Overview
يصف هذا الفيديو FEeder CApillary ، أو CAFE ، المقايسة ، وهي طريقة سلوكية تقيس تناول الطعام وتفضيل ذباب الفاكهة غير المقيد. يوضح البروتوكول المميز كيفية إجراء المقايسة بأقل قدر من التبخر من الشعيرات الدموية المملوءة بالسائل المستخدمة لتوصيل الطعام وتتبع مداها.
Protocol
هذا البروتوكول هو مقتطف من Diegelmann وآخرون ، يقيس اختبار CApillary FEeder تناول الطعام في Drosophila melanogaster ، J. Vis. Exp. (2017).
1. الجمعية وأداء اختبار FEeder CApillary
- إذا لم تكن هناك حاجة إلى الصيام، نقل الذباب التجريبية إلى المقايسة عن طريق التنصت أو عن طريق ضربة الأنابيب. تأكد من تضمين ثلاث قوارير تحكم بدون ذباب لقياس التبخر.
- إزالة بعناية تلميح ماصة (2 - 20 ميكرولتر حجم) التي يتم إغلاق واحدة من الفتحات الخارجية، وإدراج الشعرية الزجاج مملوءة، أسفل نهاية الأولى. تأمين الشعيرات الدموية عن طريق وضع طرف ماصة مرة أخرى بجانب الشعيرات الدموية. إذا تم اختبار العديد من الحلول الغذائية، كرر هذا الإجراء وفقا لذلك.
- ضع النهايات الشعرية داخل جميع القنينات في نفس المستوى لتجنب التحيز الذي يمكن أن يحدث إذا كانت مصادر الغذاء موجودة على ارتفاعات مختلفة (3 -4 سم من الغطاء)؛ الحفاظ على مسافة إلى ورقة التصفية لمنع الشعيرات الدموية من التسرب عن طريق لمس ورقة التصفية عن طريق الخطأ أو اللزوجات المختلفة لمصادر الغذاء.
- تسمية الطرف العلوي من السائل الملون باستخدام قلم علامة (علامةبداية). لضمان التعرف على الشعيرات الدموية المختلفة، قم بتسميتها بشكل فردي باستخدام رمز ملون أو شريطي.
- ضع العديد من المقايسات المعدة من CAFE داخل صندوق بلاستيكي مع تطعيم شبكي ونقل المربع(الشكل 2A)إلى وضع آمن في ظل ظروف المختبر أو في غرفة المناخ التي تسيطر عليها درجة الحرارة والضوء والرطوبة (المعلمات: 25 درجة مئوية ، 60٪ رطوبة نسبية ، 12 ساعة / 12 ساعة دورة ضوء داكنة) للفترة التجريبية(على سبيل المثال 3 ساعة أو أيام).
- كما يجف ورقة تصفية أسفل إذا تم إجراء الفحص على مدى عدة أيام، وتطبيق المياه العذبة كل 24 ساعة عن طريق بونغ الإسفنج (100 ميكرولتر) للحفاظ على رطوبة ثابتة داخل المقايسة. استخدم أربع قوارير منفصلة (ارتفاع 8 سم وقطرها 3.3 سم) مليئة ب 30 مل ddH2O كأجهزة رطوبة ووضعها بجوار مقايسات CAFE في الصندوق البلاستيكي. استخدام غطاء لصندوق البلاستيك لخلق الرطوبة التي تسيطر عليها البيئة خلال التجربة (الشكل 2A).
ملاحظة: يحدث تباين أوسع في ظل ظروف مختبرية؛ ومع ذلك ، فمن الممكن لأداء المقايسة CAF في درجة حرارة الغرفة(على سبيل المثال، في الفصول الدراسية). يتم تشجيع استخدام جهاز الترطيب (ورقة التصفية ، مع أو بدون بونغ اسفنجة مبللة ، قارورات المياه المملوءة وغطاء الصندوق البلاستيكي) على تقليل التبخر(الشكل 2B). - استبدال الشعيرات الدموية مع تلك المملوءة حديثا للتجارب على المدى الطويل كل 24 ساعة. دون الذباب الميت قبل كل فاصل زمني قدره 24 ساعة واستخدم عدد الذباب الحي لحساب الاستهلاك لكل ذبابة للفترة التالية. تجاهل الشعيرات الدموية القديمة بعد قياس انخفاض الغضروف المفصلي (انظر 2.1).
