Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

Etablering af en fysiologisk human vaskulariseret mikrotumormodel til kræftforskning

Published: September 15, 2023 doi: 10.3791/65865
Automatic Translation
1, 1, 1,2
1Molecular Biology and Biochemistry, University of California, Irvine, 2Biomedical Engineering, University of California, Irvine

Summary

Denne protokol præsenterer en fysiologisk relevant tumor-on-a-chip-model til at udføre grundlæggende og translationel human kræftforskning med høj kapacitet, fremme lægemiddelscreening, sygdomsmodellering og personaliserede medicinmetoder med en beskrivelse af belastnings-, vedligeholdelses- og evalueringsprocedurer.

Abstract

Mangel på validerede kræftmodeller, der rekapitulerer tumormikromiljøet i solide kræftformer in vitro , er fortsat en betydelig flaskehals for præklinisk kræftforskning og terapeutisk udvikling. For at overvinde dette problem har vi udviklet den vaskulariserede mikrotumor (VMT) eller tumorchip, et mikrofysiologisk system, der realistisk modellerer det komplekse humane tumormikromiljø. VMT dannes de novo inden for en mikrofluidisk platform ved samdyrkning af flere humane celletyper under dynamiske, fysiologiske strømningsbetingelser. Denne vævsmanipulerede mikrotumorkonstruktion inkorporerer et levende perfuseret vaskulært netværk, der understøtter den voksende tumormasse, ligesom nydannede kar gør in vivo. Det er vigtigt, at lægemidler og immunceller skal krydse endotellaget for at nå tumoren og modellere in vivo fysiologiske barrierer for terapeutisk levering og effektivitet. Da VMT-platformen er optisk gennemsigtig, kan billeddannelse i høj opløsning af dynamiske processer såsom immuncelleekstravasation og metastase opnås med direkte visualisering af fluorescerende mærkede celler i vævet. Endvidere bevarer VMT in vivo tumorheterogenitet, genekspressionssignaturer og lægemiddelresponser. Næsten enhver tumortype kan tilpasses platformen, og primære celler fra friske kirurgiske væv vokser og reagerer på lægemiddelbehandling i VMT, hvilket baner vejen for virkelig personlig medicin. Her skitseres metoderne til etablering af VMT og anvendelse af den til onkologisk forskning. Denne innovative tilgang åbner nye muligheder for at studere tumorer og lægemiddelresponser, hvilket giver forskere et kraftfuldt værktøj til at fremme kræftforskning.

Introduction

Kræft er fortsat et stort sundhedsproblem på verdensplan og er den næststørste dødsårsag i USA. For året 2023 alene forventer National Center for Health Statistics mere end 1.9 millioner nye kræfttilfælde og over 600,000 kræftdødsfald, der forekommer i USA1, hvilket fremhæver det presserende behov for effektive behandlingsmetoder. Men i øjeblikket får kun 5,1% af anticancerterapi, der går ind i kliniske forsøg, i sidste ende FDA-godkendelse. Lovende kandidaters manglende succes gennem kliniske forsøg kan delvis tilskrives brugen af ikke-fysiologiske modelsystemer, såsom 2D- og sfæroidkulturer, under præklinisk lægemiddeludvikling2. Disse klassiske kræftmodeller mangler væsentlige komponenter i tumormikromiljøet, såsom en stromal niche, associerede immunceller og perfuseret vaskulatur, som er nøgledeterminanter for terapeutisk resistens og sygdomsprogression. Således er et nyt modelsystem, der bedre efterligner det humane in vivo tumormikromiljø, nødvendigt for at forbedre den kliniske oversættelse af prækliniske fund.

Området for vævsteknik udvikler sig hurtigt og giver forbedrede metoder til at studere menneskelige sygdomme i laboratorieindstillinger. En væsentlig udvikling er fremkomsten af mikrofysiologiske systemer (MPS), også kendt som organchips eller vævschips, som er funktionelle, miniaturiserede menneskelige organer, der er i stand til at replikere sunde eller syge tilstande 3,4,5. Inden for denne sammenhæng er tumorchips, som er tredimensionelle mikrofluidisk-baserede in vitro humane tumormodeller, blevet udviklet til onkologisk forskning 2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13 . Disse avancerede modeller inkorporerer biokemiske og biofysiske signaler inden for et dynamisk tumormikromiljø, hvilket gør det muligt for forskere at studere tumoradfærd og reaktioner på behandlinger i en mere fysiologisk relevant sammenhæng. På trods af disse fremskridt har få grupper imidlertid med succes indarbejdet en levende, funktionel vaskulatur, især en, der selvmønstrer som reaktion på fysiologisk strømning 3,4,5,6. Inkluderingen af et funktionelt vaskulært netværk er afgørende, da det giver mulighed for modellering af fysiske barrierer, der påvirker lægemiddel- eller cellelevering, cellehoming til forskellige mikromiljøer og transendotelmigration af tumor-, stromale og immunceller. Ved at inkludere denne funktion kan tumorchippen bedre repræsentere de kompleksiteter, der observeres i in vivo-tumormikromiljøet.

For at imødekomme dette uopfyldte behov har vi udviklet en ny lægemiddelscreeningsplatform, der gør det muligt for mikrokarnetværk at danne sig i en mikrofluidisk enhed 8,9,10,11,12,13,14,15,16. Denne basisorganchipplatform, kaldet det vaskulariserede mikroorgan (VMO), kan tilpasses stort set ethvert organsystem for at replikere original vævsfysiologi til sygdomsmodellering, lægemiddelscreening og personlige medicinapplikationer. VMO'er etableres ved co-kultivering af endotelkolonidannende celleafledte endotelceller (ECFC-EC), HUVEC eller iPSC-EC (herefter EC) og flere stromale celler i kammeret, herunder normale humane lungefibroblaster (NHLF), som ombygger matrixen, og pericytter, der ombryder og stabiliserer karrene. VMO kan også etableres som et kræftmodelsystem ved co-kultivering af tumorceller med den tilhørende stroma for at skabe en vaskulariseret mikrotumor (VMT) 8,9,10,11,12,13 eller tumorchip, model. Gennem samdyrkning af flere celletyper i et dynamisk flowmiljø dannes perfunderede mikrovaskulære netværk de novo i enhedens vævskamre, hvor vaskulogenese reguleres nøje af interstitielle strømningshastigheder14,15. Medium drives gennem enhedens mikrofluidiske kanaler af et hydrostatisk trykhoved, der forsyner de omgivende celler i vævskammeret med næringsstoffer udelukkende gennem mikrobeholderne med en permeabilitetskoefficient på 1,2 x 10-7 cm / s, svarende til hvad der ses for kapillærer in vivo8.

Inkorporeringen af selvorganiserende mikrokar i VMT-modellen repræsenterer et betydeligt gennembrud, fordi det: 1) efterligner strukturen og funktionen af vaskulariserede tumormasser in vivo; 2) kan modellere vigtige trin i metastaser, herunder tumorendotel- og stromale celleinteraktioner; 3) etablerer fysiologisk selektive barrierer for levering af næringsstoffer og lægemidler, hvilket forbedrer farmaceutisk screening; og 4) tillader direkte vurdering af lægemidler med antiangiogene og antimetastatiske evner. Ved at replikere in vivo-levering af næringsstoffer, lægemidler og immunceller i et komplekst 3D-mikromiljø er VMO/VMT-platformen en fysiologisk relevant model, der kan bruges til at udføre lægemiddelscreening og studere kræft-, vaskulær- eller organspecifik biologi. Det er vigtigt, at VMT understøtter væksten af forskellige typer tumorer, herunder tyktarmskræft, melanom, brystkræft, glioblastom, lungekræft, peritoneal carcinomatose, kræft i æggestokkene og kræft i bugspytkirtlen 8,9,10,11,12,13. Ud over at være billig, let etableret og opstillet til eksperimenter med høj gennemstrømning, er den mikrofluidiske platform fuldt optisk kompatibel til billedanalyse i realtid af tumor-stromale interaktioner og respons på stimuli eller terapi. Hver celletype i systemet er mærket med en anden fluorescerende markør for at muliggøre direkte visualisering og sporing af celleadfærd gennem hele eksperimentet, hvilket skaber et vindue ind i det dynamiske tumormikromiljø. Vi har tidligere vist, at VMT mere trofast modellerer in vivo tumorvækst, arkitektur, heterogenitet, genekspressionssignaturer og lægemiddelresponser end standardkulturmodaliteter10. Det er vigtigt, at VMT understøtter vækst og undersøgelse af patientafledte celler, herunder kræftceller, som bedre modellerer patologien for modertumorerne end standard sfæroidkulturer og yderligere fremmer personlig medicinindsats11. Dette manuskript skitserer metoderne til etablering af VMT og viser dets anvendelighed til at studere humane kræftformer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Design og fabrikation

