RNA関連クロマチンDNA-DNA相互作用法

私たちは、特定のRNA分子によって組織されたクロマチン接触をマッピングするために、RNA関連クロマチンDNA-DNA相互作用法(RDD法)を開発しました。RDDは、内因性および外因性RNA間でRNA特異的クロマチンバンディングおよび長距離相互作用を強固にマッピングします。まず、ショウジョウバエS2二重架橋細胞由来の透過核ペレットを、トリトンX-100を含む0.1%FA溶解バッファー15ミリリットに再懸濁させます。

1.5ミリリットルの核懸濁液を14ミリリットルの丸底試験管にアリコートし、気泡形成を避けます。30秒オン・30秒オフサイクルで、振幅38%で4.5分間サスペンションをソニック処理します。超音波処理されたクロマチンを15ミリリットルのチューブに集め、3,200gの遠心分離機で室温で20分間浸します。

約13ミリリットルの上清液を新しい15ミリリットルのチューブに移します。次に、超音波処理クロマチンを含むチューブに準備済みのストレプトビジンC1ビーズ1を100マイクロリットル加え、室温で20分間回転させます。その後、チューブを磁気ラックに1分間置き、クリアされたクロマチンを含む上清液を新しい50ミリリットルチューブに移します。

分析のために10マイクロリットルのアリコートをマイナス20度の温度で保存してください。新たに調製したハイブリダイゼーションバッファー26ミリリットルと、事前にクリアされたクロマチン13ミリリットルを室温で30分間ローテーター上で培養します。次に、ハイブリダイゼーション混合物を3本の15ミリリットル管に分割し、各サンプルに100マイクロモルのビオチニル化プローブを6マイクロリットル追加します。

チューブキャップをフィルムで密封した後、一晩37度でチューブを回転させます。ストレプタビジンC1ビーズをブロッキングした後、ブロッキングバッファーを取り出し、400マイクロリットルのハイブリダイゼーションバッファーに再懸浮させます。次に、ブロッキングバッファー処理ストレプタビジンC1ビーズを、事前に準備したハイブリダイズドクロマチンに加えます。

混合液を室温で2.5時間回転させます。上澄液を捨て、ビーズを1.5ミリリットルのチューブに移した後、800マイクロリットルのウォッシュバッファーでビーズを5回洗浄し、その後TEバッファーで2回洗浄します。最終洗浄後、上清液を捨て、1Xプロテアーゼ阻害剤を含むTEバッファー1,000マイクロリットルに室温で再懸浮させます。

プローブ-クロマチン複合体に結合したストレプタビジンC1ビーズの空位をブロッキングするには、変性IPBを220マイクロリットル追加し、室温で15分間チューブを回転させます。培養後、ステレプタビジンC1ビーズをTEバッファーで5回洗浄します。次に、ストレプタビジンC1ビーズのクロマチンに693マイクロリットルのエンドリペアミックスを加え、よく混ざります。

次に、T4 DNAポリメラーゼを7マイクロリットル追加します。混合物をサーモミキサーで毎分800回転、摂氏12度で30分間孵化します。その後、サンプルを16度のミキサーで15分間培養します。

ビーズを800マイクロリットルの氷冷のChIA-PETバッファーで3回洗い、その後TEバッファーで1回洗います。次に、ストレプタビジンC1ビーズのクロマチンに693マイクロリットルのAテールミックスを加え、よく混ざります。次に、クレノウフラグメントを3プライムから5プライムのマイナスまで7マイクロリットル追加します。

チューブをミキサーで12回転毎分、37度で50分間孵化します。ビーズは800マイクロリットルの氷で冷えたChIA-PETバッファーで3回洗浄し、その後優しくピペットで洗い流出バッファーを1回洗います。次に、ストレプタビジンC1ビーズのクロマチンに1,390マイクロリットルの近接結紮ミキオンを加え、室温のミキサーで5分間培養します。

