جهاز ميكروفلويديك الانجذاب الكيميائي لقياس تركيز البكتيريا في التدرجات مستقرة

Summary

يصف هذا البروتوكول على تطوير جهاز للتحقيق في ميكروفلويديك الكيميائي الجرثومي في التدرجات تركيز chemoeffectors مستقرة.

Abstract

الكيميائي يسمح البكتيريا لنهج مصادر جاذبة للمواد الكيميائية أو لتجنب مصادر للمواد الكيميائية طارد. رصد البكتيريا باستمرار تركيز chemoeffectors محددة بمقارنة التركز الحالي للتركيز الكشف عن بضع ثوان في وقت سابق. هذه المقارنة يحدد اتجاه صافي الحركة. على الرغم من عدة تدرجات المتنافسة غالبا ما تتعايش في الطبيعة ، والنهج التقليدي للتحقيق الكيميائي الجرثومي غير كافية لقياس الهجرة ردا على التدرجات تركيز الجاذبة والطاردة. هنا ، نحن تصف وضع نموذج لتقديم الكيميائي ميكروفلويديك التدرجات تركيز دقيق وثابت من chemoeffectors للبكتيريا والتحقيق كميا استجابتها لتطبيق التدرج. الجهاز تنوعا في تلك التدرجات تركيز تركيز أي المطلقة المطلوبة وقوة الانحدار يمكن توليدها بسهولة عن طريق خلط ناشر. وأظهر الجهاز باستخدام استجابة

Protocol

1. تصنيع السيليكون سادة باستخدام معيار SU - 8 ضوئيه ¹ (لا يظهر في هذا الفيديو).

1. استخدام معيار SU - 8 طرق ضوئيه لإنشاء SU - 8 "سيد" (SU - 8 2025 ، MicroChem ، نيوتن ، ماجستير) لافتعال PDMS العفن الذي يحتوي على شبكة ميكروفلويديك وغرفة الكيميائي. يمكن أن تكون ملفقة قوالب الرئيسي من هذا القبيل في أي مرفق التصنيع الدقيق (على سبيل المثال ، على microfluidics مسبك ستانفورد ؛ http://thebigone.stanford.edu/foundry/ ).
2. قبل PDMS النسخ المتماثل ، فضح SU - 8 الرئيسي لبخار fluorosilane في مجفف تعلق بمصدر فراغ لتسهيل إطلاق سراح من السهل PDMS من سيد أضف قطرة من fluorosilane على منشفة ورقية وتطبيق فراغ لمدة دقيقة. إزالة فراغا ويسمح لمدة 30 دقيقة لترسب fluorosilane. الحفاظ على SU - 8 الماجستير في حاوية مغلقة لاستخدامها في المستقبل.

2. وتتكون طبقة وطبقة fluidic سيطرة صب متماثلة PDMS من SU - 8 الرئيسي : صب متماثلة PDMS من SU - 8 الرئيسي.

1. مزيج PDMS قبل البوليمر وعبر رابط ، على وزن 10:01. النسبة وديغا في dessicator لمدة 1 ساعة (أو حتى تتم إزالة فقاعات الهواء من خليط PDMS).
2. ضع SU - 8 الماجستير في طبق بتري ويسكب الخليط بعناية PDMS على رأس سيد SU - 8 للسمك المطلوب.
3. تسخين طبق بتري الذي يحتوي على PDMS وSU - 8 القالب الرئيسي عند 80 درجة مئوية لمدة ساعتين لعلاج PDMS.
4. إزالة الشفاء PDMS المغطاة SU - 8 الرئيسية من موقد وقشور العفن PDMS من سيد SU - 8. وسوف تكون جزءا لا يتجزأ من هيكل المطلوب في PDMS العفن.
5. لكمة ثقوب في القالب PDMS لأنابيب إلى مولد الانحدار ومدخل الخلية باستخدام قياس 20 حادة في نهاية الإبرة.

3. الرابطة من الأجهزة PDMS :

1. تنظيف شريحة المجهر والزجاج مع الأيزوبروبانول والجافة مع النيتروجين أو تيار الهواء.
2. فضح PDMS والزجاج الانزلاق الى الاوكسجين في البلازما آشر البلازما.
3. جلب قالب PDMS في اتصال مع شريحة زجاجية. الحرارة الشريحة اتصلت والعفن PDMS إلى 65 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.