  1. Enhedens design
    1. Til fremstilling af mikrofluidiske enheder oprettes en SU-8-form ved hjælp af et 200 μm lag SU-8 spin-coated på en Si-wafer (RCA-1 renset og 2% hydrogenfluorid (HF) behandlet), efterfulgt af et enkelt maske fotolitografitrin som beskrevet tidligere 8,9.
    2. Støbt en 4 mm tyk polydimethylsiloxan (PDMS) replika fra SU-8-formen for at generere en holdbar polyurethanform til nedstrøms fabrikationstrin. Forskellige designiterationer kan bruges 8,9,10,11,12,13,14,15.
    3. I den aktuelle iteration skal du designe den mikrofluidiske enhed, der skal tilpasses til et standard 96-brønds pladeformat og bestå af et 2 mm tykt PDMS-funktionslag med 12 mikrofluidiske enhedsenheder omgivet af et tyndt (1/16 tommer) gennemsigtigt polymermembranlag i bunden (figur 1A).
    4. Sørg for, at individuelle vævsenheder består af et vævskammer flankeret af gelbelastningsindløb (L1) og udløb (L2), en trykregulator (PR)16 og afkoblede mikrofluidiske kanaler forbundet til 2 medieindtag og -udtag på hver side (M1-M2, M3-M4; Figur 1B).
    5. Hvert indløb og udløb placeres i en enkelt brønd, der fungerer som et medium reservoir til etablering af hydrostatisk tryk (10 mm H2O) over den mikrofluidiske kanal. For at tillade vaskulære netværksanastomoser med de ydre kanaler skal du forbinde mikrofluidiske kanaler til vævskammeret via 50 μm brede kommunikationsporer (6 øverst, 6 nederst).
      BEMÆRK: Mikrofluidiske modstande skaber en 5 mm H2O interstitiel trykgradient over vævskammeret, der bliver intraluminal, når det vaskulære netværk er fuldt dannet 8,10. De efterfølgende procedurer begynder med en fuldt monteret høj gennemstrømningsplade.

Figure 1
Figur 1. Design af mikrofluidisk platform. (A) Skemaet over platformsenheden viser PDMS-funktionslaget med 12 enhedsenheder bundet til en bundløs 96-brøndplade og forseglet med en tynd gennemsigtig polymermembran. Hver enhedsenhed optager en kolonne af brønde på pladen. Den enkelte enhedsenhed, der er skitseret med rødt, vises med detaljer i (B). B) Skematisk oversigt over en udstyrsenhed viser et enkelt vævskammer placeret i en brønd på 96-brøndpladen og to påfyldningsporte med hul i indløb og udløb (L1-L2) for at muliggøre cellematrixblanding. Mellemstore indløb og udløb (M1-M2, M3-M4) er hulstansede og placeret i brønde, der fungerer som mediereservoirer. Forskellige medievolumener etablerer en hydrostatisk trykgradient over vævskammeret via afkoblede mikrofluidiske kanaler. Trykregulatorenheden (PR) fungerer som en gelsprængningsventil for at øge belastningen. Bemærk, at enheden er 200 μm dyb, og vævskammeret er 2 mm x 6 mm. Klik her for at se en større version af denne figur.

2. Forberedelser inden lastning

  1. Cellekultur
    1. Vedligehold celler i henhold til producentens anbefalinger i en befugtet 37 °C og 5% CO2 inkubator.
    2. Plade T75-kolber af transduceret EC, NHLF eller andre fibroblast/stromale celler og ønskede kræftceller 3-4 dage før påfyldning med en densitet informeret af fabrikant og brugerprotokoller. I denne protokol plades 1 x 106 celler pr. kolbe for hver celletype. Kultur EC i endotelvækstmedier 2 (EGM2) komplette medier, NHLF i Dulbeccos modificerede ørnemedium (DMEM) med 10% FBS og kræftceller i passende medier afhængigt af celletype.
    3. Vedligehold celler ved at fodre med de respektive medier hver 2-3 dage og genbekræft transduktions- eller mærkningseffektiviteten ved at visualisere celler under et fluorescerende mikroskop. På indlæsningsdagen skal du sikre dig, at EC er 80% -100% sammenflydende, mens NHLF er subconfluent med 70% -80%.
  2. Fremstilling af fibrinogen
    1. Forbered fibrinogenopløsningen til den ønskede koncentration (typisk understøtter 5-8 mg / ml robust vaskulær netværksdannelse), der tegner sig for den procentvise koagulation af fibrinogen. Beregn mængden af fibrinogen, der er nødvendig med følgende ligning:
      Fibrinogen (mg) = (volumen (ml)) x (koncentration (mg/ml))/ (koagulations%)
    2. Fibrinogenet opløses i et passende volumen endotelialmedier 2 (EBM2), opvarmet til 37 °C, ved forsigtigt at svirpe med tuben (hvirvelstrømmen må ikke svirpes). Fibrinogen inkuberes i et 37 °C-vandbad, så det kan opløses fuldstændigt. Det er vigtigt, at du ikke bruger et komplet medium.
    3. Fibrinogenopløsning med sterilfilter med 0,22 μm filter og alikvote til ønsket volumen, typisk 400 μL pr. mikrocentrifugeglas.
      BEMÆRK: Andre matrixproteiner (fx kollagener, fibronectin eller laminin) kan spikes ind i fibrinogenblandingen.

3. Indlæsning af prøver

BEMÆRK: Indlæsning er tidsfølsom og skal udføres fra start (celleløft) til slut (tilføjelse af medier til enheder) inden for ca. 1,5-1,75 timer for at sikre optimale resultater. Hvert trin noteres med en foreslået timer for at hjælpe med at holde brugeren på sporet.

