血栓プロファイリングアッセイ:生体力学的血栓形成を包括的に特徴づけるためのマイクロ流体ベースのプラットフォーム
2026年1月9日
本研究は、せん断応力を用いて血液中の血栓形成を誘発し、多次元読み取りによって血栓を特徴付けるマイクロ流体アッセイを記述しています。このアッセイは血液サンプルの血栓促進傾向を測定できるため、疾患診断、薬剤開発、さらには血栓症に関連する基本的なメカニズム研究に役立ちます。
私たちは血栓症の生体力学的特性を十分に捉え、さらに人間の血栓前異常を検出できる新しい手法を開発しました。まず、シリコンウェハーを使って設計に基づいて標準的なフォトリソグラフィーでSU8フォトレジストマスターモールドを製作し、マスターモールドを15センチのペトリ皿の底にテープで固定します。ポリジメチルシロキサン(PDMS)混合物は、シリコーンエラストマーキットのプレポリマーベースと硬化剤を10対1の重量比で混合して調製します。
PDMS混合液をマスターモールドに注ぎます。次に、PDMS混合物を含むプレートを真空乾燥器に入れて脱ガスします。PDMS混合物を75度に設定したインキュベーターに2時間熱的に硬化させます。
インキュベーターからサンプルを取り出した後、マスターモールドから硬化したPDMSを慎重に切り出し、硬化したPDMSを個々のチップユニットに区切る。プローブニードルを使って指定された場所に穴を開け、入口と出口を作ります。化学フードでは、75%エタノール湿潤作業用ワイプでガラススライドを洗浄し、乾燥させます。
次に、高周波発生器を使い、ガラススライドを30秒、PDMSチップを20秒処理します。各チップをガラススライドに合わせ、チップを優しくガラススライドの表面に押し付けて固定します。次に、150度に設定したオーブンで15分間熱接着します。
接合後は、室温のホコリのない環境で保管してください。次に、ピンサーを使ってプローブニードルのプラスチック部分を取り除き、金属管を90度曲げてマイクロ流体装置のコネクターを作ります。アレクサフルオリンでフィブリノーゲンと必要な抗体の共役反応を設定した後、1,100Gで精製カラムを2分間遠心分離し、貯蔵バッファーを取り出します。
流を廃棄した後、反応溶液を適合する収集バイアルに取り付けられた精製カラムに搭載し、遠心分離機で1,100Gで5分間必要な混合物を収穫します。分光光度計を用いて、タンパク質の吸収度と染料信号を測定します。タンパク質濃度と蛍光対タンパク質のモル比を計算します。
染料は暗闇で摂氏4度の温度で保存してください。タイロードバッファーにヘパリンを最終濃度10ミリリットルあたり0.32単位/ミリリットルに加え、pH7.4で500マイクロリットルのタイロードバッファーを吸引して注射器を準備します。ヘパリン入り注射器で静脈穿刺で血液を採取した後、15ミリリットルの遠心分離管に移し、37度の温度に保ちます。
フォン・ヴィレブランド因子モノマーをPBSで1ミリリットルあたり2マイクログラムに希釈します。マイクロ流体デバイスに希釈したフォン・ヴィレブランド因子モノマーをプリコーティングし、室温で1時間培養します。次に蛍光センサーセット1またはセット2で血液サンプルを室温で10分間培養します。
次に、マイクロ流体装置とインレットコネクター、チューブを接続します。インレットコネクターのもう一方の端をPBS入りのチューブに接続し、もう一方の端を注射器に接続します。注射器をシリンジポンプに取り付け、マイクロ流体装置を倒立顕微鏡に取り付けます。
顕微鏡ステージを手動で操作して狭窄部位を特定します。マイクロ流体チャネルとチューブにPBSを注入し、シリンジポンプで毎分0.5ミリリットルの流量で満たします。狭窄部位の周囲に気泡がないか、機器を点検してください。
インレットチューブを血液サンプルに接続し、シリンジポンプを使ってマイクロフルイドチャネルを通じて血液サンプルを0.018ミリリットル毎分の流量で灌流します。逆立顕微鏡では、ソフトウェア内の各蛍光チャネルの露光時間とゲインを設定します。4つのチャネルを交互に使い、1個ずつフルオロ4を励起させることでリアルタイムの多色蛍光イメージングを行います。
フォーカス面を血栓に合わせ、狭窄部位で蛍光信号を15〜30分間記録します。データ解析の場合は、ImageJバージョン1.53を使ってデータファイルを開きます。SZ 22 fit Cチャネルを使って血栓の輪郭を特定してください。