混合物にT4 DNAリガーゼ10マイクロリットルを加え、室温で毎分20回転で5分間培養し、その後室温で毎分12回転に切り替えて50分間、16度で一晩培養を続けます。次に、800マイクロリットルの氷冷ChIA-PETバッファーでビーズを3回洗い、TEバッファーで2回洗います。クロマチン放出には、ストレプタビジンC1ビーズのクロマチンにLC ChIP洗脱バッファー480マイクロリットルを加え、よく混ぜます。

脱架連結のために20ミリグラム/ミリリットルのプロテインナーゼKを20マイクロリットル追加します。チューブを毎分950回転、65度の温度でサーモミキサーで一晩培養し、その後フェノール:クロロホルム:イソアミルアルコール試薬で近接結合DNAを精製します。Tn5タグメンテーション試験に必要なすべての成分を、PCRチューブの氷上に50マイクロリットルの反応体積で加えます。

タグメンテーション反応を55度Cで10分間、蓋を70度に設定したサーモサイクラーで培養し、その後4度で維持します。タグメントされたDNAに50マイクロリットルのChIPイリューションバッファーと1マイクロリットルのプロテイナーゼKを加えます。溶液を混ぜ、サーモミキサーで65度C、毎分900回転で30分間培養します。

DNA精製キットでDNAを精製し、自動毛細管電気泳動システムでDNAを定量します。断片化された結合済みDNAをすべてブロッキングバッファーとゲノムDNAであらかじめブロッキングしたM280ビーズに加え、懸濁液を混合します。チューブを室温のミキサーで45分間回転させます。

短時間回転した後、チューブを磁気ラックに置き、上清液を捨てます。洗浄の手順の後、混合せずにビーズに30マイクロリットルの洗脱バッファーを加えます。DNAライブラリーの調製キットに従ってPCRミックスを準備します。

PCRチューブをPCRマシンに移し、増幅プログラムをセットアップします。最後に、磁気ビーズでPCR産物を精製した後、核酸定量器を使って10〜30ナノグラムのライブラリーDNAを測定し、シーケンス準備を行います。超音波処理されたクロマチン断片は約1,000塩基対から3,000塩基対の範囲であり、断片化が成功したことを示しています。

RNA関連クロマチンは約1,000塩基対から3,000塩基対の範囲を示しました。Tn5で標識されたクロマチンは、クロマチンのタグメンテーション効率を示す断片分布を示しました。増幅後のシーケンシングライブラリは、約180塩基対から1,000塩基対の範囲の断片サイズ分布を示しました。

サイズ選択後、配列ライブラリ断片は主に約250から600塩基対の範囲で濃縮されました。RNA関連クロマチンDNA-DNA相互作用(RDD法)は、NC RNA roX2および7SK結合のゲノム位置と、対応する遠隔クロマチン相互作用ループを検出しました。RNAポリメラーゼII ChIA-PETのデータから、これらのNC RNAと遺伝子発現の間に明確な調節関係があり、ピークは相互作用の強さを示しています。

多次元解析は、HDDアンカーされた相互作用とHi-Cゲノム全クロマチン立体構造マップおよびエピゲノムマーク、新生転写、RNAポリメラーゼII ChIA-PETデータを統合することで実現されました。これらの領域では、位相的に関連するドメインが明確に可視化され、RNA誘導クロマチンループがその境界に位置したり複数のドメインにまたがったりすることが多かった。さらに、RNA中心の調節ハブも決定されました。

RDD法および定型クロマチン相互作用によるRNA結合部位および関連するDNA-DNA相互作用の3次元ゲノム組織の解析。主な教えは、適切なプローブ、リンカー、クロマチン比率を維持し、ポリメラーゼ結合前に自然ビオチンで無制限ストレプトビジン部位を遮断することです。今後の研究では、RNAが発生、摂動、感染を通じてクロマチン相互作用をどのように動的に巻き上げるかを探ることができます。