。

イメージング用のサンプルを準備するには、15マイクロリットルのオルガノイドECMドームを番号1.5のカバーガラス底部イメージングディッシュに分注し、室温で1分間インキュベートします。プレートを摂氏37度、2酸化炭素5%のインキュベーターに1時間逆さまに置きます。次に、オルガノイドを完全に沈めるのに十分な培地をそっと加えます。

継代後5日で、イメージングの直前にサンプルをPBSで2〜3回洗浄します。次に、イメージングのために、環境コントローラーの電源を入れます。チャンバーコントローラーユニットは、温度を摂氏37度、二酸化炭素を5%に自動的に設定しますドアボタンを押してドアを開けます。

水を加えてチャンバーウェル内に薄い層を形成します。イメージングディッシュを容器ホルダーに入れ、イメージングチャンバーに挿入し、動きを防ぐためにピンで固定します。外部光の干渉を防ぐためにドアを閉めてください。

次に、TomoStudio Xソフトウェアを起動してログインします。[開始] をクリックしてメイン ウィンドウを開き、左上隅にある [プロジェクトの追加] をクリックして実験を割り当てます。適切な屈折率使用のために正しい媒体タイプが選択されていることを確認します。

パネルで目的のウェルをクリックし、上部の「作成」をクリックして、ウェルを試料として登録します。次に、右上隅にある [ROI 設定] をクリックして、ディッシュ内の関心領域を定義します。設定したら、右下隅にある「実験の実行」をクリックして、「画像取得」ウィンドウを開きます。

隅にある Load Vessel をクリックして、明るい視野画像を表示します。ZボタンとZボタンを使用してZ位置を調整し、画像に焦点を合わせます。[シングル イメージング] タブで、ROI サイズを調整します。

160マイクロメートル×160マイクロメートルの視野でオルガノイドを捕捉し、最大140マイクロメートルの深さのスタックを取得します。[タイムラプスイメージング]タブに移動して長期イメージングを設定し、希望の期間と間隔時間を設定します。[スキャン] アイコンをクリックして、現在の ROI の場所をキャプチャします。

BFボタンをクリックして、明視野イメージングの強度と露出値を調整します。プレビューパネルのROIボックスを移動して、ROIを選択します。目的のROIを選択したら、下部にある[ポイントの追加]をクリックすると、イメージングポイントリストが作成されます。

次に、[取得]をクリックしてイメージングを開始し、生の画像データを取得します。デスクトップアイコンをクリックして、HTX処理サーバーを起動します。生の画像ファイルをHTX処理サーバーにドラッグアンドドロップします。

[処理] をクリックして、未加工のイメージ ファイルから TCF ファイルを生成します。デスクトップアイコンをクリックして、TomoAnalysis Viewerを起動します。処理された TCF ファイルをビューア ウィンドウにドラッグ アンド ドロップして読み込みます。

ファイルのサムネイルをダブルクリックして、ROI トモグラムを開きます。ズーム、パン、スクロールのコントロールを使用して、X、Y、Z平面を移動して、2Dビューを調べます。左側のMIPレンダリングビューアイコンをクリックして、3Dレンダリングモードに切り替えます。

画像を回転、ズーム、パンして 3D ビューをナビゲートします。機械学習ベースの画像セグメンテーションでは、TCF 画像ファイルを HDF5 形式にエクスポートして、データが ilastik と互換性のある多次元形式であることを確認します。ilastik を開き、[新しいプロジェクト] に移動します。

[セグメンテーション ワークフロー] セクションで [ピクセル分類] を選択し、プロジェクトを指定されたフォルダーに保存します。HGF5 ファイルを読み込むには、[入力データ] タブに移動し、[新しいファイルの追加] をクリックし、適切な H5 データセットを選択して、正しい画像チャネルの割り当てを確認します。次に、[特徴の選択] タブに移動して、色、強度、エッジ、テクスチャなどの特徴を選択し、セグメンテーションを最適化します。

[トレーニング]タブで、異なる色のブラシストロークを使用して、オルガノイド領域と非オルガノイド領域にラベルを付けます。「ライブ更新」をクリックして、セグメンテーション結果をプレビューし、必要に応じて調整を行います。完了したら、[予測のエクスポート] タブに移動します。

ラベル付き予測をエクスポートするソースとして [シンプルセグメンテーション] を選択し、[すべてエクスポート] をクリックします。分析要件に基づいて、エクスポート形式をH5またはTIFFに設定します。定量分析の場合は、補足コーディングファイル2を開きます。

スクリプト内のマスクファイルと対応するTCFファイルの適切なフォルダパスを指定します。コードを実行して定量分析を開始します。このコードは、各データセットのオルガノイド体積、タンパク質密度、および総タンパク質含有量を計算します。

この図は、小腸オルガノイドの全体的な形態を視覚化するために使用される高解像度の3次元屈折率再構成を示しています。レンダリングされた再構成は、3つの光学切片の深さすべてにわたって、ビヒクル処理オルガノイドとシスプラチン処理オルガノイドの間の明確な構造の違いを明らかにします。シスプラチン処理オルガノイドは、処理後10分でビヒクル処理オルガノイドと比較して、有意に高い体積、より低いタンパク質密度、およびより高い総タンパク質含有量を示し、初期の構造膨潤とタンパク質組成の変化を示しました。

24時間にわたるタイムラプスイメージングでは、ビヒクル処理されたオルガノイドは構造的完全性を維持しているのに対し、シスプラチン処理されたオルガノイドは陰窩崩壊や細胞解離の増加などの進行性の構造分解を経験し、時間依存的な細胞毒性損傷を示唆しました。定量的追跡により、ビヒクル処理されたオルガノイドは時間の経過とともに体積とタンパク質含有量が増加し、シスプラチン処理されたオルガノイドは両方のパラメーターで時間依存的な減少を示し、シスプラチンが成長を抑制し、細胞分解を誘導したことが示されました。タンパク質密度は、ビヒクル処理オルガノイドでは安定したままでしたが、シスプラチン処理オルガノイドでは24時間にわたって徐々に減少し、剥離による細胞構造の破壊と細胞外空間の増加を示唆した。