薬物治療後の肝細胞癌オルガノイドの生成および単細胞トランスクリプトミック解析
2026年5月26日
本プロトコルは、肝細胞がんオルガノイドの生成、薬物治療の適用、治療前後の単細胞RNAシーケンスの簡潔化方法を概説し、治療関連の転写変化を特徴付けます。
HCCオルガノイドが薬物治療にどのように反応するか、そしてそのトランスレーショナル研究が職場でどのように変化するかに焦点を当てています。このプロトコルはHCCオルガノイドに有用であり、他の腫瘍オルガノイドシステムにも適応可能です。まず、肝細胞がんまたはHCC患者由来のオルガノイドを確立し、治療的摂動のために準備します。
レンバチニブのストック溶液は、製造元の指示に従ってジメチル硫酸(DMSO)で調合してください。使用直前に、凍結液を予温培養培地であらかじめ定めた作業濃度まで希釈します。すべてのウェルで最終体積が均等になるよう十分な溶液を準備し、各ウェルで同じDMSO濃度を確保します。
次に、各ウェルの壁に沿って20マイクロモルのレンバチニブ含有培地を加え、マトリックスドームを乱さないようにします。同じ最終DMSO濃度を持つ車両制御装置も含めてください。オルガノイドを標準培養条件下で、あらかじめ定められた処理期間にインキュベーションします。
72時間を超える処理の場合は、48〜72時間ごとに薬剤含有培地を交換し、すべてのウェルで一貫した交換スケジュールを確保してください。治療前に明視野の基準画像を記録してください。同じ顕微鏡設定、倍率、視野位置を用いて、治療中は一定間隔で画像を取得します。
形態学に基づく治療反応評価には、すべての画像に対して同一の露光設定、拡大率および分析閾値を用いてください。各時刻点における井戸またはフィールドごとの総オルガノイド面積を計算し、基準値に正規化してオルガノイド面積成長曲線を測定します。平均オルガノイド直径を測定するには、個々の完全なオルガノイドの直径を測定し、井戸ごとの平均値を計算します。
次に、形態学的に識別可能な完全なオルガノイドを数え、破片や崩壊した破片を除外して生存するオルガノイド数を決定します。製造元の指示に従って追加のバルク生存評価が必要な場合は、治療エンドポイントで三次元発光生存性アッセイを実施してください。次に、オルガノイド面積の成長曲線を時間経過でプロットします。
車両処理群とレンバチニブ処理群の平均オルガノイド直径を比較します。また、処理群間で生存するオルガノイド数を比較してください。再現性を確保するために、一貫した画像スケジュール、選択基準、解析パラメータを用いること。
3D形態が完全なオルガノイドウェル、単一細胞捕捉に十分な材料、目に見える汚染がないオルガノイドウェルを選びます。分離前に同一の顕微鏡設定、倍率、視野選択基準を用いて、各選択対象の明視野画像を記録します。対照群と処理群の一致した時間点でオルガノイドを採取しつつ、すべてのサンプルで同一のプレート密度、処理スケジュール、中間置換条件を維持します。
各ウェルから培養培地を完全に吸引してください。各井戸を氷冷PBSで2回洗い、残留中の培地やゴミを取り除きます。各ウェルに氷で冷たい細胞回収液を1ミリリットル加え、氷上で20〜30分間培養します。
培養中はマトリックス溶解を促進するために、5〜7分ごとに優しくピペットを動かします。溶解物質を広口または切断したピペット先端で予備冷却されたチューブに移し、切断応力を最小限に抑えます。マトリックスがほぼ溶解し、最小限の目に見えるゲル残基が残った後にのみ酵素解離を進めます。
回収したオルガノイド懸濁液を300Gで4度の温度で5分間遠心分離します。ペレットを乱さないように上清液を慎重に除去してください。ペレットを組換え細胞解離酵素1ミリリットルに再懸浮させ、37度で5〜10分間培養します。
ピペットを2〜3分ごとに8〜10回、広口径のP1000チップを使って優しく擦り、解離を促進します。ほとんどのオルガノイド断片が単一細胞に分散し、小さな残留クラスターだけが残った時点で消化を止めます。次に、2%の胎児用牛血清を含む氷で冷たくしたPBSを4ミリリットル加えて消化を止めます。
その後、40マイクロメートルのセルストレーナーで懸濁液をろ過します。残留酵素や凝集体、ゴミを除去するためにPBSで一度洗ってください。トリパンブルー排除を使って細胞数を数えます。
細胞の生存率が85%以上であることを確認した後、最終的な細胞濃度を1マイクロリットルあたり700〜1,200細胞に調整します。過剰な破片、豊富な死細胞、大きな目に見える集合体、または不完全な解離のあるサンプルは除外してください。骨材がある場合は、装填前に再度ろ過してください。
解離酵素、消化時間、ピペッティング頻度、ろ過方法、細胞濃度、ロード戦略を含む同一条件下でのプロセス制御および処理サンプル。最後に、単一セルライブラリ増幅後、単一セルシーケンスを行います。オルガノイドは回復後1日目から6日目まで、標準的な三次元培養条件下で生存し、増殖しました。
初日目にはオルガノイドは小さくコンパクトな構造として現れましたが、6日目にはサイズが大きく、形態が明確に現れました。レンバチニブ処理オルガノイドはDMSO処理対照群に比べてより小さく、形態変化を示しました。定量解析では、レンバチニブ治療後の平均オルガノイド直径がDMSO対照群と比較して減少していることが示されました。
このプロトコルにより、治療後の細胞状態、細胞組成、遺伝子発現の変化を研究することができます。最大の課題は細胞の生存率を維持し、すべてのグループ間で単純な処理を一貫させることです。この手順に従って細胞の下流解析が行われ、クラスタリング、差異遺伝子実験解析、経路富裕解析、トレジャリー推論などが含まれます。
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Overview
This article presents a standardized workflow for generating hepatocellular carcinoma (HCC) organoids, applying drug treatment, and performing single-cell RNA sequencing to analyze transcriptional changes before and after treatment. The protocol is robust, scalable, and adaptable to other tumor organoid systems, enabling detailed characterization of cellular composition and gene expression changes associated with drug exposure.