  1. Forberedelse af materialer (lastningsdag)
    1. Anbring følgende i et 37 °C vandbad i 10-15 min: Hanks afbalancerede saltopløsning (HBSS) eller fosfatbufferet saltvand (PBS) til vask af celler, celledissociationsreagens, medier (f.eks. EGM2, DMEM)
    2. Følgende reagenser opbevares i køleskab ved 4 °C, indtil de er klar til brug: thrombin, laminin (optøet natten over ved 4 °C).
    3. Optø fibrinogen alikvote ved stuetemperatur. Der fremstilles 1,5 μL alikvoter thrombin i 500 μL mikrocentrifugeglas med et rør pr. enhed. Sørg for, at trombinprøven er i bunden af hvert rør for at lette belastningen.
    4. Anbring UV-steriliserede plader med høj kapacitet i en ekssikkator i mindst 30 minutter før påfyldning for at fjerne luft fanget i mikrofluidikken.
  2. Celleforberedelse (timerstart = start ved 0 min)
    1. Kontroller celler under mikroskopet ved 4x forstørrelse for at bekræfte sammenløb og transduktionseffektivitet.
    2. Hver T75-kolbe celler vaskes 2x med 5 ml HBSS og aspireres fuldstændigt. Der tilsættes 1 ml dissociationsreagens til hver kolbe og inkuberes ved 37 °C, 5 % CO2 i 1-2 min.
    3. Bank let på pladen med håndfladen, og kontroller, at alle celler er løftet.
    4. Kolben vaskes af med 9 ml passende medie og samles i en 15 ml konisk. Fjern straks en lille prøve til celletælling.
    5. Centrifuger cellerne ved 300 x g i 3-5 minutter ved 4 °C. Mens du centrifugerer celler, tælles cellerne. En sammenflydende T75-kolbe med EC eller NHLF skal give mindst 2 x 106 celler.
    6. Efter centrifugering aspireres og pellet resuspenderes i passende medier i en koncentration på 1 x 106 celler/ml. Hold celler på is.
  3. Fremstilling af celle- og fibrinogenblanding (Timer = start ved 20 min)
    1. Bestem, hvor mange enheder der skal indlæses, tilføj 1-2 for at tage højde for pipetteringstab, og gang med mængden af celle/fibrinogenblanding, der kræves pr. enhed. Dette afhænger af enhedens konfiguration, men for enhedsdesignet, der præsenteres i denne artikel, kræves 6 μL pr. Enhed.
    2. Koncentrationen af hver celletype bør bestemmes eksperimentelt. For et udgangspunkt indlæses EC i en koncentration på ca. 7 x 106 celler/ml og NHLF i en koncentration på 3,5 x 106 celler/ml. Koncentrationen af kræftceller kan variere betydeligt baseret på deres væksthastighed, men ligger typisk i området 0,5-2 x 106 celler / ml. Brug denne ligning til at beregne antallet af celler, der er nødvendige:
      Antal nødvendige celler = (volumen fibrin (μL))/1000 μL x (koncentration af celler)
    3. Resuspender cellerne i en koncentration på 1 x 106 celler / ml og brug følgende ligning til at bestemme det nødvendige volumen af celler:
      Volumen af nødvendige celler (μL) = (antal nødvendige celler)/1000
    4. Bland respektive volumener af EC-, NHLF- og kræftceller (kun for VMT) i et konisk rør og centrifuger ved 300 x g i 3-5 minutter ved 4 °C.
    5. Efter centrifugering skal du forsigtigt aspirere medier og pipet eventuelle resterende medier i nærheden af pelleten. Resuspender forsigtigt men grundigt pelleten i det beregnede volumen fibrinogen, og pas ekstra på ikke at indføre luftbobler. Hold på is.
    6. Bring steriliserede plader og trombinprøver ind i vævskulturhætten.
  4. Indlæsning af enheder (Timer = start ved 30-35 min)
    1. Ved hjælp af en P20-pipette pipetteres 6 μL volumen fra celle/fibrinblandingen. Sørg for at pipet blandingen op og ned mindst 5x for at sikre ensartet cellesuspension. Hold blandingen på is for langsom koagulation.
    2. Bland forsigtigt cellen/fibrinet i en tube thrombin ved at sætte pipetspidsen direkte ind i trombinprøven i bunden af røret. Pipet straks op og ned mindst 2x, pas på ikke at indføre luftbobler. Fibrinet begynder at størkne, når det blandes med thrombin, så hurtigt men bevidst fuldfør trin 3.4.3. og 3.4.4. før fibringelerne i pipettespidsen (~3 s).
    3. Løft pladen med høj kapacitet skråt, og indsæt hurtigt pipetspidsen i en af enhedens ilægningsporte (L1 eller L2). Se skematisk figur 2A .
    4. Tryk pipetstemplet ned til første stop med en jævn, flydende bevægelse for at injicere celle/fibrinblandingen i vævskammeret. Hold øje med, at gelen krydser helt gennem kammeret.
      BEMÆRK: Anvendelse af for meget tryk under dette trin kan føre til sprængning af gelen i de mikrofluidiske kanaler øverst og / eller nederst i vævskamrene.
    5. Placer forsigtigt pladen fladt ned igen i vævskulturhætten uden at fjerne pipettespidsen, frigøre pipettestemplet eller forstyrre pipetten. Brug din hånd til at dreje og fjerne pipettespidsen fra P20, og lad den blive i hullet i læsseporten. Brug ikke ejektorknappen til at fjerne spidsen, da dette vil medføre for meget tryk.
    6. Fortsæt med trin 3.4.1-3.4.5 for de resterende enheder.
    7. Når påfyldningen er færdig, skal du lade pladen sidde uforstyrret i 2 minutter i vævskulturhætten.
    8. Fjern pipettespidserne ved forsigtigt at dreje og trække dem ud af lasteportene. Sæt låget på pladen på igen.
    9. Hele pladen inkuberes i 15-20 minutter i en inkubator på 37 °C, så gelen polymeriseres fuldt ud.
    10. Efter inkubation skal du kontrollere hver enhedsenhed under mikroskopet. Kontroller, at cellerne er jævnt fordelt i kammeret uden luftbobler, og at der er en klart synlig gelgrænseflade mellem vævskammeret og de mikrofluidiske kanaler, som i figur 2B-C.
  5. Kanalbelægning med laminin (Timer = start ved 45-50 min)
    1. Når gelerne er helt faste, introduceres laminin i de mikrofluidiske kanaler for at fremme vaskulær anastomose.
    2. Brug en P20 til at indføre 4 μL laminin i hver mikrofluidisk kanal (top og bund) på enheden. Indsæt pipetspidsen i M1 eller M3, og fjern laminin langsomt, mens du holder øje med, at laminin dækker hele den øverste kanal, og gentag derefter for M2 eller M4 for at belægge hele den nederste kanal.
    3. Bestem retningen ved at pipettere laminin fra den modsatte side af trykregulatoren for at tillade tilstrækkeligt tryk til at skubbe det igennem. Men hvis laminin ikke rejser let fra den ene side, skal du fjerne spidsen fra den ene side og skubbe laminin fra den anden side. Det kan være nødvendigt at gå til pipettens andet stop (dvs. skubbe stemplet helt i bund) for at generere tilstrækkeligt tryk til at skubbe laminin gennem hele kanalen.
    4. Fjern forsigtigt spidsen fra medieindgangen/-udgangen. Brug ikke ejektorknappen på P20.
    5. Trin 3.5.1-3.5.4 gentages for hver anordning, og pladen inkuberes ved 37 °C, 5 % CO2 i 10 minutter.
  6. Medietilføjelse (Timer = start ca. 1 time og 10 min)
    1. Der tilsættes 275 μL EGM2 komplette medier i de ikke-koblede mediebeholdere i hullerne i række A og B eller G og H. Dette vil være den høje side, og orienteringen skal bestemmes ved at gøre brøndene på siden modsat trykregulatoren højt volumen for at starte. Medier vil blive skubbet fra den høje side af tyngdekraften.
    2. Ved hjælp af en P200-pipette indføres 75 μL medier i de mellemstore indtag/udløb i hullerne, der indeholder 275 μL EGM2. Indsæt spidsen i medieindløbshullet, og skub langsomt mediet ud, idet du ser, at mediet bevæger sig gennem kanalen og bobler op på den anden side.
    3. Fjern pipetspidsen, og skub det resterende medie fra spidsen ind i mediebeholderen, så det samlede volumen på den høje side er 350 μL.
    4. Gentag trin 3.6.1-3.6.3 for hver enhedsenhed, øverste og nederste kanal.
    5. Der tilsættes 50 μL medier for helt at dække den lave side, hullerne i række A og B eller G og H, afhængigt af retningen beskrevet ovenfor. Sørg for, at der er et jævnt lag af medier, der dækker bunden af brønden. Se figur 2D for et skema, der viser mængden af medier i reservoirerne.
  7. Fjernelse af luftbobler (efterbelastning)
    BEMÆRK: Fjernelse af bobler er et kritisk trin for at sikre korrekt flow i hver enhed. På dag 2 begynder endotelceller og fibroblaster at strække sig ud som reaktion på strømning (figur 2E).
    1. Når alle medier er tilsat, inkuberes pladerne i 1-2 timer i en 5 % CO2 -inkubator på 37 °C, før der kontrolleres for luftbobler i kanalerne eller ved mediets indtag/udløb.
    2. Visualiser bobler i mediekanalerne på mikroskopet og udstød ved at genindføre 75 μL medier i kanalerne for at skubbe boblerne ud.
    3. Visualiser bobler i mediets indløb/udløb med øjet. Brug en P200-pipette til at fjerne luftbobler, der sidder fast ved de mellemstore indtag og udløb, ved at skubbe stemplet ned, føre spidsen ind i hullet og trække boblen ud ved at løfte stemplet for at anvende undertryk og suge boblen op.

Figure 2
Figur 2. Skematisk af enhedens indlæsning. A) Ved hjælp af en P20-pipette føres celle/fibrin-blandingen ind i vævskammeret i hver udstyrsenhed via en af påfyldningsportene. (B) Brightfield-mikrografi viser en mikrofluidisk enhed indlæst EC, fibroblaster og kræftceller til dannelse af en VMT. Skalabjælke = 500 μm. (C) Fluorescensmikrografi af enheden i B, der viser EC i rødt, tumor i cyan og fibroblaster i blåt. (D) Skemaet viser tilsætning af medium til reservoirerne med 350 μL på den høje side og 50 μL på den lave side for at generere det hydrostatiske trykhoved. (E) Dag 2 i VMT-kulturen viser, at fibroblaster og EC begynder at strække sig ud for at danne det vaskulære netværk. Skalabjælke = 200 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.