4. تجميع الجهاز PDMS

1. باستخدام شفرة حلاقة ، وقطع الأنابيب في زاوية 45 درجة لمدة الصحيحة المطلوبة للجهاز.
2. إدراج واحدة من نهاية الأنبوب في ثقبا في الجهاز (على سبيل المثال ، منفذ) باستخدام ملقط.
3. باستخدام الملقط ، اضافة الى وجود كليلة عيار 30 إبرة في الطرف الآخر من الأنبوب.
4. كرر الخطوة 4.2 لجميع ما تبقى من الثقوب.
5. جمع من 1mL العازلة الكيميائي (CB) في حقنة 3mL ، مع الحرص على إزالة فقاعات الهواء من الحقنة.
6. الإصلاح مركزا للإبرة واحدة من نهاية الأنبوب منفذا.
7. إضافة إلى محور CB الإبرة ، والاستفادة من مركز الإبرة لإزالة أي فقاعات هواء.
8. دفع القليل من خارج CB غيض من حقنة وتوصيلها إلى حقنة 3mL محور الإبرة دون احتباس الهواء.
9. CB دفع من خلال الجهاز حتى يتم شغل كل المراكز المتبقية مع إبرة مع CB. هذا يجب إزالة غالبية من فقاعات الهواء.
10. ملء two المحاقن مع 500μL CB تحتوي على تركيزات مناسبة لاختبار يجري chemoeffector. القضاء على تشكيل فقاعة الهواء عن طريق دفع إلى حدوث انخفاض صغير من محتويات المحاقن ولمس هذا الانخفاض الى السائل في محور وربط الإبرة.
11. وبالمثل ، الاتصال حقنة تحتوي على مدخل CB البكتيريا. وستتم إزالة هذا عندما يتم إدخال البكتيريا في الجهاز.

5. نمو عالية هاء متحركة القولونية

1. تنمو الثقافات بين عشية وضحاها من E. القولونية RP437 مع تعبير GFP البلازميد في 20 مل من مرق تريبتون (السل) في 32 درجة مئوية مع الهز. إضافة تركيزات المضادات الحيوية المناسبة للحفاظ على البلازميد. في بروتوكول لدينا ، ونحن استخدام pCM182 المنخفضة نسخ البلازميد للكشف عن البكتيريا على أساس مضان في الجهاز. لهاء القولونية ، والثقافات تنمو بمعدل 32 درجة مئوية لمدة ينصح حركية عالية ، وحركية أقل عند ارتفاع درجات الحرارة.
2. استخدام الثقافة بين عشية وضحاها لتطعيم ثقافة مل 20 من السل في دورق مخروطي سعة 250 مل إلى الكثافة البصرية في ~ ل 600Nm من 0.05. تنمو ثقافة مع اهتزاز عند 32 درجة مئوية.
3. حصاد الخلايا في جامعة النجاح OD 0.45 0.35 ₆₀₀ من ~ من انخفاض في سرعة الطرد المركزي في 400 x ج لمدة 5 دقائق.
4. Resuspend الخلايا إلى ₆₀₀ من ~ OD 0.35 في CB تحتوي على chemoeffector في تركيز المتوقع في منتصف القناة.
5. إضافة RFP المسمى الخلايا رميا بالرصاص عند OD ~ ₆₀₀ من 0.35 إلى الخلايا GFP - معربا عن العيش. وتستخدم الموتى (أحمر) خلايا باعتبارها الرقابة الداخلية للتأكد من أن أي الهجرة ليست نتيجة لآثار التدفق.

6. الرصد الكيميائي

1. إزالة بعض CB من الخلية مدخل إبرةالمحور. الملء مع التعليق الخلية.
2. ملء الحقنة 50μL بلطف مع الخلايا معلق. هذه الخطوة تحتاج إلى أن يتم ببطء كما يمكن المنفصمة سياط وسوف يقلل القدرة على الحركة.
3. نعلق المحقنة 50μL إلى محور مدخل إبرة كما هو موضح في الخطوة خطوات 4.10.
4. وضع الجهاز على مرحلة مضان المجهر مزودة كاميرا عالية السرعة لالتقاط صور. مكان الحقن مدخل (كلاهما 500 المحاقن التدرج ميكرولتر و50 المحاقن الخلية ميكرولتر) في ضخ حقنة وبدء تدفق تلك التي يتم تشكيلها في الانحدار والخلايا التي تتدفق عبر الأنابيب.
5. بمجرد دخول غرفة الخلايا الكيميائي ، وانتظر 20 دقيقة ~ لنظام لتحقيق الاستقرار قبل التصوير.
6. جمع الأخضر (حي) والحمراء (القتلى) مضان الصور في مواقع مختلفة على طول الغرفة (الموافق مرات التعرض مختلفة). عادة ، نقوم بجمع 100 صورة في كل موقع على فترات 3 ثانية.

