RNA関連クロマチンDNA-DNA相互作用法
2026年4月30日
ここでは、RNA関連のクロマチンDNA-DNA相互作用をキャプチャし、RNA関連の三次元ゲノム組織をマッピングするプロトコルを提示します。
私たちは、特定のRNA分子によって組織されたクロマチン接触をマッピングするために、RNA関連クロマチンDNA-DNA相互作用法(RDD法)を開発しました。RDDは、内因性および外因性RNA間でRNA特異的クロマチンバンディングおよび長距離相互作用を強固にマッピングします。まず、ショウジョウバエS2二重架橋細胞由来の透過核ペレットを、トリトンX-100を含む0.1%FA溶解バッファー15ミリリットに再懸濁させます。
1.5ミリリットルの核懸濁液を14ミリリットルの丸底試験管にアリコートし、気泡形成を避けます。30秒オン・30秒オフサイクルで、振幅38%で4.5分間サスペンションをソニック処理します。超音波処理されたクロマチンを15ミリリットルのチューブに集め、3,200gの遠心分離機で室温で20分間浸します。
約13ミリリットルの上清液を新しい15ミリリットルのチューブに移します。次に、超音波処理クロマチンを含むチューブに準備済みのストレプトビジンC1ビーズ1を100マイクロリットル加え、室温で20分間回転させます。その後、チューブを磁気ラックに1分間置き、クリアされたクロマチンを含む上清液を新しい50ミリリットルチューブに移します。
分析のために10マイクロリットルのアリコートをマイナス20度の温度で保存してください。新たに調製したハイブリダイゼーションバッファー26ミリリットルと、事前にクリアされたクロマチン13ミリリットルを室温で30分間ローテーター上で培養します。次に、ハイブリダイゼーション混合物を3本の15ミリリットル管に分割し、各サンプルに100マイクロモルのビオチニル化プローブを6マイクロリットル追加します。
チューブキャップをフィルムで密封した後、一晩37度でチューブを回転させます。ストレプタビジンC1ビーズをブロッキングした後、ブロッキングバッファーを取り出し、400マイクロリットルのハイブリダイゼーションバッファーに再懸浮させます。次に、ブロッキングバッファー処理ストレプタビジンC1ビーズを、事前に準備したハイブリダイズドクロマチンに加えます。
混合液を室温で2.5時間回転させます。上澄液を捨て、ビーズを1.5ミリリットルのチューブに移した後、800マイクロリットルのウォッシュバッファーでビーズを5回洗浄し、その後TEバッファーで2回洗浄します。最終洗浄後、上清液を捨て、1Xプロテアーゼ阻害剤を含むTEバッファー1,000マイクロリットルに室温で再懸浮させます。
プローブ-クロマチン複合体に結合したストレプタビジンC1ビーズの空位をブロッキングするには、変性IPBを220マイクロリットル追加し、室温で15分間チューブを回転させます。培養後、ステレプタビジンC1ビーズをTEバッファーで5回洗浄します。次に、ストレプタビジンC1ビーズのクロマチンに693マイクロリットルのエンドリペアミックスを加え、よく混ざります。
次に、T4 DNAポリメラーゼを7マイクロリットル追加します。混合物をサーモミキサーで毎分800回転、摂氏12度で30分間孵化します。その後、サンプルを16度のミキサーで15分間培養します。
ビーズを800マイクロリットルの氷冷のChIA-PETバッファーで3回洗い、その後TEバッファーで1回洗います。次に、ストレプタビジンC1ビーズのクロマチンに693マイクロリットルのAテールミックスを加え、よく混ざります。次に、クレノウフラグメントを3プライムから5プライムのマイナスまで7マイクロリットル追加します。
チューブをミキサーで12回転毎分、37度で50分間孵化します。ビーズは800マイクロリットルの氷で冷えたChIA-PETバッファーで3回洗浄し、その後優しくピペットで洗い流出バッファーを1回洗います。次に、ストレプタビジンC1ビーズのクロマチンに1,390マイクロリットルの近接結紮ミキオンを加え、室温のミキサーで5分間培養します。
混合物にT4 DNAリガーゼ10マイクロリットルを加え、室温で毎分20回転で5分間培養し、その後室温で毎分12回転に切り替えて50分間、16度で一晩培養を続けます。次に、800マイクロリットルの氷冷ChIA-PETバッファーでビーズを3回洗い、TEバッファーで2回洗います。クロマチン放出には、ストレプタビジンC1ビーズのクロマチンにLC ChIP洗脱バッファー480マイクロリットルを加え、よく混ぜます。
脱架連結のために20ミリグラム/ミリリットルのプロテインナーゼKを20マイクロリットル追加します。チューブを毎分950回転、65度の温度でサーモミキサーで一晩培養し、その後フェノール:クロロホルム:イソアミルアルコール試薬で近接結合DNAを精製します。Tn5タグメンテーション試験に必要なすべての成分を、PCRチューブの氷上に50マイクロリットルの反応体積で加えます。
タグメンテーション反応を55度Cで10分間、蓋を70度に設定したサーモサイクラーで培養し、その後4度で維持します。タグメントされたDNAに50マイクロリットルのChIPイリューションバッファーと1マイクロリットルのプロテイナーゼKを加えます。溶液を混ぜ、サーモミキサーで65度C、毎分900回転で30分間培養します。