4. Vedligeholdelse af enheder og eksperimentelle applikationer

  1. Vedligeholdelse og lægemiddelbehandling
    BEMÆRK: For at opretholde flowet i systemet skal hydrostatisk tryk genetableres dagligt ved at pipettere medievolumen fra den lave side tilbage til den høje side eller omvendt, hvilket sikrer, at det samlede volumen i den høje side forbliver på 350 μL. Strømningsretningen skiftes hver dag efter dag 2 i VMO- eller VMT-etablering. Yderligere vedligeholdelses- og behandlingsoplysninger findes nedenfor.
    1. Skift medie hver anden dag med EGM2 færdig, indtil vaskulaturen er fuldt etableret (dag 5-6). Opsug gamle medier fuldstændigt, og udskift højtryksbrønde (350 μL) og lavtryksbrønde (50 μL).
      BEMÆRK: Eksperimentel bestemmelse af optimerede medieformuleringer kan udføres for andre celletyper, der ofte involverer en 50:50 blanding eller tilsætning af specifikke komponenter til EGM2.
    2. Når det vaskulære netværk er dannet, og vævet er fuldt udviklet (dag 4-7), udføres en dextranperfusionstest, inden apparaterne anvendes til forsøg (trin 4.2.1.). Brug kun enheder, der har tilstrækkelig perfusion i vævskammeret.
    3. For eksperimenter, der bruger terapi, skal du på dagen behandlingen begynder, tage billeder i alle fluorescerende kanaler for hver enhed. Dette vil tjene som en basislinje.
    4. Behandl enheder med ønsket terapeutisk ved at erstatte mediet med frisk medium indeholdende det fortyndede lægemiddel i den ønskede koncentration. Sørg for, at lægemidler fortyndes i passende køretøjer afhængigt af producentens anbefaling, men overskrid ikke 0,01% DMSO i medierne.
    5. Udsæt enheder for lægemidlet i den ønskede tid (typisk 48 timer, men kan informeres af farmakokinetik).
    6. Afbild hver kanal på hver enhed med det ønskede tidsinterval for at overvåge behandlingsrespons. Pladerne vedligeholdes som angivet i trin 4.1.1 under hele eksperimentet.
    7. Efter afslutningen af forsøget bleges pladerne og anbringes i en biologisk farlig beholder, fastgøres med 4% PFA til immunofluorescerende farvning (trin 4.3.) eller høstes til levende celle- eller RNA-isolering (trin 4.4.).
  2. Perfusionsanalyser
    1. Perfusion af dextran
      BEMÆRK: Vaskulær permeabilitet / patency kan bestemmes ved perfusering af det vaskulære netværk med fluorescerende mærket dextran med varierende molekylvægt (40 kD, 70 kD eller 150 kD). FITC- eller rhodamin-dextran kan anvendes afhængigt af EC's fluorescerende etiket.
      1. Før perfusion bestemmes den passende eksponering af FITC- eller rhodaminkanalen ved at tilsætte et par μL dextran i væskekanalen eller kammeret i en tom enhed. Indstil eksponeringstiden lige under mætningsniveauet ved hjælp af mikroskopsoftware til at vise et histogram af pixelintensiteter, hvilket sikrer et dynamisk område kendetegnet ved ensartet fordelte pixels uden nogen bemærkelsesværdig koncentration af højintensitetsværdier.
      2. Tag mikrografier af alle enheder i kanaler af interesse, herunder et baggrundsbillede af alle enheder i den fluorescerende dextrankanal, for at kalibrere mod baggrunden. Brug den samme eksponering som bestemt ovenfor, og juster vævskammeret i midten af billedrammen for at sikre ensartede billeder til kvantificering.
      3. Der fremstilles et hovedlager af FITC-dextran eller rhodamin-dextran i en koncentration på 5 mg/ml i 1x DPBS. Denne bestand kan opbevares ved 4 °C.
      4. For at forberede et arbejdsmateriale fortyndes 5 mg/ml stammen til en slutkoncentration på 50 μg/ml i EGM2.
      5. Mediet i beholderne udskiftes med den fortyndede dextranopløsning som halvt maksimalt volumen (175 μL i en brønd samt højsiden på vævskammerets øverste eller nederste kanal). Udskift mediet i de andre huller, så den ukoblede højside får 175 μL frisk EGM2 uden dextran, og hullerne på den lave side kun har 50 μL i hver.
        BEMÆRK: Dextran bør kun tilsættes til den ene side af de mikrofluidiske kanaler (top eller bund) for at muliggøre visualisering af farvestof, der bevæger sig gennem højtrykssiden, ind i vaskulærsengen og ud af lavtrykssiden.
      6. Under mikroskopet skal du holde øje med, at den fluorescerende dextran strømmer gennem det vaskulære netværk. Dette vil typisk ske inden for ca. 2 minutter efter tilsætning af farvestoffet til mediebeholderen.
      7. Begynd at afbilde den fluorescerende dextrankanal (og andre kanaler, hvis det ønskes). Dette er T = 0 tidspunkt. Tag yderligere billeder på flere tidspunkter (typisk hvert 10. minut) eller et enkelt slutpunktsbillede.
    2. Perfusion af celler
      BEMÆRK: Forskellige celletyper kan perfuseres gennem vaskulaturen afhængigt af undersøgelsesdesignet, herunder lymfocytter eller makrofager til kræftimmunologiske undersøgelser samt kræftceller til metastaseundersøgelser. Celler skal mærkes fluorescerende for at lette sporing over tid.
      1. Mindst 2 timer før perfuserende celler udføres dextranperfusion på alle enheder som beskrevet ovenfor. Dette trin er vigtigt for at bestemme vaskulær patency inden tilsætning af celler.
      2. Bestem den passende kameraeksponering for de celler, der skal perfuseres. Tag en lille prøve af celler for at se under mikroskopet og indstil eksponeringstiden for den fluorescerende markør. Indstil eksponeringstiden lige under mætningsniveauet.
      3. Tag mikrografier af alle enheder i kanaler af interesse, herunder et baggrundsbillede af alle enheder i den fluorescerende dextrankanal, for at kalibrere mod baggrunden. Der anvendes samme eksponering som bestemt i punkt 4.2.2.1.
      4. Bekræft, at dextran er diffunderet helt ud af vævskamrene, før cellerne høstes til perfusion. Høst og tæl cellerne af interesse.
      5. Resuspender celler med passende densitet i EGM2. For eksempel tilsættes T-celler typisk ved ca. 1 x 106 celler / ml for at efterligne koncentrationen i blodet.
        BEMÆRK: EC er følsomme over for mediesammensætning, men tåler op til 50% blanding med de fleste andre medier. Test på forhånd.
      6. Der tilsættes 175 μL cellesuspension i det ene hul på den høje side af hver enhed, og der tilsættes 175 μL EGM2 komplet til det andet hul. På den lave side tilsættes 50 μL EGM2 komplette medier til begge huller.
      7. Under mikroskopet skal du holde øje med, at de fluorescerende celler strømmer gennem det vaskulære netværk. Dette vil typisk ske inden for ca. 2 minutter efter tilsætning af cellerne til mediebeholderen.
      8. Når cellestrømmen er etableret, skal du begynde at afbilde den fluorescerende cellekanal (og andre kanaler, hvis det ønskes). Dette er T = 0 tidspunkt. Tag yderligere billeder på flere tidspunkter eller et enkelt slutpunktsbillede, afhængigt af undersøgelsesdesignet. For eksempel vil billeddannelse hvert 10. minut resultere i tidsforløb med høj opløsning eller hver 6-12 timer for at spore periodiske cellebevægelser.
  3. Immunofluorescerende (IF) farvning
    1. Aspirer medier fra brønde. Der tilsættes 200 μL 4 % PFA til begge huller på den høje side af hver enhedsenhed og 50 μL til den lave side. Lad PFA løbe gennem kamrene i 15 minutter ved stuetemperatur eller 30 minutter ved 4 °C.
    2. Under inkubationen fremstilles en plade med 24 brønde med 500 μL 1x PBS pr. Brønd. Beregn, hvor mange brønde der er nødvendige for at plette hver enhed.
    3. Fjern PFA helt fra brønde. Vend pladen på hovedet, og fjern forsigtigt plastunderlaget på membranen.
      BEMÆRK: IF-farvning kan også udføres in situ uden at fjerne membranen og enheden. For at gøre dette skal du udføre farvningstrin ved at perfusere reagenser gennem VMO / VMT og øge varigheden af hvert inkubationstrin med ca. 6 gange.
    4. Skræl meget forsigtigt og forsigtigt bundmembranlaget af enhedens funktionslag for at eksponere vævskamrene ved at gribe fat i begge hjørner og trække ned i en langsom og jævn bevægelse. Det meste af vævet skal forblive i vævskammeret. Se figur 3A.
    5. Brug et barberblad eller skalpel til at anvende tilstrækkelig kraft til at skære helt igennem funktionslaget og skære et lille rektangel omkring hver enkelt enhedsenhed, som vist i figur 3B.
    6. Kil en spatel mellem funktionslaget og brøndpladen. Tryk let under funktionslaget for forsigtigt at fjerne hele funktionslaget, der indeholder vævskammeret, fra brøndpladen.
    7. Placer hvert rektangulært PDMS-funktionslagstykke, der indeholder vævet med forsiden nedad, i en enkelt brønd, der indeholder PBS.
    8. Når alle enheder er i brønde, vaskes med PBS ved at placere pladen på en blid vippe i 5 minutter, opsuge PBS fra brønden og erstatte den med 500 μL frisk PBS. Gentag i alt 3 vaske.
    9. Opsug PBS fra hver brønd og permeabiliser væv med 500 μL 0,5% Triton-X i PBS, 2x i 10 minutter hver på en blid vippe. Fjern permeabiliseringsopløsning.
    10. Bloker 500 μL 10% serum i 0,1% Triton-X pr. enhed i 1 time ved stuetemperatur med let vuggen.
    11. Fortynd primære antistoffer i 3% serum i 0,1% Triton-X til den ønskede koncentration og volumen. Fjern blokeringsopløsningen, og tilsæt nok primær antistofopløsning til helt at dække bunden af hvert hul og tillade fri bevægelse af enhedens væv (~ 200 μL). Dæk pladen med en gennemsigtig film.
    12. Pladen rynkes natten over ved 4 °C. Næste dag bringes pladen med enhedens væv tilbage til stuetemperatur (~ 15 min).
    13. Opsug primær antistofopløsning fra hvert hul og vask kamre med 500 μL PBS, 3x i 5 minutter hver på en blid vippe.
    14. Tilsæt 200 μL sekundært antistof i 3% serum i 0,1% Triton-X ved den ønskede koncentration. Inkuber pladen med forsigtig rocking i 1 time ved stuetemperatur i mørket.
    15. Opsug sekundær antistofopløsning og vask med PBS, 3x i 5 minutter hver med blid vuggen. Tilsæt en opløsning af 1x DAPI i 0,1% Triton-X i 10 minutter, mens du vugger i mørket.
    16. Fjern rektangulære enhedsudskæringer, der indeholder farvet væv, fra pladen ved hjælp af pincet, og læg vævssiden opad på et køkkenrulle.
    17. Pipette et par μL (~ 10 μL) antifade opløsning direkte på hvert kammer og dæksel, idet du passer på ikke at indføre bobler. Lad antifade hærde på kamre natten over ved stuetemperatur i mørket, og fortsæt derefter med billeddannelse.
  4. Vævs- og celleisolering til molekylære assays
    BEMÆRK: Hver plade med høj kapacitet indeholder ca. 1-2 x 105 celler, afhængigt af høsttidspunktet. Skaler antallet af eksperimentelle replikater for at tage højde for samlede celler samt potentielt tab under høst.
    1. Enkeltcelleanalyser
      1. Opsug medier fra hver brønd, og vend pladen med høj kapacitet om, så enhedslaget vender opad.
      2. Fjern plastunderlaget på membranen. Fjern meget forsigtigt og forsigtigt PDMS-bundmembranen fra enhedens funktionslag for at eksponere vævskamrene ved at gribe fat i begge hjørner og trække ned i en langsom og jævn bevægelse.
      3. Membranen kan fjernes selv ved korrekt limning. Det meste af vævet skal forblive i vævskammeret efter fjernelse af membranen; Men hvis en del sidder fast på membranen, skal du følge nedenstående trin på selve membranen.
      4. Hver enhed vaskes med 500 μL HBSS eller PBS. Til hver enhed tilsættes 100 μL dissociationsreagens og lad det sidde som en dråbe oven på enheden. Sæt pladen tilbage i 37 °C inkubatoren i 5 min.
      5. Efter fordøjelsen skal du bruge en P200-pipette til pipet op og ned over vævskamrene og opsamle vævene i dissociationsreagenset. Flyt pipetspidsen frem og tilbage over hver enhed for at sikre fuldstændig fjernelse af vævet og opsaml i en 15 ml konisk med 500 μL EGM2 for at neutralisere dissociationsreagenset.
      6. For fuld fjernelse af resterende celler fra vævskammeret tilsættes 500 μL EGM2 til hver enhedsenhed og vaskes med en P200-pipette.
      7. Nedbrydningsopløsningen indeholdende det løsrevne væv centrifugeres ved 300 x g i 5 minutter ved 4 °C for at pelletere enkeltceller og hele væv.
      8. Aspirer forsigtigt medierne og tilsæt 500 μL 1 mg/ml (200 E/ml) collagenase type IV, 0,1 mg/ml hyaluronidase type V og 200 E/ml DNAse type IV i HBSS til vævene.
      9. Efter forsigtig resuspension henstår opløsningen i 2 minutter ved stuetemperatur, før den pipetteres forsigtigt igen for at adskille gelen.
      10. Fordøjelsesblandingen vaskes med 10 ml EGM2 og centrifugeres ved 300 x g i 5 minutter ved 4 °C. Resuspender celler i 1x DPBS med 1% BSA eller HSA og passér gennem et forvædet 70 μm filter ved at dreje ved 200 x g i 1 min.
      11. Tæl cellerne og juster volumenet, så den endelige koncentration er 1000 celler pr. μL. Cellulære suspensioner kan derefter udsættes for FACS, flowcytometri eller enkeltcelle RNA-sekventering.
    2. RNA-isolering fra hele væv
      1. Følg trin 4.4.1.1 og 4.4.1.2 ovenfor.
      2. Der tilsættes ca. 10 μL RNA-lysebuffer på hvert eksponeret vævskammer, hvilket sikrer, at bufferen puljer direkte oven på væv. Brug ikke mere end 100 μL RNA-lysebuffer i alt.
      3. Inkuber i 3 minutter ved stuetemperatur. Brug P20 til pipet op og ned på hver enhedsenhed, og brug pipetspidsen til at skrabe eventuelt resterende materiale fra vævskammeret, hvis det er nødvendigt.
      4. Overfør så meget lysisbuffer som muligt til et 1,5 ml mikrocentrifugerør. Gentag trin 4.4.2.2.-4.4.2.3. for resterende enheder og poolprøver i 1,5 ml røret.
      5. Følg producentens instruktioner til isolering af RNA, afhængigt af sættet eller reagenserne.