7. تحليل البيانات : يمكن تنفيذ الخطوات التالية باستخدام أي تحليل الصور المتاحة تجاريا البرنامج (على سبيل المثال ، ImageJ ، Metamorph) أو باستخدام رموز بسيطة مكتوبة في Matlab.

1. إزالة خلفية بكسل في الصورة (أي كثافة مجموعة بكسل العتبة وإزالة كافة التي لديها كثافة بكسل أقل من عتبة). يقلل هذا الضجيج في التحليل.
2. استخدام موقف الخلايا الميتة (أحمر مضان) لتحديد مركز الصورة. منذ الخلايا الميتة تظهر أي الكيميائي ، وهذا يمثل موقف الخلايا حيث دخلت غرفة الكيميائي وسيتم الكشف عنها في ظل غياب أي الهجرة.
3. تحديد الخلايا الحية (مخضر) في الصورة.
4. تقسيم الصورة إلى القنوات وتحديد عدد الخلايا الحية في كل قناة. في عملنا قبل ³ ، 1050 تم تقسيم ميكرومتر واسعة الكيميائي الغرفة إلى 64 القنوات التي هي كل ~ 16 ميكرون واسع.
5. كرر الخطوات من 7.1 7.3 لجميع الصور والمبلغ بحساب خلية الإجمالي لكل قناة في جميع الصور. هذا يعطي عدد الخلايا في الكشف عن مجموع كل قناة خلال مدة التجربة.
6. حساب معامل القسم الكيميائي (CPC) ، والذي يمثل الاتجاه للهجرة ، على النحو التالي : يتم تعيين كل خلية موجودة في تركيز عال (يمين) وتركيز منخفض (يسار) من جانبي الخلايا الميتة من مضاعف +1 و -1 ، على التوالي. وهذا يعني ، أن يهاجر خلية حتى يتم ضرب الانحدار التي +1 بينما تتضاعف الخلايا تتحرك باستمرار على التدرج في -1. تضاف جميع القيم وضرب يصل إلى تطبيع إجمالي عدد الخلايا المكتشفة. على سبيل المثال ، قيمة للحزب الشيوعى الصينى من 0،40 إلى أن أكثر من 40 ٪ من مجموع البكتيريا انتقلت الى الجانب تركيز عال من جانب تركيز منخفض (أي chemoeffector هو جاذب كما تم الكشف عن المزيد من الجراثيم التي تنتقل إلى أعلى التدرج).
7. حساب معامل الهجرة الكيميائي (CMC) ، والذي يزن هجرة الخلايا من المسافة المقطوعة ، على النحو التالي : وزن الخلية الفرز في كل قناة من العوامل التي تتناسب مع المسافة التي تهاجر الخلايا. ويرد الخلية التي تنتقل إلى موقف أبعد تركيز عالية (قناة 64) عامل ترجيح +1 ، في حين يرد أحد أن يتحرك في منتصف الطريق الى الجانب تركيز أعلى عامل ترجيح +0.5 ، وخلية الانتقال الى ابعد ومن المرجح منخفضة التركيز موقف -1. نلخص كل التهم الخلية الموزون وتطبيع لعدد من الخلايا لتوليد CMC.

نتائج ممثل ^3،4 :

