Een microfluïdische apparaat voor het kwantificeren van Bacteriële Chemotaxis in stabiele concentratiegradiënten

Summary

Dit protocol beschrijft de ontwikkeling van een microfluïdische apparaat voor het onderzoeken van bacteriële chemotaxis in stabiele concentratiegradiënten van chemoeffectors.

Abstract

Chemotaxis kunnen bacteriën bronnen van lokstof chemicaliën aanpak of de bronnen van afstotende stoffen te voorkomen. Bacteriën voortdurend de concentratie van specifieke chemoeffectors door het vergelijken van de huidige concentratie van de gemeten concentratie een paar seconden eerder. Deze vergelijking bepaalt de netto-richting van de beweging. Hoewel meerdere, concurrerende gradiënten vaak samen in de natuur, conventionele benaderingen voor het onderzoeken van bacteriële chemotaxis zijn suboptimaal voor het kwantificeren van de migratie in reactie op de concentratie gradiënten van lokstoffen en insectenwerende middelen. Hier beschrijven we de ontwikkeling van een microfluïdische chemotaxis model voor het presenteren van een nauwkeurige en stabiele concentratie gradiënten van chemoeffectors om bacteriën en kwantitatief onderzoek naar hun reactie op de toegepaste gradiënt. Het apparaat is veelzijdig in die concentratie gradiënten van elke gewenste absolute concentratie en gradiënt sterkte kan eenvoudig worden gegenereerd door diffusie mengen. Het apparaat is aangetoond met behulp van de reactie van

Protocol

1. Fabricage van silicium meesters met behulp van standaard SU-8 fotolithografie ^een (niet getoond in deze video).

1. Gebruik standaard SU-8 fotolithografie methoden om een ​​SU-8 "master" (SU-8 2025, Microchem, Newton, MA) te creëren voor het vervaardigen van de PDMS schimmel die de microfluïdische netwerk en chemotaxis kamer bevat. Deze master-mallen kunnen worden vervaardigd op een microfabricage faciliteit (bijv. Stanford Microfluidics Foundry; http://thebigone.stanford.edu/foundry/ ).
2. Voorafgaand aan PDMS replicatie, bloot de SU-8 meester om fluorosilane damp in een exsiccator verbonden aan een vacuüm bron om gemakkelijk los van het PDMS te vergemakkelijken van de meester. Voeg een druppel fluorosilane op een papieren handdoek en vacuüm voor een min van toepassing zijn. Verwijder het vacuüm en laat 30 min voor de depositie van fluorosilane. Houd de SU-8 meester in een gesloten container voor toekomstig gebruik.

2. Replica gieten van PDMS van de SU-8 meester: De vloeibare laag en de controle laag zijn gemaakt door replica gieten van PDMS van de SU-8 master.

1. Meng de PDMS pre-polymeer en cross-linker op een 10:01 gew. verhouding en ontgassen in een exsiccator gedurende 1 uur (of tot de luchtbellen zijn verwijderd uit het PDMS mengsel).
2. Plaats de SU-8 meester in een petrischaal en zorgvuldig de PDMS mengsel giet op de top van de SU-8 master naar de gewenste dikte.
3. Verhit de petrischaal met de PDMS en de SU-8 meester schimmel bij 80 ° C gedurende twee uur aan het PDMS genezen.
4. Verwijder de uitgeharde PDMS bedekte SU-8 meester uit de kookplaat en schil de PDMS mal van de SU-8 master. De gewenste structuur zal worden ingebed in de PDMS mal.
5. Punch gaten in de PDMS mal voor slang aan op de gradiënt-generator en de cel inlaat met behulp van een 20 gauge stompe einde van de naald.

3. Verlijmen van PDMS-apparaten:

1. Schoon een glazen microscoopglaasje met isopropanol en droog met stikstof of een luchtstroom.
2. Expose de PDMS en glazen schuif naar zuurstof plasma in een plasma Aser.
3. Breng de PDMS mal in contact met het glaasje. Verhit de gecontacteerde schuif en PDMS schimmel tot 65 ° C gedurende 15 minuten.