Figure 3
Figur 3. Forberedelse af platform til immunfarvning. (A) Skematisk over fuldt monteret enhedsplatform med membranlag ovenpå. For at fjerne membranen skal du forsigtigt trække hvert hjørne af det ydre lag ned i en stabil, blid bevægelse. (B) Når membranlaget er fjernet helt, skal du bruge et blad, skalpel eller kniv til at skære rektangler rundt om vævskammeret i hver udstyrsenhed, idet du skal passe på ikke at skære ind i selve vævet. En spatel kan derefter kiles fast under hvert rektangel for at løsne den fra pladen og placere hver enhed i en enkelt brønd i en 24-brøndplade med PBS til farvning. Klik her for at se en større version af denne figur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Efter de protokoller, der er skitseret her, blev VMO'er og VMT'er etableret ved hjælp af kommercielt købt EC, NHLF og, for VMT, den triple-negative brystkræftcellelinje MDA-MB-231. Etablerede VMO'er blev også perfuseret med kræftceller for at efterligne metastaser. I hver model, på dag 5 af co-kultur, samles et vaskulært netværk selv som reaktion på tyngdekraftdrevet strømning over vævskammeret, der tjener som en kanal til in vivo som levering af næringsstoffer, terapi og kræft eller immunceller til stromal niche (figur 4). VMO'er blev først etableret ved at indføre mCherry-mærket EC i vævskammeret, som vist i figur 4A (dag 0 i kulturen), med en jævn fordeling af celler. På dag 2 i VMO-kulturen begynder EC at strække sig ud og lumenisere (figur 4B), og på dag 4 har EC anastomoseret med de ydre mikrofluidiske kanaler og dannet et kontinuerligt vaskulært netværk (figur 4C). Efter at vaskulaturen dannede anastomoser og forede de ydre kanaler, blev VMO-væv perfuseret med 70 kD FITC-dextran for at bekræfte vaskulær patency (figur 4D). FITC-dextran blev indført i mediebeholderen med det højeste hydrostatiske tryk og fik lov til at perfusere over vævskammeret via mikrobeholdere fra højtrykssiden til lavtrykssiden, som angivet med pilene. I VMO perfuserede FITC-dextran det mikrovaskulære netværk fuldt ud inden for 15 minutter med minimal vaskulær lækage, hvilket bekræftede tæt vaskulær barrierefunktion (figur 4E). MDA-MB-231-celler blev derefter perfuseret ind i VMO, hvor celler klæbede til endotelforingen (figur 4F) og ekstravaserede ind i det ekstravaskulære rum inden for 24 timer efter perfusion og dannede flere mikrometastaser i vævskammeret (figur 4G). Time-lapse mikroskopiske fluorescerende billeder blev taget hver 50 ms med 4x og 10x luftmål på et omvendt konfokalmikroskop for at observere kræftceller, der perfuserer gennem mikrovaskulaturen i realtid (supplerende video 1, supplerende video 2).

