안정적인 농도 기울기에 박테리아 Chemotaxis을 Quantifying위한 Microfluidic 장치

Summary

이 프로토콜은 chemoeffectors의 안정적인 농도 기울기에 박테리아 chemotaxis 조사를위한 microfluidic 장치의 개발을 설명합니다.

Abstract

Chemotaxis은 박테리아가 유인 화학 물질의 소스를 접근하거나 혐오감을 화학 물질의 소스를 피할 수 있습니다. 박테리아는 지속적으로 집중하는 현재의 농도를 비교하여 특정 chemoeffectors의 농도를 모니터 앞에서 몇 초를 발견했습니다. 이 비교는 운동의 순 방향을 결정합니다. 여러 경쟁 그라디언트는 종종 자연 속에서 공존하지만, 박테리아 chemotaxis를 조사하는 기존 방법은 attractants과 repellents의 농도 기울기에 대한 응답으로 마이 그 레이션을 quantifying위한 suboptimal 있습니다. 여기, 우리는 박테리아에 chemoeffectors의 정확하고 안정적​​인 농도 기울기를 제시하고 양적 적용된 그라디언트들의 반응을 조사하는 microfluidic chemotaxis 모델의 개발을 설명합니다. 이 장치는 원하는 절대 농도와 기울기 강도의 농도 기울기에 다양한는 쉽게 잘 퍼지는 혼합에 의해 생성하실 수 있습니다. 장치는 응답을 사용하여 증명

Protocol

1. 표준 SU - 8 석판술 ^1을 (이 동영상에 표시되지 않습니다)를 사용하여 실리콘 마스터의 제작.

1. microfluidic 네트워크 및 chemotaxis 챔버를 포함하는 PDMS 금형을 fabricating위한 SU - 8 "마스터"(SU - 8 2025, MicroChem, 뉴턴, MA)를 만드는 표준 SU - 8 석판술 방법을 사용하십시오. 이러한 마스터 금형은 모든 microfabrication 시설 (; 예를 들어, 스탠포드 Microfluidics 주조에서 가공 수 있습니다 http://thebigone.stanford.edu/foundry/ ).
2. 이전 PDMS의 복제, 마스터에서 PDMS의 쉬운 버전을 촉진하기 위하여 진공 소스에 연결된 건조기에 플루오로 실란 수증기에 SU - 8 마스터를 노출. 종이 타월로 플루오로 실란의 드롭을 추가 한 분 진공을 적용합니다. 진공을 제거하고 플루오로 실란의 증착을위한 30 분 수 있습니다. 나중에 사용하기 위해 닫힌 용기에 SU - 8 마스터 보관하십시오.

2. SU - 8 마스터에서 PDMS의 복제 성형 : 유체 층과 제어 계층은 SU - 8 마스터에서 PDMS의 복제 성형에 의해 만들어집니다.

1. 10시 1분 WT에서 PDMS 사전 폴리머와 가교제를 섞습니다. 1 시간 (또는 기포가 PDMS 혼합물에서 제거되기 전까지)에 대한 dessicator의 비율과 데가스.
2. 배양 접시에있는 SU - 8 마스터를 놓고 조심스럽게 원하는 두께에 SU - 8 마스터 위에 PDMS 혼합물을 따라줘.
3. PDMS와 ° 두 시간 동안 C는 PDMS 치료 80에서 SU - 8 마스터 금형을 포함하고있는 배양 접시를 가열.
4. 제거 치료 PDMS - 다루는 열판에서 SU - 8 마스터와 SU - 8 마스터에서 PDMS 금형 껍질. 원하는 구조는 PDMS 금형에 포함됩니다.
5. 20 게이지 날이 엔드 바늘을 사용하여 그라데이션 생성기 및 세포 입구에 튜브에 대한 PDMS 금형의 펀치 구멍.

3. PDMS 장치의 결합 :

1. 이소프로판올 및 질소 또는 공기 흐름과 건조와 유리 현미경 슬라이드를 청소합니다.
2. PDMS와 플라즈마 애셔에 산소 플라즈마에 유리 슬라이드를 쉽게받을 수 있습니다.
3. 유리 슬라이드 접촉에 PDMS 금형 가져와. 65 연락을 슬라이드 및 PDMS 금형을 가열 ° C 15 분.