4. Montage van de PDMS-apparaat

1. Met behulp van een scheermesje, snij slangen in een hoek van 45 ° op de juiste lengte die nodig is voor het apparaat.
2. Steek het ene uiteinde van de slang in de gaatjes in het apparaat (bv uitlaat) met behulp van een tang.
3. Met behulp van een tang, plaatst u een stompe 30-gauge naald in het andere uiteinde van de slang.
4. Herhaal stap 4.2 voor alle resterende gaten.
5. Verzamel 1 ml van de chemotaxis buffer (CB) in een 3 ml spuit en zorg ervoor dat de luchtbellen uit de spuit.
6. Fix een naald hub aan het ene uiteinde van de uitlaat slang.
7. Voeg CB om de naald hub, en tik de naald hub om eventuele luchtbellen te verwijderen.
8. Duw een beetje CB uit de punt van de spuit en sluit de 3 ml spuit aan de naald hub zonder lucht.
9. Duw CB via het apparaat totdat alle overgebleven naald hubs zijn gevuld met met CB. Dit moet de meerderheid van de luchtbellen.
10. Vul twee 500μL spuiten met CB met de juiste concentraties van de chemoeffector wordt getest. Elimineer luchtbellen ontstaan ​​door het indrukken van een klein druppeltje van de spuit inhoud en het aanraken van de dalen tot de vloeistof in de naald hub en bevestigen.
11. Ook sluit een spuit met CB om de bacteriën te inlaat. Dit zal worden verwijderd wanneer bacteriën worden ingevoerd in het apparaat.

5. Groei van sterk beweeglijke E. coli

1. Grow 's nachts culturen van E. coli RP437 met een GFP expressieplasmide in 20 ml trypton bouillon (TB) bij 32 ° C met schudden. Voeg het juiste concentraties van antibiotica om het plasmide te behouden. In ons protocol maken we gebruik van een low-copy plasmide pCM182 voor het detecteren van bacteriën op basis van fluorescentie in het apparaat. Voor E. coli, groeiende culturen bij 32 ° C wordt aanbevolen voor hoge beweeglijkheid, zoals motiliteit lager is bij hogere temperaturen.
2. Gebruik het 's nachts cultuur om een ​​20 ml cultuur van TB inoculeren in een 250 mL erlenmeyer met een optische dichtheid bij 600 nm van ~ 0,05. Groei van de cultuur met schudden bij 32 ° C.
3. Oogst de cellen op een OD ₆₀₀ van ~ 0,35 0,45 door de lage snelheid centrifugatie bij 400 xg gedurende 5 minuten.
4. Resuspendeer cellen aan een OD ₆₀₀ van ~ 0,35 in CB met de chemoeffector op de concentratie naar verwachting in het midden van het kanaal.
5. Voeg RFP-gemerkte dode cellen op een OD ₆₀₀ van ~ 0,35 aan de GFP-expressie levende cellen. De dode (rode) cellen worden gebruikt als een interne controle om te verzekeren dat migratie niet te wijten is aan stroom effecten.

6. Monitoring chemotaxis

1. Verwijder een deel van de CB van de cel inlaat naaldhub. Vul bij met de celsuspensie.
2. Voorzichtig Vul de 50μL spuit met de geresuspendeerde cellen. Deze stap moet langzaam worden gedaan als flagella kunnen worden geschoren en zal de beweeglijkheid.
3. Bevestig de spuit 50μL naar de inlaat-naald hub, zoals beschreven in stappen stap 4.10.
4. Plaats het apparaat op het podium van een fluorescentiemicroscoop uitgerust met een high-speed camera voor het imago van acquisitie. Plaats de inlaat spuiten (zowel de 500 pL gradiënt spuiten en de 50 uL cel spuit) in de injectiepomp en initiëren stroom zodanig dat de gradiënt wordt gevormd en cellen die door de slang.
5. Zodra de cellen van de chemotaxis kamer betreden, wacht ~ 20 min voor het systeem te stabiliseren alvorens beeldvorming.
6. Verzamel groen (live) en rood (dode) fluorescentie beelden op verschillende locaties langs de lengte van de kamer (overeenkomend met verschillende belichtingstijden). Typisch, verzamelen we 100 foto's op elke locatie op 3 sec intervallen.