استخدمناها وصف الجهاز ميكروفلويديك (الشكل 1A) هنا للتحقيق الكيميائي من E. القولونية في التدرجات جاذبة لل(حمض الأسبارتيك ، autoinducer - 2) والمواد الطاردة (NISO ₄ ، الإندول) ^3،4. سلالة الكيميائي تنميط ⁵ هاء القولونية كان يستخدم تعبير عن RP437 GFP ، جنبا إلى جنب مع الكاناميسين - قتل E. القولونية TG1 الخلايا معربا عن بروتين فلوري الحمراء لرصد آثار التدفق. يظهر الانحدار تركيز شكلت في الجهاز μFlow في الشكل 1B. وقد توج مدخل الخلية بحيث لم يكن هناك تدفق من خلاله والتدرج مستقرة 0 100 تأسست نانوغرام / مل من fluoresscein في الجهاز. تم استخدام كثافة بكسل عبر جهاز لتحديد الشخصية تركيز فلوريسئين. وتشير البيانات إلى أن البكتيريا تواجه الانحدار الخطي عندما يدخلون غرفة الكيميائي. 2A الشكل وباء معارض الصور مضان من E. القولونية RP437 المهاجرة ردا على حمض الأسبارتيك التدرجات (0 100 ميكرومتر) وNISO ₄ (0 225 ميكرومتر). وكما هو متوقع لاحظ ردود الفعل على هذه الكنسي جاذبة وطاردة. 3A الشكل يوضح توزيع كمية من E. القولونية RP437 في حالة عدم وجود تدرج التركيز (أي التدرج خالية من حمض الأسبارتيك) ، في حينأرقام وجيم 3B إظهار التوزيع في التدرجات من حمض الأسبارتيك وNISO _4. خصوصية هذه الردود (أي تحيز في الهجرة) هو واضح كما E. القولونية RP437 Δ القطران سلالة (أي سلالة تفتقر إلى مستقبلة كيميائية القطران التي يتم استخدامها في كولاي الى الحس حمض الأسبارتيك والنيكل) لا تثبت التحيز في الهجرة في وجود معامل تركيز حمض الأسبارتيك أو NISO _4. الاتجاهات واضحا في ملامح التوزيع المكاني تتفق أيضا مع الحزب الشيوعى الصينى والقيم المحسوبة CMC. قيم الحزب الشيوعى الصينى للهجرة E. RP437 القولونية في التدرجات من حمض الأسبارتيك أو NISO ₄ هي و+0.33 -0.33 على التوالي. المقابلة هي القيم CMC و+0.13 -0.14 على التوالي. في المقابل ، فإن للحزب الشيوعى الصينى واللجنة العسكرية المركزية مع القيم E. القولونية RP437 سلالة Δ القطران في التدرجات من حمض الأسبارتيك NISO ₄ أو تكاد لا تذكر. بالإضافة إلى ذلك ، للحزب الشيوعى الصينى واللجنة العسكرية المركزية في التدرج خالية من حمض الأسبارتيك و+0.02 +0.03 هي ، على التوالي ، وتشير إلى عدم التحيز في الهجرة في غياب التدرج.

الشكل 1. التخطيطي الجهاز والتدرج التركيز.
(أ) تمثيل تخطيطي للجهاز ميكروفلويديك الكيميائي. الجهاز يتكون من وحدة الانحدار ، خلط (20 × 100 × 18750 ميكرون) وحدة المراقبة الكيميائي (20 × × 1050 11500 ميكرون). بعرض من القنوات الانحدار اللذين يصلان إلى الجهاز هي 500 ميكرون وعرض المدخل البكتيريا هي 50 ميكرومتر. وأقحم يصور التدرج من جزيء إشارة (الرمادي) والبكتيريا المهاجرة ردا عليها. وصفت البكتيريا تعيش في الاهليليجات الصلبة ، بينما يتم عرض القتلى على البكتيريا الاهليليجات مفتوحة. (B) قد ولدت هناك تركيز الانحدار بين 0 و 100 نانوغرام / مل فلوريسئين في الجهاز والتقط باستخدام المجهر مضان. تم الحصول على الصور مضان بعد 30 دقيقة وكميا عن طريق تحليل الصور.

الشكل 2. الكيميائي من E. RP437 القولونية في الجهاز ميكروفلويديك.
تعرضت كولاي RP437 إلى الانحدار من (أ) 000-100 ميكرومتر L - اسبارتاتي أو (B) 0-225 ميكرومتر NISO ₄ في الجهاز والهجرة من البكتيريا تعيش (الأخضر) نحو اسبارتاتي - L أو بعيدا من النيكل التقط كل ثانية 2.5 لمدة 30 دقيقة. خدم البكتيريا الميتة (الحمراء) ، والسيطرة على تدفق الآثار في الجهاز. وكميا باستخدام الصور في المنزل تحليل program3 المتقدمة. أظهرت بيانات تمثل الصور الملونة الزائفة من ثلاث تجارب مستقلة.

الشكل 3 : القياس الكمي لمحات الهجرة إلى جاذب وطارد الكنسي.
التوزيع المكاني للRP437 في الجهاز ميكروفلويديك استجابة إلى (A) موحدة L - 100 ميكرومتر اسبارتاتي (أي ، لا التدرج) ، (ب) 0 التدرج ميكرومتر 100 من اسبارتاتي ، و (ج) 0 التدرج ميكرومتر 225 من NISO ₄ . ويظهر توزيع الخلايا الميتة كخط ثابت ، يظهر توزيع RP437 الخلايا كخط متقطع ، ويظهر توزيع RP437 جمعية الإمارات للغوص ⁺ الخلايا القطران Δ كخط منقط. وبلغ متوسط ​​أظهرت بيانات لثلاث تجارب مستقلة.