4. PDMS 장치를 조립

1. 면도날을 사용하여 45에서 튜브를 잘라 ° 장치에 필요한 올바른 길이 각도.
2. 포셉를 사용하는 장치 (예, 콘센트)에 펀치 구멍에 튜브의 한쪽 끝을 넣습니다.
3. 포셉 사용하여 튜브의 다른 쪽 끝을에 뭉툭한 30 게이지 바늘을 삽입합니다.
4. 모든 나머지 구멍에 대해 단계 4.2를 반복합니다.
5. 주사기에서 공기 방울을 제거하기 위해 간병, 3mL 주사기에 chemotaxis 버퍼 (CB)의 1mL를 수집합니다.
6. 아울렛 튜브의 한쪽 끝을 바늘로 허브를 수정.
7. 바늘 허브에 CB를 추가하고 기포를 제거하기 위해 바늘 허브를 누릅니다.
8. 주사기의 끝을 약간 CB 출력을 밀어 공기를 트래핑하지 않고 바늘 허브에 3mL 주사기를 연결합니다.
9. 남아있는 모든 바늘 허브가 CB로 가득 때까지 장치를 통해 CB를 밀어. 이것은 기포의 과반수를 제거합니다.
10. chemoeffector 테스트되는 적절한 농도를 포함하는 CB 두 500μL 주사기를 입력합니다. 주사기 내용의 작은 방울을 밀어와 바늘 허브에있는 액체에있는 드롭을 감동 첨부하여 공기 방울 형성​​을 제거합니다.
11. 마찬가지로 세균의 입구에 CB를 포함한 주사기를 연결합니다. 세균이 장치에 도입하는 경우이 제거됩니다.

5. 높은 운동성이있는 E.의 성장 대장균

1. E.의 야간 문화를 성장 대장균 잡고 32 ° C에서 tryptone 국물 (TB) 20 ML에 플라스미드 GFP 표현과 RP437. 플라스미드를 유지하기 위해 항생제의 적절한 농도를 추가합니다. 우리의 프로토콜에서는, 우리는 장치의 형광을 기반으로 박테리아를 검출 낮은 사본 플라스미드 pCM182을 사용합니다. E. 들어 대장균, 32에서 성장 문화 ° 운동성 높은 온도에서 낮은이므로 C가 높은 운동성 권장합니다.
2. ~ 0.05의 600nm에서 광학 밀도 250 ML Erlenmeyer 플라스크에 TB의 20 ML 문화를 예방하기 위해 야간 문화를 사용합니다. 32에서 흔들림과 문화를 성장 ° C.를
3. 5 분 400 XG에서 저속 원심 분리하여 0.35 ~ 0.45의 OD _600에서 세포를 수확.
4. 채널의 중간에 예상되는 농도에서 chemoeffector를 포함하는 CB의 ~ 0.35의 OD ₆₀₀ 세포를 Resuspend.
5. GFP - 표현 살 세포 ~ 0.35의 OD _600에서 RFP - 라벨 죽은 세포를 추가합니다. 죽은 (적색) 세포는 모든 마이 그 레이션 흐름 효과로 인해 아니라는 것을 보장하기 위해 내부 통제으로 사용됩니다.

6. 모니터링 chemotaxis

1. 세포 유입 바늘에서 CB의 일부를 제거허브. 세포 현탁액과 리필.
2. 부드럽게 resuspended 세포로 50μL 주사기를 입력합니다. 이 단계는 flagella가 가지각색 수로 천천히해야 할 필요와 운동성을 줄일 수 있습니다.
3. 으로 단계 단계 4.10에서 설명한 입구 - 바늘 허브에 50μL 주사기를 연결합니다.
4. 이미지 수집을위한 고속 카메라가 장착된 형광 현미경의 무대 장치를 놓습니다. 주사기 펌프에 유입 주사기를 (모두 500 μL 그라데이션 주사기와 50 μL 세포 주사기) 장소 및 기울기가 형성되고 세포가 튜브를 통해 흐르는 것을 이러한 흐름을 시작합니다.
5. 일단 세포 chemotaxis 챔버를 입력하기 전에 영상 안정화 시스템 ~ 20 분 기다립니다.
6. 챔버의 길이를 따라 다른 위치 (다른 노출 시간에 해당)에서 녹색 (라이브)과 빨간색 (죽은) 형광 이미지를 수집합니다. 일반적으로, 우리는 3 초 간격으로 각 지역 100 이미지를 수집합니다.