I VMO kan T-celler ses ekstravasere ind i det ekstracellulære rum i løbet af 45 minutter (figur 4H-I). Time-lapse fluorescerende mikrografier blev taget på et konfokalmikroskop for at erhverve en z-stak på 150 μm dybde hvert 15. minut for at observere T-celleekstravasation i realtid (supplerende video 3). Som vist i figur 4J blev MDA-MB-231 VMT med fuldt dannede, ikke-utætte kar perfuseret med T-celler (gul), hvoraf mange hurtigt klæbede til vaskulærvæggen (pilespidser; Figur 4K, supplerende video 4, supplerende video 5). Disse resultater, ud over tidligere undersøgelser 8,9,10,11,12,13,14,15, demonstrerer nytten af VMO- og VMT-platformene til henholdsvis immunologi og immun-onkologisk forskning.

Figure 4
Figur 4. Repræsentative resultater for MDA-MB-231 VMT og VMO. A) VMO på dag 0 umiddelbart efter indlæsning af celler i vævskammeret. EC er vist med rødt. Skalabjælke = 500 μm. (B) På dag 2 i VMO-kulturen begynder EC at strække sig som reaktion på strømning. (C) VMO dag 4 viser, at det vaskulære netværk er anastomoseret med de ydre mikrofluidiske kanaler, og karrene er næsten modne. (D) VMO-netværk er fuldt perfuserede og patenterede på dag 5 i kulturen. Fartøjer vist med rødt, 70 kD FITC-dextran grønt. Strømningsretningen er angivet med pile. Skalabjælke = 500 μm. (E) Zoomvisning af perfuseret VMO. Skalabjælke = 100 μm. (F) MDA-MB-231 (cyan) perfuseres gennem det samme VMO-netværk vist i E, og på tidspunktet 0 har kræftceller klæbet til endotelbeholderforingen (pilespidser). Skalabjælke = 100 μm. (G) Ved 24 timer har MDA-MB-231-celler ekstravaseret ind i det ekstracellulære rum og etableret flere mikrometastaser inden for den vaskulære niche. Skalabjælke = 100 μm. (H) Time-lapse konfokal fluorescerende mikroskopi afslører T-celleekstravasation gennem en mikrobeholder i VMO (I) i løbet af 45 min. Pilespidser angiver områder med ekstravasation. Skalabjælke = 50 μm. (J) Triple-negativ brystkræftcellelinje MDA-MB-231 etableres i VMT og perfuseres på dag 5. Skalabjælke = 500 μm. Det vaskulære netværk viser minimal lækage 15 min efter perfusion (indsats, skalabjælke = 100 μm). (K) MDA-MB-231 VMT (samme som i B) er perfuseret med T-celler (gul), med flere områder af T-celle vedhæftning til vaskulærvæggen (pilespidser). Skalabjælke = 500 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.

Supplerende video 1. Perfusion af ovariecancerceller i VMO. Time-lapse fluorescerende mikroskopi af COV362-celler (cyan) perfuseret gennem et vaskulært netværk (rød) og afbildet ved 4x mål hver 50 ms i 1 min. Klik her for at downloade denne video.

Supplerende video 2. Perfusion af triple-negative brystkræftceller i VMO. Time-lapse fluorescerende mikroskopi af MDA-MB-231 celler (cyan) perfuseret gennem et vaskulært netværk (rød) og afbildet ved 10x mål hver 50 ms i 30 s. Klik her for at downloade denne video.

Supplerende video 3. T-celleperfusion af VMO. Time-lapse konfokal fluorescerende mikroskopi fangede processen med T-celleekstravasation gennem et mikrokar i VMO over en 45 minutters varighed. Z-stack-billeder blev taget hvert 15. minut med en trinstørrelse på 2 μm og en dybde på 150 μm. Fartøjet er rødt, T-celler er gule. Klik her for at downloade denne video.

Supplerende video 4. T-celleperfusion af VMT. Time-lapse fluorescerende mikroskopi af T-celler perfuseret gennem MDA-MB-231 VMT ved 4x mål. Billeder blev erhvervet hver 50 ms i 30 s. T-celler vises i gult, MDA-MB-231 i cyan og kar / EC i rødt. Klik her for at downloade denne video.

Supplerende video 5. Zoomvisning af T-celle-VMT-perfusion. Forstørret 10x visning af MDA-MB-231 VMT perfuseret med T-celler (fra supplerende video 4). Billeder blev erhvervet hver 50 ms i 30 s. T-celler vises i gult, MDA-MB-231 i cyan og kar / EC i rødt. Klik her for at downloade denne video.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Næsten hvert væv i kroppen modtager næringsstoffer og ilt gennem vaskulaturen, hvilket gør det til en kritisk komponent til realistisk sygdomsmodellering og lægemiddelscreening in vitro. Desuden er flere maligniteter og sygdomstilstande defineret ved vaskulær endoteldysfunktion og hyperpermeabilitet3. Især i kræft er tumorassocieret vaskulatur ofte dårligt perfuseret, forstyrret og utæt, hvilket fungerer som en barriere for terapeutisk og immuncellelevering til tumoren. Desuden fungerer vaskulatur som en kanal, hvorigennem kræftceller kan metastasere til frø af fjernt væv og letter celle-cellekommunikation, der dæmper immunresponset, samtidig med at det fremmer kræftcellevækst og spredning yderligere. Disse fænomener fremhæver den afgørende rolle, den vaskulære niche spiller i terapeutisk resistens og kræftprogression og behovet for nøjagtigt at modellere tumormikromiljøet under præklinisk undersøgelse. Alligevel inkluderer standard in vitro-modelsystemer ikke passende stromale og vaskulære komponenter eller inkorporerer dynamiske strømningsbetingelser. For at afhjælpe disse mangler i de nuværende modelsystemer blev der præsenteret metoder til etablering af et velkarakteriseret mikrofysiologisk system, der understøtter dannelsen af en levende, perfuseret human mikrotumor (VMT) til fysiologisk onkologisk forskning. Det er vigtigt, at VMT modellerer nøgleegenskaber ved afvigende tumorassocierede kar og tumor-stromale interaktioner, hvilket gør den ideel til modellering af biomimetisk sygdom og terapeutisk effektivitetstest10.

