血栓プロファイリングアッセイ:生体力学的血栓形成を包括的に特徴づけるためのマイクロ流体ベースのプラットフォーム
January 9th, 2026
本研究は、せん断応力を用いて血液中の血栓形成を誘発し、多次元読み取りによって血栓を特徴付けるマイクロ流体アッセイを記述しています。このアッセイは血液サンプルの血栓促進傾向を測定できるため、疾患診断、薬剤開発、さらには血栓症に関連する基本的なメカニズム研究に役立ちます。
私たちは血栓症の生体力学的特性を十分に捉え、さらに人間の血栓前異常を検出できる新しい手法を開発しました。まず、シリコンウェハーを使って設計に基づいて標準的なフォトリソグラフィーでSU8フォトレジストマスターモールドを製作し、マスターモールドを15センチのペトリ皿の底にテープで固定します。ポリジメチルシロキサン(PDMS)混合物は、シリコーンエラストマーキットのプレポリマーベースと硬化剤を10対1の重量比で混合して調製します。
PDMS混合液をマスターモールドに注ぎます。次に、PDMS混合物を含むプレートを真空乾燥器に入れて脱ガスします。PDMS混合物を75度に設定したインキュベーターに2時間熱的に硬化させます。
インキュベーターからサンプルを取り出した後、マスターモールドから硬化したPDMSを慎重に切り出し、硬化したPDMSを個々のチップユニットに区切る。プローブニードルを使って指定された場所に穴を開け、入口と出口を作ります。化学フードでは、75%エタノール湿潤作業用ワイプでガラススライドを洗浄し、乾燥させます。
次に、高周波発生器を使い、ガラススライドを30秒、PDMSチップを20秒処理します。各チップをガラススライドに合わせ、チップを優しくガラススライドの表面に押し付けて固定します。次に、150度に設定したオーブンで15分間熱接着します。
接合後は、室温のホコリのない環境で保管してください。次に、ピンサーを使ってプローブニードルのプラスチック部分を取り除き、金属管を90度曲げてマイクロ流体装置のコネクターを作ります。アレクサフルオリンでフィブリノーゲンと必要な抗体の共役反応を設定した後、1,100Gで精製カラムを2分間遠心分離し、貯蔵バッファーを取り出します。
流を廃棄した後、反応溶液を適合する収集バイアルに取り付けられた精製カラムに搭載し、遠心分離機で1,100Gで5分間必要な混合物を収穫します。分光光度計を用いて、タンパク質の吸収度と染料信号を測定します。タンパク質濃度と蛍光対タンパク質のモル比を計算します。
染料は暗闇で摂氏4度の温度で保存してください。タイロードバッファーにヘパリンを最終濃度10ミリリットルあたり0.32単位/ミリリットルに加え、pH7.4で500マイクロリットルのタイロードバッファーを吸引して注射器を準備します。ヘパリン入り注射器で静脈穿刺で血液を採取した後、15ミリリットルの遠心分離管に移し、37度の温度に保ちます。
フォン・ヴィレブランド因子モノマーをPBSで1ミリリットルあたり2マイクログラムに希釈します。マイクロ流体デバイスに希釈したフォン・ヴィレブランド因子モノマーをプリコーティングし、室温で1時間培養します。次に蛍光センサーセット1またはセット2で血液サンプルを室温で10分間培養します。
次に、マイクロ流体装置とインレットコネクター、チューブを接続します。インレットコネクターのもう一方の端をPBS入りのチューブに接続し、もう一方の端を注射器に接続します。注射器をシリンジポンプに取り付け、マイクロ流体装置を倒立顕微鏡に取り付けます。
顕微鏡ステージを手動で操作して狭窄部位を特定します。マイクロ流体チャネルとチューブにPBSを注入し、シリンジポンプで毎分0.5ミリリットルの流量で満たします。狭窄部位の周囲に気泡がないか、機器を点検してください。
インレットチューブを血液サンプルに接続し、シリンジポンプを使ってマイクロフルイドチャネルを通じて血液サンプルを0.018ミリリットル毎分の流量で灌流します。逆立顕微鏡では、ソフトウェア内の各蛍光チャネルの露光時間とゲインを設定します。4つのチャネルを交互に使い、1個ずつフルオロ4を励起させることでリアルタイムの多色蛍光イメージングを行います。
フォーカス面を血栓に合わせ、狭窄部位で蛍光信号を15〜30分間記録します。データ解析の場合は、ImageJバージョン1.53を使ってデータファイルを開きます。SZ 22 fit Cチャネルを使って血栓の輪郭を特定してください。
次にポリゴン選択を使い、血栓の大まかな領域を選択します。各チャンネルで、画像を選択し、「調整」を選択し、その後「しきい値」を選択してバックグラウンド信号を除去します。最後に、「分析」を選択し「測定」を選択して、血栓内の面積と平均信号強度を測定します。
代表的なスナップショットでは、健康な血液中狭窄チャネル内で血栓が形成され、血小板、フィブリノーゲン、フォン・ヴィレブランド因子、P-セレクチンがセンサーセット1で可視化され、血小板、ホスファチジルセリン、E陽性インテグリンαIIbβ3、活性化されたインテグリンαIIbベータ3がセンサーセット2で可視化されました。単一の蛍光チャネル画像を処理し、血栓領域を選択し、背景信号を除去し、信号面積と平均輝度を測定して定量解析を行いました。蛍光信号強度の連続解析により、血栓形成中の血小板蓄積の信号対時間曲線が生成されました。
各時刻点について、センサーセット1の4つのバイオマーカー、センサーセット2の4つのバイオマーカーの合計信号強度が取得されました。血栓の大きさを計算し、7次元の血栓プロファイルを生成しました。現在、ヒト患者の血栓促進傾向を評価するバイオアッセイは存在せず、私たちの研究はこのギャップを埋めようとしています。
血液サンプルの生体力学的活性を検出することで、被験者の血栓促進特性を包括的に評価できます。本アッセイは患者の血栓前傾向を検出するための臨床試験として開発可能であり、次世代抗血栓薬のスクリーニングにも利用可能です。
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Overview