7. 데이터 분석 : 다음 단계는 모든 상용 이미지 분석 프로그램 (예, ImageJ, Metamorph)를 사용하여 또는 Matlab로 작성된 간단한 코드를 사용하여 수행할 수 있습니다.

1. 이미지 (즉, 설정된 임계값 픽셀 강도 이하 임계값 이상의 강도를 모든 픽셀을 제거)의 배경 픽셀을 제거합니다. 분석이 최소화 소음.
2. 이미지의 중심을 결정하는 죽은 세포 (적색 형광)의 위치를​​ 사용합니다. 죽은 세포가 더 chemotaxis를 보여 없기 때문에,이 세포 chemotaxis 챔버를 입력하고 마이 그 레이션의 부재에서 검색된 될 위치를 나타냅니다.
3. 이미지에 살고있는 세포를 (녹색 형광) 찾습니다.
4. 채널로 이미지를 분할하고 각 채널에 살고있는 세포의 수를 결정합니다. 우리의 이전 작업 ^3에서 1,050 μm의 넓은 chemotaxis 챔버는 각 ~ 16 μm의 넓은 아르 64 개의 채널로 나뉘어되었다.
5. 단계를 모든 이미지에 대해 7.1 7.3를 반복하여 모든 이미지에 걸쳐 각 채널에 대한 전체 셀 개수 합계. 이것은 실험 기간 동안 각 채널에서 검색 전체 셀 개수를 제공합니다.
6. 고농도 (오른쪽)과 낮은 농도 (왼쪽)는 죽은 세포의 양쪽에있는 각 셀에가 +1과 -1의 배율을 할당 다음과 같이 마이 그 레이션의 방향을 나타내는 chemotaxis 파티션 계수 (CPC)를 계산 각각. 즉, 그라디언트를 아래로 이동 세포 -1 곱한하는 동안 구배가 1 곱한 것입니다 최대 마이 그 레이션 세포이다. 모든 곱한 값은 최대 추가하고 감지 세포의 총 숫자로 정상화됩니다. 예를 들어, 0.40의 클릭당 비용 (CPC) 값은 전체 세균의 40 % 이상 낮은 농도 측면 (즉, 더 많은 박테리아가 경사도를 이동 감지 것처럼 chemoeffector은 유인이다)보다 높은 농도쪽으로 이동했음을 나타냅니다.
7. 세포가 마이 그 레이션하는 거리에 비례 계수에 의해 각 채널에 무게 셀 개수를 다음과 같이 거리에 의해 세포의 마이 그 레이션, 여행 무게 chemotaxis 마이 그 레이션 계수 (CMC)를 계산합니다. 멀리 높은 농도 위치 (채널 64)로 이동 세포가 높은 농도 측면에 중간 이동 하나가 0.5의 가중치를 부여이지만, 하나의 가중치를 부여하고, 세포가 멀리로 이동합니다 낮은 농도의 위치는 -1에 의해 가중치입니다. 모든 가중 셀 카운트를 합계하여 CMC를 생성하는 세포의 숫자를 정상화.

대표 결과 ^3,4 :