7. Data-analyse: De volgende stappen kunnen worden uitgevoerd met behulp van een commercieel beschikbare beeldanalyse-programma (bijv. ImageJ, Metamorph) of met behulp van eenvoudige codes geschreven in Matlab.

1. Verwijder de achtergrond pixels in het beeld (dat wil zeggen, set drempel pixel intensiteit en verwijder alle pixels die de intensiteit minder dan de drempel). Dit minimaliseert ruis in de analyse.
2. Gebruik maken van de positie van de dode cellen (rode fluorescentie) naar het centrum van het beeld bepalen. Omdat de dode cellen tonen geen chemotaxis, dit is de positie waar de cellen ging de chemotaxis kamer en zou worden waargenomen in de afwezigheid van migratie.
3. Zoek levende cellen (groene fluorescentie) in het beeld.
4. Verdeel het beeld in kanalen en bepalen van het aantal levende cellen in elk kanaal. In ons eerdere werk ^3, was de 1050 um brede chemotaxis kamer is opgedeeld in 64 kanalen die elk ~ 16 micrometer breed.
5. Herhaal de stappen 7,1 7,3 voor alle afbeeldingen en de som van de totale cel telt voor elk kanaal in alle beelden. Dit geeft het totale aantal cellen gedetecteerd op elk kanaal over de duur van het experiment.
6. Bereken de chemotaxis verdelingscoëfficiënt (CPC), die de richting van de migratie vertegenwoordigt, als volgt: elke cel bevindt zich in het hoge concentratie (rechts) en een lage concentratie (links) kanten van de dode cellen krijgt een multiplier van +1 en -1 , respectievelijk. Dat wil zeggen, een cel die migreert van een helling wordt vermenigvuldigd met +1 terwijl cellen naar beneden de helling worden vermenigvuldigd met -1. Alle vermenigvuldigd waarden worden opgeteld en genormaliseerd naar het totale aantal gedetecteerde cellen. Bijvoorbeeld, een CPC-waarde van 0,40 geeft aan dat 40% meer van de totale bacteriën verplaatst naar de hoge concentratie dan aan de lage concentratie kant (dat wil zeggen de chemoeffector is een lokstof als meer bacteriën werden ontdekt steeds hoger op de gradiënt).
7. Bereken de chemotaxis migratie coëfficiënt (CMC), dat weegt de migratie van cellen door de afgelegde afstand, als volgt: Gewicht van de cellen in elk kanaal met een factor die evenredig is aan de afstand die cellen migreren. Een cel die wordt verplaatst naar de verste hoge concentratie positie (kanaal 64) krijgt een wegingsfactor van +1, terwijl een die halverwege beweegt in de hogere concentratie kant krijgt een wegingsfactor van +0.5, en een cel verhuizen naar de verste lage concentratie positie wordt gewogen met -1. Kortom alle gewogen celtellingen en normaliseren van het aantal cellen om de CMC te genereren.

Representatieve resultaten ^3,4:

Wij hebben gebruik gemaakt van de microfluïdische apparaat (Figuur 1A) beschreven hier om chemotaxis van E. te onderzoeken coli in verlopen van lokstoffen (asparaginezuur, autoinducer-2) en insectenwerende middelen (NiSO _4, indool) ^3,4. De prototypische chemotaxis stam ⁵ E. coli RP437 uiten van GFP werd gebruikt, samen met kanamycine gedode E. coli-TG1 cellen die rood fluorescerend eiwit te stromen effecten te controleren. De concentratie gradiënt gevormd in de μFlow apparaat wordt weergegeven in figuur 1B. De cel inlaat werd afgedekt, zodat er geen stroom doorheen en een stabiele gradiënt van 0 100 ng / mL van fluoresscein werd opgericht in het apparaat. De pixel intensiteit over het apparaat werd gebruikt om de concentratie profiel van fluoresceïne te bepalen. De gegevens tonen aan dat bacteriën een lineair verloop ondervinden wanneer ze in de chemotaxis kamer. Figuur 2A en B toont fluorescentie beelden van E. coli RP437 migreren als reactie op hellingen van asparaginezuur (0 100 uM) en NiSO ₄ (0 225 uM). De waargenomen reacties op deze canonieke lokstof en afstotend zijn als voorspeld. Figuur 3A toont de gekwantificeerde verspreiding van E. coli RP437 bij het ontbreken van een concentratie gradiënt (dat wil zeggen, null helling van asparaginezuur), terwijlFiguren 3B en C tonen de verdeling in gradiënten van asparaginezuur en NiSO _4. De specificiteit van deze reacties (dat wil zeggen, de vertekening in de migratie) is duidelijk als een E. coli RP437 Δ teer stam (dat wil zeggen, stam ontbreekt het Tar chemoreceptor die wordt gebruikt in E. coli tot asparaginezuur en nikkel zin) niet aan te tonen van de bias in de migratie in de aanwezigheid van een concentratiegradiënt van asparaginezuur of NiSO _4. De trends zichtbaar in de ruimtelijke verdeling profielen zijn ook consistent met de berekende CPC en CMC waarden. De CPC-waarden voor de migratie van E. coli RP437 in verlopen van asparaginezuur of NiSO ₄ zijn +0.33 en -0.33, respectievelijk. De bijbehorende waarden zijn CMC +0.13 en -0.14, respectievelijk. In tegenstelling, de CPC en CMC waarden met de E. coli RP437 Δ teer stam in verlopen van asparaginezuur of NiSO ₄ zijn te verwaarlozen. Daarnaast is de CPC-en CMC in een nul-helling van asparaginezuur zijn +0.03 en +0.02, respectievelijk, en wijzen op het ontbreken van een bias in de migratie in de afwezigheid van een gradiënt.

Figuur 1. Schematische apparaat en concentratie gradiënt.
(A) Schematische weergave van de microfluïdische chemotaxis apparaat. Het apparaat bestaat uit een gradiënt-mixing-module (20 x 100 x 18.750 urn) en een chemotaxis observatie-module (20 x 1050 x 11500 pm). De breedte van de twee gradiënt kanalen invoeren van het toestel zijn 500 urn en de breedte van de bacteriën inlaat is 50 micrometer. De inzet toont een helling van signaalmolecuul (grijs) en bacteriën migreren als reactie op het. Levende bacteriën worden afgeschilderd als solide ovalen, terwijl de dode bacteriën worden weergegeven als open ovalen. (B) Een concentratie gradiënt tussen 0 en 100 ng / mL fluoresceïne werd gegenereerd in het apparaat en beeld gebracht met behulp van fluorescentie microscopie. Fluorescentie beelden werden verkregen na 30 min en gekwantificeerd door beeldanalyse.

Figuur 2. Chemotaxis van E. coli RP437 in de microfluïdische apparaat.
E. coli RP437 werd blootgesteld aan een gradiënt van (A) 0-100 uM L-aspartaat of (B) 0-225 uM NiSO ₄ in het apparaat en de migratie van levende bacteriën (groen) naar L-aspartaat of uit de buurt van nikkel afgebeeld elke 2,5 seconden gedurende 30 minuten. Dode bacteriën (rood) diende als de controle voor flow-effecten in het apparaat. Beelden werden gekwantificeerd met behulp van een in-house ontwikkelde analyse program3. De getoonde gegevens zijn representatief pseudo-gekleurde beelden van drie onafhankelijke experimenten.

Figuur 3: Kwantificering van migratie profielen om een canonieke lokstof en afstotend.
Ruimtelijke verdeling van RP437 in de microfluïdische apparaat als reactie op (A) uniform 100 uM L-aspartaat (dwz geen gradiënt), (B) een 0 100 uM helling van aspartaat, en (C) een 0 225 uM helling van NiSO ₄ . De verdeling van dode cellen wordt getoond als een ononderbroken lijn, is de verdeling van RP437 cellen weergegeven als een stippellijn, en de verdeling van de RP437 eda ⁺ Δ teer cellen is weergegeven als een stippellijn. De getoonde gegevens zijn gemiddeld voor drie onafhankelijke experimenten.