For nemheds skyld kræver platformen ingen eksterne pumper eller ventiler, og på grund af 96-brønds pladeformatet kan den tilpasses standardkulturudstyr og arbejdsgange. Desuden er forskellige udstyrsiterationer til behandling af forskellige biologiske spørgsmål og etablerede vævs- og patientspecifikke rum blevet valideret 8,9,10,11,12,13,14,15,16,17 . Mens platformen kan tilpasses stort set enhver organ- eller vævsspecifik anvendelse ved at integrere forskellige celletyper, skal celler først testes for vækst og vaskulogen kapacitet inden for VMO / VMT ved varierende cellekoncentrationer for at bestemme den optimale såtæthed og co-kulturbetingelser. For at etablere vaskulaturen kan humane endotelkolonidannende celleafledte endotelceller (ECFC-EC) købes kommercielt eller frisk isoleret fra navlestrengsblod ved at vælge CD31 + celler. Humane navlestrengendotelceller (HUVEC) kan også bruges til at etablere vaskulatur i VMO / VMT og kan enten købes kommercielt eller frisk isoleret fra navlestrenge. Derudover er inducerede pluripotente stamcelleafledte endotelceller (iPSC-EC) blevet testet med succes i platformen, hvilket åbner mulighed for et fuldstændigt autologt system18. Kommercielt afledte fibroblaster (standard, normale humane lungefibroblaster for deres vaskulogene potentiale) fungerer godt i VMO / VMT, og nogle primære afledte stromale cellepopulationer kan også inkorporeres eller substitueres. Primærafledte tumorer kan indføres i VMT som enkeltceller, sfæroider, organoider eller tumorstykker. Matrixsammensætning kan modificeres i henhold til eksperimentelle behov, herunder spiking med kollagener, laminin, fibronectin eller endda decellulariserede vævsmatricer19.

Protokollen indeholder flere kritiske trin, hvor særlig omhu er afgørende for at undgå almindelige problemer (figur 5). Under påfyldningen sikres en homogen blanding af celle-/fibrinopslæmningen ved omhyggelig pipettering og jævn indføring i vævskammeret (figur 5A). Tryk på gelen helt ud i kammeret for at forhindre delvis påfyldning (figur 5B). Visualisering af celle / fibrinopslæmningen, der krydser hele vævskammeret, er nødvendig for at sikre fuldstændig kammerfyldning og kan lettes ved at placere en handskefinger bag enhedsenheden. Undgå at trykke for hårdt på mikropipettestemplet for at forhindre, at celle/fibrinblandingen sprænger ind i de mikrofluidiske kanaler (figur 5C). Der skal udvises forsigtighed med ikke at indføre luftbobler under pipettering for at forhindre interferens med vævsudvikling og downstream-applikationer (figur 5D). Korrekt blanding og påfyldningshastighed er afgørende for at undgå områder med inkonsekvent koagulation (figur 5E), mens fjernelse af pipettespidsen for tidligt også kan forstyrre gelen i kammeret (figur 5F). Øvelsesbelastninger anbefales for at gøre brugerne bekendt med det tidsbestemte element i proceduren og indlæsningstrinnet. Desuden er korrekt introduktion af laminin i de mikrofluidiske kanaler afgørende for EF-migration, anastomose med ydre kanaler og dannelsen af et kontinuerligt, perfuserbart netværk til tilførsel af næringsstoffer. Ufuldstændig eller fraværende kanalforing vil føre til dårlige perfusionsresultater og ubrugelig VMO/VMT.

Figure 5
Figur 5. Almindelige fejl ved indlæsning. (A) Mikrofluidisk anordning enhed korrekt indlæst uden defekter. (B) Celle/fibrin-blandingen blev ikke ført helt ind i kammeret, hvilket resulterede i delvis belastning. (C) For meget tryk påført under belastning, hvilket resulterer i, at gel sprænger ind i den mikrofluidiske kanal og blokerer strømmen. D) Luftbobler, der indføres i celle/fibrinblandingen i kammeret under pipettering. (E) Forkert blanding af celle/fibrinblandingen eller langsom påfyldning, der forårsager uoverensstemmelser i koagulationen. (F) Hvis pipettespidsen fjernes fra påfyldningsporten, før gelen er tilstrækkeligt hærdet, vil det medføre forstyrrelse af celle/fibrinblandingen i vævskammeret. Klik her for at se en større version af denne figur.

Robuste og standardiserede arbejdsgange til analyse er afgørende i VMO/VMT-studier, da de genererer betydelige mængder billeddata. Billedbehandlings- og analysemetoder for VMO/VMT er tidligere beskrevet 8,9,10,11,12,13. Til kvantitativ tumoranalyse måles fluorescerende intensitet i farvekanalen, der repræsenterer tumorcellerne, ved hjælp af open source-software som ImageJ/Fiji (National Institute of Health)20 eller CellProfiler (Broad Institute)21. Tærsklen for tumormikrografiske billeder er indstillet til at vælge den fluorescerende tumorregion, og den gennemsnitlige fluorescensintensitet måles inden for denne region. Tumorens samlede fluorescerende intensitet beregnes som produktet af det fluorescerende område og dets gennemsnitlige intensitet, normaliseret til baselineværdier (forbehandling) for at opnå foldændringen i tumorvækst pr. Enhed i forsøgsperioden. Med hensyn til kvantitativ analyse af fartøjer kan AngioTool (National Cancer Institute)22, ImageJ/Fiji-makroscripts eller MATLAB-software, såsom REAVER23, bruges til at kvantificere den samlede fartøjslængde, antal endepunkter, antal kryds, gennemsnitlig fartøjslængde, fartøjsdiameter, gennemsnitlig lakunaritet og fartøjets procentvise areal. Maskinlæringsalgoritmer kan integreres i arbejdsgange til automatisk analyse af vaskulære billeder for at identificere forbindelser, der effektivt forstyrrer vaskulaturen24. Perfusionsbilleder analyseres ved at måle ændringen i fluorescensintensitet inden for områder af det ekstracellulære rum og beregne permeabilitetskoefficienten10. Finite element simuleringer af intraluminal strømning inde i et mikrovaskulært netværk kan udføres ved hjælp af COMSOL Multiphysics25. Implementering af standardiserede analysemetoder er afgørende for at udtrække meningsfuld indsigt fra den enorme mængde data, der genereres i VMT-studier.

Den protokol, der er skitseret her, giver brugeren mulighed for at udnytte VMO / VMT-platformen til at studere mange aspekter af tumorbiologi, herunder tumorvækst / progression, tumormetastase, intratumor T-celledynamik og tumorrespons på kemoterapi og antiangiogen behandling. For at muliggøre fysiologisk relevante immuno-onkologiske undersøgelser blev det demonstreret, hvordan nyligt isolerede T-celler perfuserer gennem mikrovaskulaturen, ekstravaserer over endotelcellebarrieren og migrerer ind i vævskonstruktionen. Time-lapse mikroskopisk konfokal billeddannelse blev præsenteret som et værktøj til at se rumligt tilfældige, tidsmæssigt hurtige begivenheder, herunder T-celleekstravasation, der ikke let visualiseres med andre modelsystemer. Derudover har vi tidligere testet flere typer antineoplastiske lægemidler i VMT, herunder kemoterapeutika, små molekyler / tyrosinkinasehæmmere, monoklonale antistoffer (såsom anti-PD1 og bevacizumab), antiangiogene forbindelser og vaskulære stabiliseringsmidler, hvilket understreger, hvordan platformen kan bruges til at teste forskellige klasser af lægemidler rettet mod både tumoren og den tilhørende stroma8, 9,10,11,12,13. Spildevand kan indsamles fra platformen og analyseres for forskellige cytokiner såvel som exosomer. I fremtidige studier kan VMT-platformen bruges til at vurdere tumorcellers følsomhed over for T-cellemedierede angreb på det enkelte patientniveau. Afslutningsvis er VMT en fleksibel og kraftfuld platform og en, der er ideel til at studere tumorbiologi, hvor ombygning af de vaskulære og stromale komponenter er nøglen til tumorprogression.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

CCWH har en aktieandel i Aracari Biosciences, Inc., som kommercialiserer en version af den teknologi, der er beskrevet i denne artikel. Vilkårene for denne aftale er blevet gennemgået og godkendt af University of California, Irvine, i overensstemmelse med dets interessekonfliktpolitikker. Der er ingen andre interessekonflikter.