DNA精製キットでDNAを精製し、自動毛細管電気泳動システムでDNAを定量します。断片化された結合済みDNAをすべてブロッキングバッファーとゲノムDNAであらかじめブロッキングしたM280ビーズに加え、懸濁液を混合します。チューブを室温のミキサーで45分間回転させます。
短時間回転した後、チューブを磁気ラックに置き、上清液を捨てます。洗浄の手順の後、混合せずにビーズに30マイクロリットルの洗脱バッファーを加えます。DNAライブラリーの調製キットに従ってPCRミックスを準備します。
PCRチューブをPCRマシンに移し、増幅プログラムをセットアップします。最後に、磁気ビーズでPCR産物を精製した後、核酸定量器を使って10〜30ナノグラムのライブラリーDNAを測定し、シーケンス準備を行います。超音波処理されたクロマチン断片は約1,000塩基対から3,000塩基対の範囲であり、断片化が成功したことを示しています。
RNA関連クロマチンは約1,000塩基対から3,000塩基対の範囲を示しました。Tn5で標識されたクロマチンは、クロマチンのタグメンテーション効率を示す断片分布を示しました。増幅後のシーケンシングライブラリは、約180塩基対から1,000塩基対の範囲の断片サイズ分布を示しました。
サイズ選択後、配列ライブラリ断片は主に約250から600塩基対の範囲で濃縮されました。RNA関連クロマチンDNA-DNA相互作用(RDD法)は、NC RNA roX2および7SK結合のゲノム位置と、対応する遠隔クロマチン相互作用ループを検出しました。RNAポリメラーゼII ChIA-PETのデータから、これらのNC RNAと遺伝子発現の間に明確な調節関係があり、ピークは相互作用の強さを示しています。
多次元解析は、HDDアンカーされた相互作用とHi-Cゲノム全クロマチン立体構造マップおよびエピゲノムマーク、新生転写、RNAポリメラーゼII ChIA-PETデータを統合することで実現されました。これらの領域では、位相的に関連するドメインが明確に可視化され、RNA誘導クロマチンループがその境界に位置したり複数のドメインにまたがったりすることが多かった。さらに、RNA中心の調節ハブも決定されました。
RDD法および定型クロマチン相互作用によるRNA結合部位および関連するDNA-DNA相互作用の3次元ゲノム組織の解析。主な教えは、適切なプローブ、リンカー、クロマチン比率を維持し、ポリメラーゼ結合前に自然ビオチンで無制限ストレプトビジン部位を遮断することです。今後の研究では、RNAが発生、摂動、感染を通じてクロマチン相互作用をどのように動的に巻き上げるかを探ることができます。
概要
RNA関連クロマチンDNA-DNA相互作用法（RDD）は、特定のRNAによって固定されたクロマチン相互作用をマッピングするための標的アプローチです。この手法により、標的RNAに関連するゲノム領域の同定と、これらの領域間における長距離のDNA-DNAコンタクトの解明を同時に行うことが可能となり、ゲノムの空間的組織化および調節メカニズムに関する知見が得られます。
研究の主要構成要素
科学分野
- ゲノミクス
- エピジェネティクス
- 分子生物学
背景
- クロマチンの相互作用は、遺伝子調節およびゲノム構造において極めて重要な役割を果たしています。
- コーディングおよび非コーディングタイプを含むRNAは、クロマチンを組織化し、遺伝子発現に影響を与えることができます。
- 既存の手法では、RNAによって特異的に固定されたクロマチン相互作用をマッピングする能力が不足していることが多いです。
- RNA介在性のクロマチン組織化を理解することは、調節ネットワークを解析する上で不可欠です。
研究目的
- 特定のRNAによってアンカーされるクロマチン相互作用をマッピングするための堅牢な手法を開発すること。
- RNAに関連するゲノム領域およびその空間的な接触を、高解像度で同定することを可能にすること。
- RNAが介在するエンハンサー・プロモーターのペアリングおよび遠距離の遺伝子調節に関する研究を促進すること。
使用方法
- RNA-クロマチン複合体を濃縮するための、標的RNAに相補的なビオチン化アンチセンスプローブの使用。
- 細胞の架橋、クロマチンの断片化、および末端修復。
- 設計されたリンカーを用い、捕捉された複合体内の空間的に隣接するDNA断片を結合させる近接ライゲーション。
- ライゲーション産物の精製、シーケンスライブラリの調製、およびハイスループットシーケンシング。
- RNAアンカークロマチン相互作用マップを作成するためのバイオインフォマティクス解析。
主な結果
- RDDにより、RNAによって固定されたクロマチン接触の高解像度な遺伝子座特異的マッピングが可能になります。
- 本手法は、ウイルスや微生物由来のものを含む、内因性および外因性の両方のRNAに適用可能です。
- RDDは、多様な細胞型および実験条件と互換性があります。
- ワークフローは堅牢かつ再現性が高く、制御研究に有用な詳細な接触プロファイルを得ることができます。
結論
- RDDは、調節RNAに関連する三次元ゲノム構造を解析するための強力なツールを提供します。
- 本手法は、RNAがどのようにクロマチンを組織化し、遺伝子発現を調節しているかという理解を深めます。