次にポリゴン選択を使い、血栓の大まかな領域を選択します。各チャンネルで、画像を選択し、「調整」を選択し、その後「しきい値」を選択してバックグラウンド信号を除去します。最後に、「分析」を選択し「測定」を選択して、血栓内の面積と平均信号強度を測定します。
代表的なスナップショットでは、健康な血液中狭窄チャネル内で血栓が形成され、血小板、フィブリノーゲン、フォン・ヴィレブランド因子、P-セレクチンがセンサーセット1で可視化され、血小板、ホスファチジルセリン、E陽性インテグリンαIIbβ3、活性化されたインテグリンαIIbベータ3がセンサーセット2で可視化されました。単一の蛍光チャネル画像を処理し、血栓領域を選択し、背景信号を除去し、信号面積と平均輝度を測定して定量解析を行いました。蛍光信号強度の連続解析により、血栓形成中の血小板蓄積の信号対時間曲線が生成されました。
各時刻点について、センサーセット1の4つのバイオマーカー、センサーセット2の4つのバイオマーカーの合計信号強度が取得されました。血栓の大きさを計算し、7次元の血栓プロファイルを生成しました。現在、ヒト患者の血栓促進傾向を評価するバイオアッセイは存在せず、私たちの研究はこのギャップを埋めようとしています。
血液サンプルの生体力学的活性を検出することで、被験者の血栓促進特性を包括的に評価できます。本アッセイは患者の血栓前傾向を検出するための臨床試験として開発可能であり、次世代抗血栓薬のスクリーニングにも利用可能です。
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概要
本記事では、マイクロ流体技術と多色蛍光イメージングを統合し、生体力学的な血栓形成を包括的に特性解析する新しい血栓プロファイリングアッセイを紹介します。この手法により、動脈剪断条件下での血栓形成の詳細な分析が可能となり、血栓のサイズ、組成、および血小板活性化に関する7つの異なるリードアウトが得られます。本アッセイは、ヒトにおける血栓形成傾向の評価および抗血栓剤の有効性を判定するための、堅牢なバイオアッセイへのニーズに応えるものです。
研究の主要構成要素
科学分野
- 血液学
- バイオエンジニアリング
- マイクロフルイディクス
- 血栓症研究
背景
- 血栓症は、血管内における血小板および凝固因子の異常な蓄積を伴います。
- 動脈血栓症は、多くの場合、動脈狭窄によるせん断応力の増大に関連しています。
- 血流などのバイオメカニクス的要因は、血栓形成において重要な役割を果たします。
- 既存のアッセイでは、血栓形成のバイオメカニクス的な側面を完全には捉えられていません。
研究目的
- 生体力学的な血栓形成を詳細にプロファイリングするアッセイを開発すること。
- ヒト血液サンプルにおける血栓形成傾向の包括的な評価を可能にすること。
- 抗血栓薬の試験および動脈血栓症のメカニズム解明のためのプラットフォームを提供すること。
使用方法
- PDMSおよびフォトリソグラフィを用いたマイクロ流体デバイスの作製。
- フォン・ヴィレブランド因子によるマイクロチャネルの表面コーティング。
- 蛍光バイオマーカーで標識したヘパリン処理済みヒト血液の、狭窄マイクロチャネルへの還流。
- リアルタイム多色蛍光イメージングによる、狭窄部位での血栓形成のモニタリング。
- ImageJを用いた定量的な画像解析による、血栓面積およびバイオマーカー信号強度の測定、ならびに7次元血栓プロファイルの作成。
主な結果
- 本アッセイにより、生体力学的（せん断）条件下における血栓形成の可視化および定量化に成功した。
- 血栓サイズおよび複数のバイオマーカーシグナルを含む7つの主要パラメータを同時に測定した。
- 血小板の集積、フィブリノゲン、フォン・ウィレブランド因子、P-セレクトイン、ホスファチジルセリン、およびインテグリン活性化について、それぞれ異なるプロファイルを作成した。
- 本手法により、血栓形成の経時的な連続モニタリングおよび定量分析が可能となった。
結論
- この血栓プロファイリングアッセイは、バイオメカニカルな血栓形成の評価における重要な空白を埋めるものです。
- 血栓形成リスクの評価および抗血栓薬のスクリーニングのための包括的なツールを提供します。