Discussion

ويمكن حساب معامل القسم الكيميائي (CPC) ومعامل الهجرة الكيميائي (CMC) كما هو موضح في ماو وآخرون ^5. إذا تم الكشف عن خلية على الجانب عالية التركيز ، وإعطائها قيمة +1 ، في حين يرد الكشف عن خلية على الجانب تركيز منخفض قيمة -1. ولخص القيم صعودا ومقسوما على العدد الكلي للخلايا لتوليد الحزب الشيوعى الصينى. علامة للحزب الشيوعى الصينى (إيجابية أو سلبية) ويعطي اتجاه الهجرة (نحو أو بعيدا عن إشارة). على الرغم من ان الحزب الشيوعى الصينى يشير إلى ما إذا كانت الخلايا تستجيب لمادة كيميائية باعتبارها جاذبة أو طاردة ، فإنه لا يفعل قياس مدى انجذاب كيميائي. لهذا ، فإننا حساب اللجنة العسكرية المركزية من خلال تقسيم ملف التوزيع المكاني من البكتيريا عبر عرض الجهاز إلى 64 أقسام (32 على كل من جانبي مدخل الخلية) ، وتعيين عامل الترجيح إلى الخلايا في كل مقطع على أساس مسافة الهجرة. تتضاعف المقاطع ابعد من المركز (المادتين 1 و 64) بواسطة +1 (= 31.5/31.5) أو -1 لأنها تحتوي على الخلايا التي هاجروا المسافة القصوى. تتضاعف المقبل قسمين (2 و 63) بواسطة +0.968 (= 30.5/31.5) أو -0.968. تتضاعف القسمين الأخيرين (أي 32 و 33 التي هي الأقرب إلى مدخل الخلية) من 0.015 + (= 0.5/31.5) أو -0.015. ولخص القيم المرجحة للتطبيع والعدد الكلي للخلايا لتوليد CMC. A +1 CMC من يشير إلى أن جميع هذه البكتيريا انتقلت تماما عن الانحدار إلى جدار الغرفة التدفق. في حالة وجود استجابة جذابة خفيفة ، واللجنة العسكرية المركزية لا تزال إيجابية ، ولكن لها قيمة أصغر ، في حين أن القيمة للحزب الشيوعى الصينى سيظل +1. وبالتالي CMC يميز الخلايا تستجيب على أساس حد للهجرة.

معايير معينة يجب أن يتم التحكم بدقة أثناء أداء التجارب الكيميائي. درجة الحرارة التي تزرع البكتيريا هو المهم. لهاء القولونية ، لاحظنا أن درجة حرارة أفضل نمو هي 32 درجة مئوية والحد من ارتفاع درجات الحرارة الحركية. لمستقبلات معينة لتكون موجودة في البكتيريا ، قد يكون من الضروري لنمو البكتيريا في وجود حمل chemoeffector (أي رئيس للخلايا الكيميائي). على سبيل المثال ، عند التحقيق في مدى استجابة البكتيريا لالمالتوز ، تزرع الخلايا بنسبة 0.1 ٪ (وزن / حجم) من السكر. عند إعادة التعليق على البكتيريا بعد الطرد المركزي ، فمن المهم أن يتم تنفيذ رقيقة تهز / المتداول من الأنبوب وليست vortexed الخلايا. هز قوي يمكن القص وسياط وتقليص القدرة على الحركة من الخلايا التي يجري اختبارها. فإن معدلات تدفق المستخدمة في الجهاز يجب أن يتم تحديد استنادا إلى الحركية للبكتيريا التي يجري اختبارها. قد تكون هناك حاجة لمعدلات أبطأ تدفق البكتيريا التي هي أقل متحركة ، ويجب أن تحدد معدل التدفق الأمثل تجريبيا.

ونحن نتوقع أن يمكن استخدام الجهاز لإجراء تحقيقات μFlow الأساسية على الجرثومي الكيميائي (على سبيل المثال ، المنافسة بين chemoeffectors لمستقبلات نفسه) وكذلك في تحديد البكتيريا في العينات البيئية التي تستجيب للمواد الكيميائية خاصة فيما جاذبة أو طاردة.