- RDDは、エンハンサー・プロモーター相互作用や長距離ゲノム調節の研究に幅広く適用可能です。
よくある質問
産業上の重要性
RNA関連クロマチンDNA-DNA相互作用法（RDD）により、バイオ医薬品の研究開発チームは、特定のRNAによって固定されたクロマチンの相互作用をマッピングすることができ、調節ゲノム構造に関する高解像度の知見を得ることが可能です。この機能は、特にRNAを介した調節経路において、初期の創薬探索および前臨床の転換点におけるメカニズムのデリスキングとターゲットバリデーションを支援します。RDDは、多様な細胞種、および内因性・外因性双方のRNAと互換性があるため、複雑な疾患モデルや宿主-病原体研究におけるポートフォリオとしての有用性が高まっています。
バイオファーマR&Dにおける戦略的応用
初期探索およびターゲットバリデーション
- RNAを介した調節機構および空間的なゲノム組織化の解析を可能にします。
- RNAに関連するクロマチン接点をマッピングすることで、機能的なターゲットの検証をサポートします。
- RNAおよびクロマチン修飾ターゲットにおけるメカニズム的なリスク低減を促進します。
- ターゲット選択における予測の信頼性を高めるための、遺伝子座特異的なデータを提供します。
スクリーニングおよびアッセイ開発
- ダウンストリームのスクリーニングワークフローに向けた、検証済みのクロマチン相互作用マップを調製します。
- アッセイの標準化に不可欠な、再現性と定量性のあるコンタクトプロファイルを提供します。
- コーディングRNAおよび非コーディングRNAターゲットの両方で、プラットフォームの再利用を可能にします。
- RNA-クロマチン相互作用に影響を与える化合物の信頼性の高い評価をサポートします。
トランスレーショナル・前臨床研究
- 多様な細胞型における調節RNA相互作用をマッピングすることで、疾患関連システムとの整合性を図ります。
- RNA介在性パスウェイの発見から前臨床検証までの継続的なプロセスを提供します。
- RNA標的治療薬における、リスク調整に基づいた開発進展の意思決定を可能にします。
- 高解像度のクロマチン接触プロファイリングを通じて、バイオマーカーの同定を支援します。
パイプラインおよびワークフローの統合
RDDは、初期のメカニズム研究から前臨床モデルのバリデーションに至るまでのディスカバリー・コンティニュアム（発見の連続体）に組み込まれており、ターゲットの同定とトランスレーショナルリサーチの両方を支援します。
- 探索生物学：RNAを起点とするクロマチン相互作用を明らかにし、調節経路を解明して生物学的仮説のリスクを低減します。
- スクリーニング：アッセイ開発および化合物スクリーニングに不可欠な、定量的で再現性のあるコンタクトマップを提供します。
- 分析：異なる条件下におけるクロマチンコンタクトの比較解析のための、高解像度シーケンシングデータを生成します。
- トランスレーショナルリサーチ：初代細胞やモデルシステムにおいて、疾患に関連するRNA相互作用のマッピングを可能にします。
- 企業での再利用：多様なRNAおよびクロマチン研究アプリケーションに適用可能な、堅牢で適応性の高いワークフローを提供します。
運用および企業への影響
- 科学的価値：RNA介在性調節における予測の信頼性を向上させ、メカニズム的な曖昧さを軽減します。
- 運用の価値：標準化され、拡張可能で再現性のあるクロマチン相互作用マッピングを提供します。
- 戦略的価値：調節メカニズムを早期に明確にすることで、Go/No-go決定と資本効率を改善します。
- ポートフォリオへの影響：RNAおよびクロマチン修飾ターゲットのリスク調整済み優先順位付けをサポートします。
実施上の検討事項
- クロマチン生物学、RNA生化学、および次世代シーケンシングの専門知識が必要である。
- ハイスループットシーケンシングおよびバイオインフォマティクスのインフラストラクチャへのアクセスが必要である。
- プローブ設計およびデータ解析におけるチーム間の標準化が求められる。
- プロトコルの最適化により、さまざまな細胞型や実験条件に適応可能である。
- 解像度と再現性は、プローブの特異性とシーケンシング深度に依存する。
バイオファーマに関するよくある質問
Chapters in this video
0:00
Introduction
0:25
Chromatin Fragmentation and Preclearing with Streptavidin C1 Beads
1:51
Chromatin-RNA Probe Hybridization and Immobilization on Streptavidin C1 Beads
3:42
On-Bead Chromatin End-Repair and A-Tailing
4:59
Chromatin Proximity Ligation and Release from the Streptavidin C1 Beads
6:22
Tn5 Tagmentation of Proximity-Ligated DNA
7:19
Immobilization and PCR Amplification of Ligated DNA on M280 Beads
8:23
Results
10:18
Conclusion