우리가 사용한 microfluidic 장치 (그림 1A)은 E.의 chemotaxis를 조사하기 위해 여기에서 설명한 attractants (아스파르트산, autoinducer - 2)와 repellents (NiSO ₄ 인돌) ^3,4의 그라디언트에서 대장균. prototypical chemotaxis 변형 ⁵ E. 대장균 RP437 표현 GFP는 kanamycin - 살해 E.와 함께 사용했습니다 흐름 효과를 모니터링하는 빨간색 형광 단백질을 표현하는 대장균 TG1 세포. μFlow 장치를 형성 농도 기울기는 그림 1B에 표시됩니다. 셀 입구는 그것을 통해 어떤 흐름과 fluoresscein의 NG / ML이 장치에 설립되었습니다 0 100 안정적인 그라디언트가 있다고하지 않도록 뒤덮인했다. 장치를 통해 픽셀 강도는 플루오레신의 농도 프로파일을 결정하는 데 사용되었다. 데이터들은 chemotaxis 챔버를 입력하면 박테리아가 선형 그라디언트가 발생하는 것을 보여줍니다. 그림 2A와 B는 E.의 형광 이미지를 보여줍니다 아스파르트산 (0 100 μm의)와 NiSO ₄ (0 225 μm의)의 기울기에 대한 응답으로 대장균 RP437 마이 그 레이션. 관찰된 이러한 표준 유인에 반응하고 구충제는 것을 예측할 수 있습니다. 그림 3A는 E.의 계량 분포를 보여줍니다 대장균 RP437 농도 기울기의 부재 (즉, 아스파르트산의 NULL 그라데이션)에, 동안그림 3B와 C는 아스파르트산 및 NiSO ₄ 그라디언트의 분포를 보여줍니다. 이러한 반응의 특이성 (즉, 마이 그 레이션의 편견)은 E.으로 분명하다 대장균 RP437 Δ 타르 변형 (즉, 아스파르트산 및 니켈을 감지 E. 대장균에서 사용되는 타르 chemoreceptor을 부족 변형)은 아스파르트산 또는 NiSO ₄ 농도 기울기의 존재에 마이 그 레이션에 편견을 설명하지 않습니다. 공간적 분포의 프로필에 확연히 경향도 계산 클릭당 비용 (CPC) 및 CMC의 가치와 일​​치하고 있습니다. E. 마이 그 레이션에 대한 클릭당 비용 (Max) 아스파르트산 또는 NiSO ₄ 그라디언트에서 대장균 RP437는 각각 0.33와 -0.33입니다. 해당 CMC 값은 각각 0.13와 -0.14입니다. E.과는 대조적으로, 클릭당 비용 (CPC) 및 CMC는 값 아스파르트산 또는 NiSO ₄ 그라디언트에서 대장균 RP437 Δ 타르 변형은 무시할 수 있습니다. 또한, 아스파르트산의 NULL 그라데이션의 클릭당 비용 (CPC) 및 CMC는 각각 0.03과 0.02,, 그리고 그라디언트의 부재에서 마이 그 레이션에 편견의 부족을 나타냅니다.

그림 1. 장치의 약도와 농도 기울기.
microfluidic chemotaxis 장치 (A) 도식 표현. 이 장치는 그라디언트 - 혼합 모듈 (20 X 100 X 18750 μm의)와 chemotaxis 관찰 모듈 (20 X 1050 X 11500 μm의)로 구성되어 있습니다. 장치를 입력 두 그라디언트 채널의 폭은 500 μm의 및 세균의 입구의 넓이가 50 μm의집니다. 삽입된 페이지는 신호 분자 (회색)과 그것에 대한 응답으로 마이 그 레이션 박테리아의 그라디언트를 묘사. 죽은 박테리아가 오픈 타원으로 표시됩니다 반면 라이브 세균은 탄탄한 타원으로 그려져있다. (B) 0과 100 NG / ML 플루오레신 사이의 농도 기울기는 장치에 생성하고 형광 현미경을 사용하여 몇 군데했다. 형광 이미지는 30 분 후 인수 및 이미지 분석에 의해 계량되었습니다.

그림 2. E.의 Chemotaxis microfluidic 장치의 대장균 RP437.
E. 대장균 RP437은의 구배에 노출되었다 (A) 000-100 μm의 L - aspartate 또는 (B) 0-225 장치 μm의 NiSO ₄ 사는 박테리아의 마이 그 레이션 (녹색) L - aspartate 방향이나 거리에서 니켈 30 분마다 2.5 초 몇 군데. 죽은 박테리아 (적색)은 장치의 흐름 효과에 대한 컨트롤을 역임했습니다. 이미지 분석 program3을 개발 자체를 사용하여 계량되었습니다. 표시된 데이터는 세 독립적인 실험의 대표 의사 색의 이미지입니다.

