El ensayo CApillary FEeder (CAFE): Un método para rastrear el consumo y la preferencia de los alimentos en Drosophila

Overview

Este video describe el CApillary FEeder, o CAFE, ensayo, un método de comportamiento que mide la ingesta de alimentos y la preferencia de las moscas de la fruta sin restricciones. El protocolo destacado muestra cómo realizar el ensayo con una evaporación mínima de los capilares llenos de líquido utilizados para entregar los alimentos y realizar un seguimiento de su ingesta.

Protocol

Este protocolo es un extracto de Diegelmann et al., The CApillary FEeder Assay Measures Food Intake in Drosophila melanogaster, J. Vis. Exp. (2017).

1. Montaje y realización del ensayo CApillary FEeder

1. Si no es necesario ayunar, transfiera las moscas experimentales al ensayo tocando o soplando. Asegúrese de incluir tres viales de control sin moscas para cuantificar la evaporación.
2. Retire cuidadosamente una punta de pipeta (2 - 20 μL de volumen) que está cerrando una de las aberturas externas, e inserte primero un capilar de vidrio relleno. Asegure el capilar colocando la punta de la pipeta de nuevo junto al capilar. Si se están probando varias soluciones alimentarias, repita este procedimiento en consecuencia.
3. Coloque los extremos capilares dentro de todos los viales al mismo nivel para evitar sesgos que pudieran ocurrir si las fuentes de alimentos se localizaran a diferentes alturas (3 - 4 cm de la tapa); mantener una distancia al papel filtrante para evitar que el capilar se filtre tocando accidentalmente el papel filtrante o diferentes viscosidades de las fuentes de alimentos.
4. Etiquete el extremo superior del líquido de color utilizando un rotulador_(iniciode la marca). Para asegurarse de que se pueden identificar los diferentes capilares, etiquete individualmente utilizando un código de color o rayas.
5. Coloque múltiples ensayos CAFE preparados dentro de una caja de plástico con incrustación cuadriculada y transfiera la caja(Figura 2A)a una posición segura en condiciones de laboratorio o en una cámara de clima controlada por temperatura, luz y humedad (parámetros: 25 °C, 60% humedad relativa, 12 h/12 h ciclo claro-oscuro) para el período experimental(por ejemplo, 3 h o días).
6. A medida que el papel de filtro inferior se seca si el ensayo se realiza durante varios días, aplique agua dulce cada 24 h a través de la esponja bung (100 μL) para mantener la humedad constante dentro del ensayo. Utilice cuatro viales separados (8 cm de altura, 3,3 cm de diámetro) llenos de 30 ml ddH₂O como dispositivos de humedad y colóquelos junto a los ensayos CAFE en la caja de plástico. Utilice una cubierta para la caja de plástico para crear un ambiente controlado por humedad durante el experimento (Figura 2A).
   NOTA: La variabilidad más amplia se produce en condiciones de laboratorio; sin embargo, es factible realizar el ensayo CAFE a temperatura ambiente(por ejemplo,en un aula). Se recomienda encarecidamente el uso de un dispositivo de humidificación (papel filtrante, con o sin esponja húmeda, viales de agua rellena y cubierta para la caja de plástico) para disminuir la evaporación(Figura 2B).
7. Reemplace los capilares por otros recién llenados para experimentos a largo plazo cada 24 h. Tome nota de las moscas muertas antes de cada intervalo de 24 h y utilice el número de moscas vivas para calcular el consumo por mosca para el período siguiente. Deseche los viejos capilares después de medir el declive del menisco (véase 2.1).
   NOTA: Durante un experimento de 3 h apenas vemos moscas muertas. Durante un estudio de 4 días generalmente encontramos de 1 a 3 moscas muertas.
8. Al final del ensayo o antes de reemplazar el capilar, marque el menisco inferior del capilar_(extremode la marca) con un rotulador mientras el ensayo CAFE todavía está en posición vertical. Deseche los datos si_{el final} de la marca no está por debajo de la marca inicial_{(inicio de}la marca). No retire la tapa, ya que esto podría cambiar el menisco.
9. Retire cuidadosamente los capilares del ensayo y guárdelos para la recopilación de datos. Compruebe si el líquido dentro del capilar llegó al extremo inferior si no se descartan los datos, ya que los alimentos no eran accesibles para las moscas. Recoger todos los capilares por vial como grupo. Inserte puntas de pipeta sin cortar en todas las aberturas para evitar que las moscas escapen. Desmantele la configuración y lave los viales, tapas y búcolos de esponja en un baño de jabón y séquelo durante la noche a temperatura ambiente para su uso posterior.
   NOTA: Las moscas se pueden analizar más a fondo después del ensayo. Confirme la absorción de alimentos por ojo o bajo un microscopio de disección.
10. Repita los experimentos con los mismos genotipos en al menos tres días diferentes.