- この手法は、臨床診断や動脈血栓症のメカニズム研究に向けてさらに発展させることが可能です。
よくある質問
産業界における重要性
バイオメカニカルな血栓形成は、従来のアッセイでは動脈剪断条件下での血栓形成の複雑性を十分に捉えられないことが多いため、心血管系の創薬における重大な課題となっています。マイクロフルイディクスに基づいた血栓プロファイリングアッセイは、血栓のサイズ、組成、および血小板活性化の包括的かつ定量的な特性評価を可能にし、初期段階の抗血栓薬評価における予測の信頼性を直接的に向上させます。本プラットフォームは、動脈血栓症を標的とする候補治療薬に対してメカニズム的な知見と堅牢なリスクアセスメントを提供することで、ポートフォリオの意思決定を促進します。
バイオ医薬品R&Dにおける戦略的応用
初期探索およびターゲットバリデーション
- 動脈血栓症を駆動するバイオメカニカルな経路の解析を可能にします。
- 血小板の活性化および凝集に関与するターゲットの機能的検証をサポートします。
- 複数の血栓バイオマーカーを同時に定量することで、メカニズム的なリスク低減を促進します。
- 抗血栓薬候補の選別における予測信頼性を向上させます。
スクリーニングおよびアッセイ開発
- 抗血栓化合物のハイスループット・ハイスルーコンテンツスクリーニング用に検証済みのマイクロ流体システムを構築します。
- 標準化され、再現性のある定量的なマルチパラメトリック・リードアウトを提供します。
- 生理学的に適切なせん断条件下で、化合物の有効性をプラットフォームベースで拡張可能な形で評価することを可能にします。
- 血栓形成およびバイオマーカー発現に対する化合物の影響を信頼性高く比較することを支援します。
トランスレーショナル・前臨床研究
- in vitroでの血栓形成を、疾患に関連する動脈剪断プロファイルに適合させます。
- 創薬から前臨床検証への連続性を確保するための、トランスレーショナルなバイオマーカーデータを提供します。
- 包括的な血栓プロファイリングに基づいた、リスク調整済みの開発進展判断を可能にします。
- ヒトの病理に関連する動脈血栓症のメカニズム研究をサポートします。
パイプラインおよびワークフローの統合
本アッセイは、創薬から前臨床段階までの連続的なプロセスに組み込まれており、抗血栓薬開発における初期のメカニズム研究とトランスレーショナルなバイオマーカー検証を橋渡しするものです。
- 探索生物学：仮説検証および生物学的リスク低減のため、血栓形成の生体力学的トリガーと経路を定量化します。
- スクリーニング：生理学的に適切な状況下での化合物評価に、再現性のある定量的なアウトプットを提供します。
- 分析：7次元の血栓プロファイルを生成し、異なる条件や化合物間での堅牢な統計的比較を可能にします。
- トランスレーショナルリサーチ：前臨床段階の連続性を確保するため、in vitroでの知見を疾患に関連する動脈血栓症のメカニズムと整合させます。
- エンタープライズ再利用：多様な抗血栓薬の研究開発プログラムに適応可能な、再利用可能なマイクロ流体およびイメージングプラットフォームを確立します。
運用および企業への影響
- 科学的価値： 抗血栓標的のバリデーションにおける予測信頼性を高め、メカニズム的な曖昧さを軽減します。
- 運用的価値： 多パラメータによる血栓解析を標準化し、スケールアップさせることで、プログラム間での比較可能性を確保します。
- 戦略的価値： 根拠に基づいた go/no-go 判断を可能にし、資本効率の高いポートフォリオ推進を実現します。
- ポートフォリオへの影響： 包括的なメカニズムデータに基づき、リスク調整後の抗血栓候補化合物の優先順位付けを支援します。
実施上の検討事項
- マイクロ流体デバイス、蛍光イメージング、および定量的画像解析の専門知識が必要です。
- マイクロファブリケーション設備やマルチチャンネル蛍光顕微鏡などの専門的な装置へのアクセスが求められます。
- アッセイプロトコルおよびデータ解析ワークフローのチーム間での標準化が必要です。
- トランスレーショナルな妥当性を確保するため、異なる血液源や疾患モデルへの適応が必要になる場合があります。
- 多次元的な血栓プロファイルを解釈するために、堅牢な統計解析に依存します。