ملاحظة: خلال تجربة 3 ساعة بالكاد نرى أي ذباب ميت. خلال دراسة 4 أيام نجد عادة 1-3 الذباب الميت. - في نهاية المقايسة أو قبل استبدال الشعرية ، ضع علامة على الغضروف المفصلي السفلي للشعيرات الدموية (علامةالنهاية)بقلم علامة بينما لا يزال المقايسة CAFE في وضع مستقيم. تجاهل البيانات إذا كانتنهاية العلامة غير أقل من العلامة الأولية (علامةبداية). لا تقم بإزالة الغطاء، لأن هذا قد يغير الغضروف المفصلي.
- إزالة الشعيرات الدموية بعناية من المقايسة وتخزينها لجمع البيانات. تحقق مما إذا كان السائل داخل الشعيرات الدموية قد وصل إلى الطرف السفلي إن لم يكن تجاهل البيانات ، حيث لم يكن الطعام متاحا للذباب. جمع جميع الشعيرات الدموية في قارورة كمجموعة. إدراج نصائح ماصة غير المصقول في جميع الفتحات لمنع الذباب من الهرب. تفكيك الإعداد وغسل القنينات والأغطية والإسفنج bungs في حمام الصابون والجافة بين عشية وضحاها في درجة حرارة الغرفة لمزيد من الاستخدام.
ملاحظة: يمكن تحليل الذباب بعد الفحص. تأكيد امتصاص الطعام عن طريق العين أو تحت مجهر تشريح. - كرر التجارب مع نفس الأنماط الجينية في ثلاثة أيام مختلفة على الأقل.
2. جمع البيانات وتحليلها
- قياس المسافة بينبداية علامةونهاية علامة على الشعيرات الدموية باستخدام الفرجار أو المسطرة. لنقل البيانات مباشرة إلى جدول بيانات، استخدم الفرجار الرقمي المتصل(الشكل 1E)USB (الناقل التسلسلي العالمي). تجاهل الشعيرات الدموية بعد القياس.
- حساب لحجم الشعرية لحساب امتصاص الطعام أو التبخر. على سبيل المثال، النظر في الشعرية التي هي 73 ملم طويلة ويحتوي على 5 ميكرولتر من محلول الغذاء. انخفاض 14.6 ملم في الغضروف المفصلي يعكس امتصاص محلول 1 ميكرولتر. حساب امتصاص الطعام باستخدام الصيغة التالية:
امتصاص الطعام (μL) = المسافة المقاسة (مم)/ 14.6 مم - لاستبعاد تأثير التبخر على تناول الطعام، احسب متوسط التبخر في قوارير التحكم الثلاثة (على الأقل) بدون ذباب. طرح هذه القيمة المتوسطة من القيمة التي تم الحصول عليها لاستهلاك الطعام من قبل الذباب.
- استخدم الصيغة التالية لتحديد إجمالي الاستهلاك لكل ذبابة:
استهلاك الغذاء (μL) = (امتصاص الطعام [μL] - فقدان التبخر [μL]) / العدد الإجمالي للذباب في القارورة. بالنسبة للتجارب طويلة الأجل استخدم عدد الذباب على قيد الحياة قبل بدء الفاصل الزمني 24 ساعة. - لحساب الاختلافات في حجم الجسم، مثل بين الذباب الذكور والإناث، تطبيع استهلاك الغذاء لوزن الجسم (μL الغذاء / ملغ يطير).