Discussion

De chemotaxis verdelingscoëfficiënt (CPC) en de chemotaxis migratie coëfficiënt (CMC) kan worden berekend zoals beschreven in Mao et al. ^5. Als een cel wordt gedetecteerd op de hoge concentratie kant, krijgt een waarde van +1, terwijl een cel aangetroffen op de lage concentratie kant krijgt een waarde van -1. De waarden worden opgeteld en gedeeld door het totale aantal cellen om de CPC te genereren. Het teken van de CPC (positief of negatief) geeft de richting van de migratie (in de richting of weg van een signaal). Hoewel de CPC geeft aan of cellen aan een chemische reactie als een lokstof of afstotend, is het niet kwantificeren de omvang van de chemotaxis. Hiervoor berekenen we de CMC door het verdelen van de ruimtelijke spreiding profiel van bacteriën over de breedte van het apparaat in 64 hoofdstukken (32 aan elke kant van de cel inlaat), en het toewijzen van een wegingsfactor aan cellen in elke sectie op basis van de afstand van migratie. De secties verst van het centrum (afdelingen 1 en 64) worden vermenigvuldigd met +1 (= 31.5/31.5) of -1, omdat zij cellen die zijn gemigreerd de maximale afstand bevatten. De volgende twee paragrafen (2 en 63) worden vermenigvuldigd met +0.968 (= 30.5/31.5) of -0.968. De laatste twee secties (dat wil zeggen, 32 en 33 die het dichtst bij de cel inlaat) wordt vermenigvuldigd met + 0.015 (= 0.5/31.5) of -0.015. De gewogen waarden zijn opgeteld en genormaliseerd naar het totale aantal cellen naar de CMC te genereren. Een van +1 CMC geeft aan dat alle bacteriën geheel hoger op de helling aan de wand van de stroom kamer. In het geval van een lichte mooie reactie, zou de CMC nog steeds een positief, maar hebben een kleinere waarde, terwijl de CPC-waarde zou nog steeds +1. Dus de CMC discriminerend reageren cellen op basis van de omvang van de migratie.

Bepaalde parameters moeten zorgvuldig worden gecontroleerd tijdens het uitvoeren van chemotaxis experimenten. De temperatuur waarbij de bacteriën gekweekt worden is belangrijk. Voor E. coli, hebben we geconstateerd dat de beste groei temperatuur is 32 ° C en de hogere temperaturen te verminderen motiliteit. Voor bepaalde receptoren aanwezig te zijn in bacteriën, kan het nodig zijn om de bacteriën groeien in de aanwezigheid van een inducerend chemoeffector (dat wil zeggen, om de cellen voor chemotaxis prime). Bijvoorbeeld, wanneer het onderzoek naar de reactie van bacteriën aan maltose worden cellen gegroeid met 0,1% (w / v) van de suiker. Wanneer resuspenderen de bacterie na het centrifugeren, is het belangrijk dat zachtjes schudden / rollen van de buis wordt uitgevoerd en de cellen niet gevortexed. Krachtig schudden kan afschuiving van de flagellen en vermindering van de beweeglijkheid van de cellen wordt getest. Het debiet gebruikt in het apparaat zal moeten worden bepaald op basis van de beweeglijkheid van de bacterie worden getest. Langzamer debieten kan nodig zijn voor bacteriën die minder beweeglijk, en de optimale debiet moet empirisch worden bepaald.

We verwachten dat de μFlow apparaat kan worden gebruikt voor fundamenteel onderzoek naar bacteriële chemotaxis (bijvoorbeeld, de concurrentie tussen chemoeffectors voor dezelfde receptor) alsook bij het identificeren van bacteriën in het milieu monsters die reageren op bepaalde stoffen als lok-en insectenwerende middelen.