Key Study Components
Area of Science
- Cancer biology
- Organoid technology
- Single-cell transcriptomics
Background
- Hepatocellular carcinoma is a leading cause of cancer-related deaths worldwide.
- Marked intratumoral heterogeneity in HCC contributes to variable treatment responses and disease progression.
- Understanding transcriptional changes in tumor cells before and after drug treatment is critical for improving therapies.
- Existing workflows connecting organoid-based drug treatment with single-cell transcriptomic profiling are limited.
Purpose of Study
- To develop a reproducible protocol for drug treatment and single-cell RNA sequencing of HCC organoids.
- To enable side-by-side comparison of cellular and transcriptional changes in response to therapy.
- To provide technical guidance for improving reproducibility and sample quality in organoid studies.
Methods Used
- Establishment and expansion of HCC patient-derived organoids.
- Drug treatment with lenvatinib and vehicle control under standardized conditions.
- Imaging and quantitative assessment of organoid morphology, area, diameter, and viability.
- Single-cell dissociation, viability assessment, and preparation for single-cell RNA sequencing.
- Comparative analysis of single-cell transcriptomic data, including clustering and pathway enrichment.
Main Results
- Lenvatinib-treated organoids showed reduced size and altered morphology compared to controls.
- Quantitative analysis revealed a decrease in mean organoid diameter after drug treatment.
- The protocol preserved high cell viability and reproducibility across samples.
- Single-cell RNA sequencing enabled detailed analysis of cell state, composition, and gene expression changes post-treatment.
Conclusions
- The workflow provides a practical and scalable approach for studying drug responses in HCC organoids at single-cell resolution.
- It facilitates robust comparative analysis of transcriptional changes associated with therapy.
- The protocol is adaptable to other organoid systems and supports downstream cellular analyses.
Frequently Asked Questions
Executive Industry Relevance
Single-cell transcriptomic profiling of hepatocellular carcinoma (HCC) organoids before and after drug treatment addresses the challenge of intratumoral heterogeneity and variable therapeutic response. This workflow enables high-resolution analysis of cellular and transcriptional changes, supporting predictive confidence in early-stage oncology discovery. The protocol's scalability and adaptability position it as a reusable platform for portfolio-wide mechanistic de-risking and target validation.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of therapeutic hypotheses by capturing drug-induced transcriptional shifts at single-cell resolution.
- Supports biological de-risking through detailed mapping of cell state and composition changes post-treatment.
- Facilitates functional target validation by linking drug exposure to specific gene expression alterations.
- Provides predictive confidence for triaging candidate compounds based on mechanistic response profiles.
Screening & Assay Development
- Prepares validated organoid systems for downstream screening and quantitative assessment of drug effects.
- Standardizes imaging, viability, and morphological metrics to ensure reproducibility and assay reliability.
- Enables scalable, side-by-side evaluation of compound efficacy using robust, quantitative outputs.
- Supports platform reuse across different tumor organoid models for broader screening applications.
Translational & Preclinical Research
- Aligns in vitro drug response data with disease-relevant cellular heterogeneity observed in patient tumors.
- Provides continuity from discovery through preclinical validation by enabling comparative transcriptomic analysis.
- Supports risk-adjusted advancement decisions by revealing pathway-level and cell-type-specific drug effects.
- Enhances predictive de-risking for translational biomarker identification and validation.
Pipeline & Workflow Integration
This protocol integrates from early discovery through lead identification and preclinical research, bridging drug perturbation studies with high-content single-cell analytics.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by mapping drug-induced gene expression changes.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative readouts for compound evaluation in organoid models.
- Analytics: Enables clustering, differential expression, and pathway enrichment analyses to compare treatment conditions.
- Translational Research: Connects in vitro findings to disease-relevant cellular diversity and biomarker discovery.
- Enterprise Reuse: Provides a standardized, adaptable workflow for repeated use across oncology portfolios.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in drug response studies.
- Operational Value: Delivers standardized, reproducible, and scalable workflows for organoid-based analytics.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision-making and capital efficiency by enabling robust early-stage de-risking.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of oncology assets based on high-content data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in organoid culture, single-cell dissociation, and transcriptomic library preparation.
- Demands access to advanced imaging, cell viability assessment, and single-cell sequencing infrastructure.
- Necessitates strict cross-team standardization of imaging, dissociation, and analysis parameters for reproducibility.
- Adaptable across different tumor organoid systems with attention to model-specific dissociation and viability challenges.
- Sample quality and cell viability are critical limitations that must be managed throughout processing.