그림 3 : 표준 유인과 혐오감으로 마이 그 레이션 프로필 부량.
에 대한 응답으로 microfluidic 장치에 RP437의 공간적 분포 (A) 유니폼을 100 μm의 L - aspartate (예, 아니 그라데이션), aspartate의 (B) 0 100 μm의 기울기, 그리고 NiSO ₄ (C) 0 225 μm의 기울기 . 죽은 세포의 분포는 실선으로 표시됩니다, RP437 세포의 분포는 점선으로 표시되며, RP437 EDA ⁺ Δ 타르 세포의 분포는 점선으로 표시됩니다. 표시된 데이터는 세 독립적인 실험을 위해 평균입니다.

Discussion

마오 외 ^5에서 설명한대로 chemotaxis 파티션 계수 (CPC) 및 chemotaxis 마이 그 레이션 계수 (CMC)을 계산하실 수 있습니다. 세포가 높은 농도 측면에서 감지되는 경우 낮은 농도 측면에서 감지 세포가 -1의 값을 주어진 반면, 그것은, 하나의 값을 주어집니다. 값이 최대 표현하고 클릭당 비용 (CPC)을 생성하는 세포의 총수로 나누어집니다. CPC (긍정적이거나 부정적인)의 신호는 마이 그 레이션의 방향을 (신호에서 방향 또는 거리) 제공합니다. 클릭당 비용 (CPC)은 세포가 유인 또는 혐오감을, 그것이 chemotaxis의 범위를 계량하지 않는 등 화학 물질에 반응하는지 여부를 나타냅니다 있지만. 이를 위해, 우리는의 거리에 따라 64 섹션 (세포 입구의 양쪽에 32)에 장치의 던졌다 박테리아의 공간적 분포 프로필을 나누어, 각 섹션에서 세포에 가중치를 지정하여 CMC를 계산 마이 그 레이션. 센터 (섹션 1과 64)에서 멀리 떨어져 섹션들은 최대 거리를 마이 그 레이션이 세포를 포함하는 이후 +1 (= 31.5/31.5) 또는 -1 곱한 수 있습니다. 다음 두 섹션은 (2 63) 0.968 (= 30.5/31.5) 또는 -0.968 곱한 수 있습니다. 마지막 두 부분은 (세포 입구와 가장 가까운 즉, 32 33) + 0.015 (= 0.5/31.5) 또는 -0.015 곱한 수 있습니다. 가중치 값은 표현 및 CMC를 생성하는 세포의 총수로 정상화됩니다. 하나의 CMC는 모든 박테리아가 흐름 챔버의 벽에 그라디언트까지 완전히 이동했음을 나타냅니다. 클릭당 비용 (CPC) 값은 여전히​​ 한 것입니다 반면 온화한 매력적인 응답의 경우, CMC는 여전히 긍정적인 수 있지만 작은 값을 것입니다. 따라서 CMC는 마이 그 레이션의 범위에 따라 반응이 세포를 차별.

특정 매개 변수 chemotaxis 실험을 수행하는 동안 신중하게 제어해야합니다. 박테리아가 재배되는 온도가 중요합니다. E. 들어 대장균, 우리는 최고의 성장 온도가 32 ° C 이상 기온이 운동성을 감소 것을 관찰했습니다. 특정 수용체​​가 세균에 존재하기 위해서는, 그것은 chemoeffector 유도의 존재 (즉, chemotaxis에 대한 세포를 주요로)에있는 박테리아의 성장을 할 수 있습니다. 예를 들면, 말토오스에 박테리아의 반응을 조사하면 세포는 설탕의 0.1 % (W / V)와 함께 성장하고 있습니다. 원심 분리 후 박테리아를 resuspending 때, 흔들림 / 튜브 롤링 부드러운 수행되고 세포 vortexed되지 않은 것이 중요합니다. 활발한 떨고 테스트되고있는 세포의 운동성을 감소 전단 flagella을 수 있습니다. 장치에 사용되는 유량이 테스트되고있는 세균의 운동성에 따라 결정되어야합니다. 느린 유량이 적은 운동성이있는 아르 세균에 필요한 수 있으며, 최적의 유량은 경험적으로 결정되어야합니다.

우리는 μFlow 장치가 세균성 chemotaxis (예를 들어, 같은 수용체에 대한 chemoeffectors 간의 경쟁)뿐만 아니라 attractants 또는 repellents 같은 특정 화학 물질에 대응 환경 샘플에서 박테리아를 식별로 근본적인 수사 사용할 수 것으로 예상.