2. Recopilación y análisis de datos

1. Mida la distancia entre el_principio de la marca y el_extremo de la marca en el capilar usando una pinza o una regla. Para transferir datos directamente a una hoja de cálculo, utilice una pinza digital conectada USB (Bus serie universal) (Figura 1E). Deseche los capilares después de la medición.
2. Tener en cuenta el tamaño capilar para calcular la absorción o evaporación de alimentos. Por ejemplo, considere un capilar de 73 mm de largo y contiene 5 μL de solución alimentaria. Una disminución de 14,6 mm en el menisco refleja la absorción de 1 solución de μL. Calcule la absorción de alimentos utilizando la siguiente fórmula:
   Absorción de alimentos (μL) = distancia medida (mm)/ 14,6 mm
3. Para excluir el efecto de la evaporación en la ingesta de alimentos, calcule la evaporación media en los tres viales de control (como mínimo) sin moscas. Resta este valor medio del valor obtenido para el consumo de alimentos por las moscas.
4. Utilice la siguiente fórmula para determinar el consumo total por mosca:
   Consumo de alimentos (μL) = (Absorción de alimentos [μL] - Pérdida evaporativa [μL])/número total de moscas en el vial. Para experimentos a largo plazo, utilice el número de moscas vivas antes del inicio del intervalo de 24 h.
5. Para tener en cuenta las diferencias en el tamaño del cuerpo, como entre las moscas macho y hembra, normalice el consumo de alimentos al peso corporal (μL food/mg fly).
6. Utilice software estadístico para el análisis de datos. Para los datos distribuidos normalmente, utilice las pruebas Tdel alumno para determinar las diferencias entre dos grupos de moscas y utilice ANOVA (análisis de varianza) con pruebas de Tukey Cramer post hoc para más de dos grupos. En una situación de elección, analice las diferencias con la elección aleatoria mediante una prueba de signo de una muestra no paramétrica.

Representative Results

Figura 1: El ensayo Drosophila melanogaster CApillary FEeder. A) El ensayo de alimentación con moscas. El papel filtrante humedecido proporciona agua en la parte inferior del vial. Durante el experimento se proporcionan cuatro capilares (alimentos de color rojo y azul en capilares opuestos). Tenga en cuenta que los capilares están asegurados en su posición por una segunda punta de pipeta, y las posiciones no utilizadas se cierran con puntas de pipeta. Un tapón de espuma en el centro de la tapa permite el intercambio de aire. B) Vista detallada de la tapa. Las puntas de pipeta cortadas (2 - 20 μL, bordes rojos) se insertan en las aberturas cónicas de las posiciones no utilizadas, y se inserta una segunda punta de pipeta en la punta de corte para cerrar el agujero. Las puntas de pipeta cortadas se utilizan para controlar la colocación de las microcapilares, y las puntas sin cortar se utilizan para mantener los capilares apretados. C) Una mosca D. melanogaster se alimenta de un capilar. D) Después de la alimentación, el color de los alimentos es claramente visible en el abdomen de la mosca. E) Una pinza digital se utiliza para medir la distancia entre el_principio de la marca y el_final de la marca del menisco. Los datos se transfieren directamente a una hoja de cálculo de Excel a través de USB. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Influencia de la evaporación en el ensayo del alimentador capilar. A) Múltiples ensayos cafe colocados dentro de una caja de plástico con una incrustación en cuadrícula. Para controlar la humedad durante el experimento se colocan cuatro viales llenos de agua (llantas rojas) dentro de la red. Los controles de evaporación se colocan en proximidad directa a estos viales. Se muestra una cubierta para toda la configuración en segundo plano. B) Comparación de la pérdida de volumen a través de la evaporación. Se muestra el valor medio de la evaporación durante 4 días. La humedad se controla mediante (i) la aplicación de agua a la esponja central bung (intervalo de 24 h); (ii) añadir cuatro viales llenos de agua a la red; y (iii) utilizando una cubierta de plástico para toda la configuración. La evaporación es significativamente menor si se controla la humedad para ambas soluciones probadas (***P ≤ 0,001; N = 48). No se detectan diferencias en la volatilidad entre la solución de sacarosa que contiene EtOH y no contiene es detectable con los dispositivos de humedad utilizados. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Vials (breeding)	Greiner Bio-One	960177	www.greinerbioone.com
Vials (CAFE assay)	Greiner Bio-One	217101	www.greinerbioone.com
Lid-CAFE assay	Workshop	–	–
Plastic box, low wall	Plastime	353	www.plastime.it
Cover for the plastic box	Workshop	–	–
Capillaries	BLAUBRAND	REF 7087 07	www.brand.de
Pipette tips	Greiner Bio-One	771290	www.greinerbioone.com
Filter paper circles	Whatman	10 311 804	www.sigmaaldrich.com
D(+)-Sucrose	AppliChem	57-50-1	www.applichem.com
Ethanol absolute	VWR Chemicals	20,821,330	www.vwr.com
Food color (red, E124)	Backfun	10027	www.backfun.de
Food color (blue, E133)	Backfun	10030	www.backfun.de
Soap solution (CVK 8)	CVH	103220	www.cvh.de
Digital caliper	GARANT	412,616	www.hoffmann-group.com
Vials (breeding)			Height 9.8 cm, diameter 4.8 cm
Vials (CAFE assay)			Height 8 cm, diameter 3.3 cm
Lid-CAFE assay			Produced in university workshop, technical drawing supplied Please click here to download this file.
Plastic box, low wall			A plastic grid inlay was custom-made for 8 x 10 vial positions
Cover for the plastic box			Dimensions (37 x 29 x 18 cm)
Capillaries			DIN ISO 7550 norm, IVD-guideline 98/79 EG, ends polished
Pipette tips			Pipettes for the outer circle are cut according to the lid
Filter paper circles			45 mm diameter works nicely if folded for the vials used
D(+)-Sucrose			Not harmful
Ethanol absolute			Highly flammable liquid and vapor
Food color (red, E124)			Not stated
Food color (blue, E133)			Not stated
Soap solution (CVK 8)			Odor neutral soap
Digital caliper
Standard fly food			(for 20 L)
Agar			160 g
Brewer's Yeast			299.33 g
Cornmeal			1,200 g
Molasses			1.6 L
Propionic acid			57.3 mL
Nipagin 30%			160 mL