This article presents a novel thrombus profiling assay that integrates microfluidics with multi-color fluorescence imaging to comprehensively characterize biomechanical thrombogenesis. The method enables detailed analysis of thrombus formation under arterial shear conditions, providing seven distinct readouts related to thrombus size, composition, and platelet activation. This assay addresses the need for a robust bioassay to evaluate prothrombotic tendencies in humans and assess the efficacy of anti-thrombotic agents.
Key Study Components
Area of Science
- Hematology
- Bioengineering
- Microfluidics
- Thrombosis research
Background
- Thrombosis involves abnormal accumulation of platelets and clotting factors in blood vessels.
- Arterial thrombosis is often linked to elevated shear stress due to arterial stenosis.
- Biomechanical factors, such as blood flow, play a critical role in thrombus formation.
- Existing assays have not fully captured the biomechanical aspects of thrombogenesis.
Purpose of Study
- To develop an assay that profiles biomechanical thrombogenesis in detail.
- To enable comprehensive evaluation of prothrombotic tendencies in human blood samples.
- To provide a platform for testing anti-thrombotic agents and understanding arterial thrombosis mechanisms.
Methods Used
- Fabrication of microfluidic devices using PDMS and photolithography.
- Surface coating of microchannels with von Willebrand factor.
- Perfusion of heparinized human blood labeled with fluorescent biomarkers through stenotic microchannels.
- Real-time multi-color fluorescence imaging to monitor thrombus formation at the site of stenosis.
- Quantitative image analysis using ImageJ to measure thrombus area, biomarker signal intensity, and generate seven-dimensional thrombus profiles.
Main Results
- The assay successfully visualized and quantified thrombus formation under biomechanical (shear) conditions.
- Seven key parameters, including thrombus size and multiple biomarker signals, were measured simultaneously.
- Distinct profiles were generated for platelet accumulation, fibrinogen, von Willebrand factor, P-selectin, phosphatidylserine, and integrin activation.
- The method enabled continuous monitoring and quantitative analysis of thrombus development over time.
Conclusions
- This thrombus profiling assay fills a critical gap in evaluating biomechanical thrombogenesis.
- It offers a comprehensive tool for assessing prothrombotic risk and screening anti-thrombotic drugs.
- The approach can be further developed for clinical diagnostics and mechanistic studies of arterial thrombosis.