- استخدام البرامج الإحصائية لتحليل البيانات. بالنسبة للبيانات الموزعة عادة، استخدم اختبارات Tللطالب لتحديد الاختلافات بين مجموعتي طيران، واستخدم ANOVA (تحليل التباين) مع اختبارات توكي كريمر اللاحقة لأكثر من مجموعتين. في حالة اختيار تحليل الاختلافات من اختيار عشوائي باستخدام اختبار علامة عينة واحدة غيربارامترية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
الشكل 1: دراوسوفيلا ميلانوغاستر CApillary FEeder المقايسة. أ) المقايسة التغذية مع الذباب. ورقة فلتر رطبة توفر المياه في الجزء السفلي من القارورة. يتم توفير أربعة الشعيرات الدموية خلال التجربة (الطعام الأحمر والأزرق اللون في الشعيرات الدموية المعاكس). لاحظ أن الشعيرات الدموية مؤمنة في موضعها بواسطة طرف ماصة ثاني، ويتم إغلاق المواقف غير المستخدمة باستخدام نصائح ماصة. قابس رغوة في وسط الغطاء يسمح تبادل الهواء. ب) عرض مفصل للغطاء. يتم إدخال نصائح قطع ماصة (2 - 20 ميكرولتر، الحدود الحمراء) في فتحات مخروطية من المواقف غير المستخدمة، ويتم إدراج طرف ماصة الثانية في طرف قطع لإغلاق الحفرة. وتستخدم نصائح ماصة قطع للسيطرة على وضع microcapillaries، وتستخدم نصائح غير المصقول لعقد الشعيرات الدموية ضيق. ج) ذبابة D. melanogaster يتغذى على الشعيرات الدموية. د) بعد التغذية ، يكون لون الطعام مرئيا بوضوح في بطن الذبابة. ه) يستخدم الفرجار الرقمي لقياس المسافة بينبداية العلامةونهاية علامة الغضروف المفصلي. يتم نقل البيانات مباشرة إلى جدول بيانات Excel عبر USB. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: تأثير التبخر في المقايسة المغذية الشعرية. أ) المقايسة CAFE متعددة وضعت داخل مربع من البلاستيك مع تطعيم شبكية. للسيطرة على الرطوبة خلال التجربة يتم وضع أربع قوارير مملوءة بالماء (الحافات الحمراء) داخل الشبكة. يتم وضع عناصر التحكم في التبخر على مقربة مباشرة من هذه القنينات. يظهر غطاء الإعداد بالكامل في الخلفية. ب) مقارنة فقدان الحجم من خلال التبخر. يظهر متوسط قيمة التبخر على مدى 4 أيام. يتم التحكم في الرطوبة عن طريق (1) تطبيق الماء على بونغ الإسفنج المركزي (الفاصل الزمني 24 ساعة)؛ '2' إضافة أربع قوارير مملوءة بالمياه إلى الشبكة؛ و (3) باستخدام غطاء من البلاستيك لإعداد كامل. التبخر أقل بكثير إذا تم التحكم في الرطوبة لكلا الحلين اختبار (***P ≤ 0.001; N = 48). لا توجد اختلافات في التقلبات بين EtOH التي تحتوي على محلول السكروز وغير المحتوي عليه يمكن اكتشافه باستخدام أجهزة الرطوبة المستخدمة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Vials (breeding) | Greiner Bio-One | 960177 | www.greinerbioone.com |
| Vials (CAFE assay) | Greiner Bio-One | 217101 | www.greinerbioone.com |
| Lid-CAFE assay | Workshop | – | – |
| Plastic box, low wall | Plastime | 353 | www.plastime.it |
| Cover for the plastic box | Workshop | – | – |
| Capillaries | BLAUBRAND | REF 7087 07 | www.brand.de |
| Pipette tips | Greiner Bio-One | 771290 | www.greinerbioone.com |
| Filter paper circles | Whatman | 10 311 804 | www.sigmaaldrich.com |
| D(+)-Sucrose | AppliChem | 57-50-1 | www.applichem.com |
| Ethanol absolute | VWR Chemicals | 20,821,330 | www.vwr.com |
| Food color (red, E124) | Backfun | 10027 | www.backfun.de |
| Food color (blue, E133) | Backfun | 10030 | www.backfun.de |
| Soap solution (CVK 8) | CVH | 103220 | www.cvh.de |
| Digital caliper | GARANT | 412,616 | www.hoffmann-group.com |
| Vials (breeding) | Height 9.8 cm, diameter 4.8 cm | ||
| Vials (CAFE assay) | Height 8 cm, diameter 3.3 cm | ||
| Lid-CAFE assay | Produced in university workshop, technical drawing supplied Please click here to download this file. |
||
| Plastic box, low wall | A plastic grid inlay was custom-made for 8 x 10 vial positions | ||
| Cover for the plastic box | Dimensions (37 x 29 x 18 cm) | ||
| Capillaries | DIN ISO 7550 norm, IVD-guideline 98/79 EG, ends polished | ||
| Pipette tips | Pipettes for the outer circle are cut according to the lid | ||
| Filter paper circles | 45 mm diameter works nicely if folded for the vials used | ||
| D(+)-Sucrose | Not harmful | ||
| Ethanol absolute | Highly flammable liquid and vapor | ||
| Food color (red, E124) | Not stated | ||
| Food color (blue, E133) | Not stated | ||
| Soap solution (CVK 8) | Odor neutral soap | ||
| Digital caliper | |||
| Standard fly food | (for 20 L) | ||
| Agar | 160 g | ||
| Brewer's Yeast | 299.33 g | ||
| Cornmeal | 1,200 g | ||
| Molasses | 1.6 L | ||
| Propionic acid | 57.3 mL | ||
| Nipagin 30% | 160 mL |