Acknowledgments

Vi takker medlemmer af Dr. Christopher Hughes 'laboratorium for deres værdsatte input til de beskrevne procedurer samt vores samarbejdspartnere i Dr. Abraham Lees laboratorium for deres hjælp med platformdesign og fabrikation. Dette arbejde blev støttet af følgende tilskud: UG3/UH3 TR002137, R61/R33 HL154307, 1R01CA244571, 1R01 HL149748, U54 CA217378 (CCWH) og TL1 TR001415 and W81XWH2110393 (SJH).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Fabrication
(3-Mercaptopropyl)trimethoxysilane, 95%  Sigma-Aldrich 175617-100G
Greiner Bio-One μClear Bottom 96-well Polystyrene Microplates Greiner Bio-One 655096
Methanol ≥99.8% ACS VWR Chemicals BDH BDH1135-1LP
MILTEX Sterile Disposable Biopsy Punch with Plunger, 1mm diameter, Integra Miltex 33-31AA-P/25
PDMS membrane PAX Industries HT-6240
Plasma Cleaner PDC-001 Harrick Plasma N/A
Smooth-Cast 385 Smooth-On N/A
SP Bel-Art Lab Companion Clear Polycarbonate Cabinet Style Vacuum Desiccator Bel-Art F42400-4031
Standard Lids with Condensation Rings, 96-well plate VWR 82050-827
SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit (PDMS) Dow 4019862
Cell culture/Loading
BioTek Lionheart FX Automated Microscope Agilent  CYT5MFAW
CELLvo Human Endothelial Progenitor Cells StemBioSys N/A
Collagen I, rat tail Enzo Life Sciences
Collagenase from Clostridium histolyticum (type 4) Sigma-Aldrich C5138
Corning Hank’s Balanced Salt Solution, 1X without calcium and magnesium Corning 21-021-CV
Corning DMEM with L-Glutamine, 4.5g/L Glucose and Sodium Pyruvate Corning 10013CV
DAPI Sigma-Aldrich D9542
DPBS, no calcium, no magnesium Gibco 14190144
EGM-2 Endothelial Cell Growth Medium-2 BulletKit Lonza CC-3162
Fibrinogen from bovine plasma Neta Scientific SIAL-341573
Fibronectin human plasma Sigma-Aldrich F0895
Fluorescein isothiocyanate–dextran (70kDa) Sigma-Aldrich FD70S-1G
Gelatin from porcine skin Sigma-Aldrich G1890
Hyaluronidase from sheep testes (type 4) Sigma-Aldrich H6254
Laminin Mouse Protein Gibco 23017015
Leica TCS SP8 Leica N/A
MDA-MB-231 ATCC HTB-26
NHLF – Normal Human Lung Fibroblasts Lonza CC-2512
Nikon Eclipse Ti Nikon N/A
Paraformaldehyde 4% in 0.1M Phosphate BufferSaline, pH 7.4 Electron Microscopy Sciences  15735-90-1L
PBMCs - Peripheral blood mononuclear cells Lonza CC-2702
PBS, pH 7.4 Gibco 10010049
Premium Grade Fetal Bovine Serum (FBS), Heat Inactivated Avantor Seradigm 97068-091
ProLong Gold Antifade Mountant Invitrogen P10144
Quick-RNA Microprep Kit Zymo Research R1051
Thrombin from bovine plasma Sigma-Aldrich T4648
Triton X-100 (Electrophoresis), Fisher BioReagents BP151-100
TrypLE Express Enzyme (1X), phenol red Gibco 12605028
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red Gibco 25300062
Vasculife Lifeline Cell Technology LL-0003

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Siegel, R. L., Miller, K. D., Wagle, N. S., Jemal, A. Cancer statistics, 2023. CA Cancer J Clin. 73 (1), 17-48 (2023).
  2. Hachey, S. J., Hughes, C. C. W. Applications of tumor chip technology. Lab Chip. 18 (19), 2893-2912 (2018).
  3. Ewald, M. L., Chen, Y. H., Lee, A. P., Hughes, C. C. W. The vascular niche in next generation microphysiological systems. Lab Chip. 21 (17), 3615-3616 (2021).
  4. Osaki, T., Sivathanu, V., Kamm, R. D. Vascularized microfluidic organ-chips for drug screening, disease models and tissue engineering. Curr Opin Biotechnol. 52, 116-123 (2018).
  5. Shirure, V. S., Hughes, C. C. W., George, S. C. Engineering vascularized organoid-on-a-chip models. Annu Rev Biomed Eng. 23, 141-167 (2021).
  6. Del Piccolo, N., et al. Tumor-on-chip modeling of organ-specific cancer and metastasis. Adv Drug Deliv Rev. 175, 113798 (2021).
  7. Sontheimer-Phelps, A., Hassell, B. A., Ingber, D. E. Modelling cancer in microfluidic human organs-on-chips. Nat Rev Cancer. 19 (2), 65-81 (2019).
  8. Sobrino, A., et al. 3D microtumors in vitro supported by perfused vascular networks. Sci Rep. 6, 31589 (2016).
  9. Phan, D. T. T., et al. A vascularized and perfused organ-on-a-chip platform for large-scale drug screening applications. Lab Chip. 17 (3), 511-520 (2017).
  10. Hachey, S. J., et al. An in vitro vascularized micro-tumor model of human colorectal cancer recapitulates in vivo responses to standard-of-care therapy. Lab Chip. 21 (7), 1333-1351 (2021).
  11. Hachey, S. J., et al. A Human Vascularized Micro-Tumor Model of Patient-Derived Colorectal Cancer Recapitulates Clinical Disease. Transl Res. 255, 97-108 (2023).
  12. Liu, Y., et al. Human in vitro vascularized micro-organ and micro-tumor models are reproducible organ-on-a-chip platforms for studies of anticancer drugs. Toxicology. 445, 152601 (2020).
  13. Jahid, S., et al. Structure-based Design of CDC42 Effector Interaction Inhibitors for the Treatment of Cancer. Cell Rep. 39 (4), 110760 (2022).
  14. Hsu, Y. H., Moya, M. L., Hughes, C. C. W., George, S. C., Lee, A. P. A microfluidic platform for generating large-scale nearly identical human microphysiological vascularized tissue arrays. Lab Chip. 13 (15), 2990-2998 (2013).
  15. Moya, M. L., Hsu, Y. H., Lee, A. P., Christopher, C. W. H., George, S. C. In vitro perfused human capillary networks. Tissue Eng - Part C: Methods. 19 (9), 730-737 (2013).
  16. Wang, X., et al. An on-chip microfluidic pressure regulator that facilitates reproducible loading of cells and hydrogels into microphysiological system platforms. Lab Chip. 16 (5), 868-876 (2016).
  17. Phan, D. T., et al. Blood-brain barrier-on-a-chip: Microphysiological systems that capture the complexity of the blood-central nervous system interface. Exp Biol Med. 242 (17), 1669-1678 (2017).
  18. Kurokawa, Y. K., et al. Human induced pluripotent stem cell-derived endothelial cells for three-dimensional microphysiological systems. Tissue Eng Part C: Methods. 23 (8), 474-484 (2017).
  19. Romero-López, M., et al. Recapitulating the human tumor microenvironment: Colon tumor-derived extracellular matrix promotes angiogenesis and tumor cell growth. Biomaterials. 116, 118-129 (2017).
  20. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  21. Carpenter, A. E., et al. CellProfiler: Image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes. Genome Biol. 7 (10), R100 (2006).
  22. Zudaire, E., Gambardella, L., Kurcz, C., Vermeren, S. A computational tool for quantitative analysis of vascular networks. PLoS one. 6 (11), e27385 (2011).
  23. Corliss, B. A., et al. REAVER: A program for improved analysis of high-resolution vascular network images. Microcirculation. 27 (5), e12618 (2020).
  24. Urban, G., et al. Deep learning for drug discovery and cancer research: Automated analysis of vascularization images. IEEE/ACM Trans Comput Biol Bioinform. 16 (3), 1029-1035 (2019).
  25. COMSOL Multiphysics. , Stockholm, Sweden. www.comsol.com (2023).

Tags

Vaskulariseret mikrotumormodel Kræftforskning Tumormikromiljø Solide kræftformer Præklinisk kræftforskning Terapeutisk udvikling Tumorchip Mikrofysiologisk system Humane celletyper Mikrofluidisk platform Perfuseret vaskulært netværk Endotellag Terapeutisk levering Ekstravasation af immunceller Metastase Fluorescerende mærkede celler Tumorheterogenitet Genekspressionssignaturer Lægemiddelresponser Personlig medicin
Etablering af en fysiologisk human vaskulariseret mikrotumormodel til kræftforskning
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Hachey, S. J., Gaebler, D., Hughes,… More

Hachey, S. J., Gaebler, D., Hughes, C. C. W. Establishing a Physiologic Human Vascularized Micro-Tumor Model for Cancer Research. J. Vis. Exp. (199), e65865, doi:10.3791/65865 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter