CApillary FEeder (CAFE) Анализ: Метод отслеживания потребления продуктов питания и предпочтений в Дрозофиле

Overview

Это видео описывает CApillary FEeder, или CAFE, анализ, поведенческий метод, который измеряет потребление пищи и предпочтение безудержных плодовых мушек. Протокол показывает, как выполнить анализ с минимальным испарением из заполненных жидкостью капилляров, используемых для доставки пищи и отслеживания ее потребления.

Protocol

Этот протокол является выдержкой из Diegelmann и др., CApillary FEeder Assay Измеряет потребление пищи в Drosophila melanogaster, J. Vis. Exp. (2017).

1. Сборка и выполнение CApillary FEeder Assay

1. Если пост не нужен, перенесите экспериментальные мухи на анализ, постукивая или ударом трубы. Убедитесь в том, чтобы включить три контрольных флакона без мух для количественной оценки испарения.
2. Аккуратно удалите наконечник пипетки (объем 2 - 20 мкл), который закрывает одно из внешних отверстий, и вставьте заполненный стеклянный капилляр, нижний конец в первую очередь. Закрепив капилляр, поместив наконечник пипетки обратно рядом с капилляром. Если тестируется несколько пищевых растворов, повторите эту процедуру соответствующим образом.
3. Поместите капиллярные концы внутри всех флаконов на одном уровне, чтобы избежать смещения, которое может произойти, если источники пищи расположены на разных высотах (3 - 4 см от крышки); держать расстояние до фильтровальной бумаги, чтобы предотвратить капилляр от утечки случайно касаясь фильтровальной бумаги или различных вязкостей источников питания.
4. Наклейте этикетку на верхний конец цветной жидкости с помощью маркерной ручки (начало_знака). Чтобы обеспечить возможность идентифицирования различных капилляров, отмейте их по отдельности с помощью цветового или полосатого кода.
5. Поместите несколько подготовленных анализов CAFE внутри пластиковой коробки с сетчатой вставной вставки и перенеситекоробку (рисунок 2A) в безопасное положение в лабораторных условиях или в климат-камеру, контролируемую температурой, светом и влажностью (параметры: 25 градусов по Цельсию, 60% относительная влажность, 12 ч/12 ч светло-темного цикла)в течение экспериментального периода (например, 3 ч или дней).
6. По мере того как нижняя бумага фильтра высыхает вне если анализ выполнен над несколькими днями, то принесите свежую воду каждые 24 h через губку bung (100 L) для того чтобы держать влажность постоянн внутри анализа. Используйте четыре отдельных флакона (высота 8 см, диаметр 3,3 см), наполненных 30 мл ddH₂O в качестве устройств влажности и поместите их рядом с анализами CAFE в пластиковой коробке. Используйте крышку для пластиковой коробки для создания среды, контролируемой влажностью во время эксперимента(рисунок 2A).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Более широкая изменчивость происходит в лабораторных условиях; однако, возможно выполнить анализ CAFE при комнатной температуре(например,в классе). Использование увлажняющее устройство (фильтровающая бумага, с или без мокрой губки bung, заполненные флаконы воды и крышка для пластиковой коробки) настоятельно рекомендуется уменьшить испарение (Рисунок 2B).
7. Замените капилляры на свежезаполнутые для длительных экспериментов каждые 24 ч. Обратите внимание на мертвых мух перед каждым интервалом 24 ч и используйте количество живых мух для расчета потребления на муху в течение следующего периода. Откажитесь от старых капилляров после измерения упадка мениска (см. 2.1).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Во время эксперимента 3 ч мы почти не видим мертвых мух. В течение 4 дней исследования мы обычно находим 1 - 3 мертвых мух.
8. В конце анализа или перед заменой капилляра, отметь нижний мениска капилляра (конец_знака)маркерной ручкой, в то время как анализ CAFE все еще находится в вертикальном положении. Отбросьте данные,_если конец знака не ниже начальной отметки (начало_{отметки).} Не снимите крышку, так как это может изменить мениска.
9. Тщательно удалите капилляры из анализа и храните их для сбора данных. Проверьте, достигла ли жидкость внутри капилляра нижнего конца, если не отбросьте данные, так как пища была недоступна мухам. Соберите все капилляры на флакон в группе. Вставьте необрезанные советы пипетки во все отверстия, чтобы предотвратить мух от побега. Разобрать установку и мыть флаконы, крышки и губки койки в мыльной ванне и сухой на ночь при комнатной температуре для дальнейшего использования.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Мухи могут быть дополнительно проанализированы после анализа. Подтвердите поглощение пищи глазом или под микроскопом вскрытия.
10. Повторите эксперименты с одними и теми же генотипами по крайней мере в три разных дня.

2. Сбор и анализ данных

1. Измерьте расстояние между_{началом} знака и_концом знака на капилляре с помощью калипера или линейки. Для передачи данных непосредственно в электронную таблицу используйте USB (Универсальный серийный автобус), подключенный к цифровому калиперу(рисунок 1E). Откажитесь от капилляров после измерения.
2. Учитывайте размер капилляров для расчета поглощения пищи или испарения. Например, рассмотрим капилляр длиной 73 мм и содержащий 5 мл пищевого раствора. Уменьшение мениска на 14,6 мм отражает поглощение раствора 1 мл. Рассчитайте поглощение пищи по следующей формуле:
   Поглощение пищи (ОЛ) - измеренное расстояние (мм)/ 14,6 мм
3. Чтобы исключить влияние испарения на потребление пищи, рассчитайте среднее испарение в трех (как минимум) контрольных флаконах без мух. Вычесть это среднее значение из стоимости, полученной для потребления продуктов питания мухами.
4. Используйте следующую формулу для определения общего потребления на лету:
   Потребление пищевых продуктов (ОЛ) - (Поглощение пищи ( L) - Испарительная потеря (L))/общее количество мух во флаконе. Для длительных экспериментов используйте количество мух живыми до начала интервала 24 ч.
5. Для учета различий в размерах тела, таких как между мужскими и женскими мухами, нормализуют потребление пищи до массы тела (пища/мг мухи).
6. Используйте статистическое программное обеспечение для анализа данных. Для обычно распределенных данных используйте T-тесты студентадля определения различий между двумя группами мух и используйте ANOVA (анализ дисперсии) с пост-специальными тестами Tukey Cramer для более чем двух групп. В ситуации выбора проанализируйте отличия от случайного выбора с помощью непараметрического одно образеца теста знака.

Representative Results

Рисунок 1: Drosophila меланогастер CApillary FEeder Assay. A) Кормление анализ с мухами. Увлажненной фильтровальной бумагой обеспечивается вода на дне флакона. В ходе эксперимента предусмотрено четыре капилляра (красная и синяя пища в противоположных капиллярах). Обратите внимание, что капилляры закреплены в положении вторым наконечником пипетки, а неиспользованные позиции закрываются с помощью пипеток. Пенная вилка в центре крышки позволяет обмениваться воздухом. B) Детальное представление крышки. Вырезать пипетки советы (2 - 20 йл, красные границы) вставляются в конические отверстия неиспользованных позиций, и второй кончик пипетки вставляется в разрез наконечник, чтобы закрыть отверстие. Вырезать пипетки советы используются для контроля размещения микрокапилляров, и необрезанные кончики используются для хлестить капилляры плотно. C) D. melanogaster летать питается капилляром. D) После кормления, пищевой цвет хорошо виден в животе мухи. E) Цифровой калипер используется для измерения расстояния между началом_знака и_концом знака мениска. Данные передаются непосредственно в электронную таблицу Excel через USB. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Рисунок 2: Влияние испарения в Capillary Feeder Assay. A) Несколько CAFE анализ помещены внутри пластиковой коробке с сеткой вставки. Для контроля влажности во время эксперимента внутри сетки помещаются четыре заполненных флакона воды (красные диски). Элементы управления испарением расположены в непосредственной близости от этих флаконов. Обложка для всей настройки отображается в фоновом режиме. B) Сравнение потери объема через испарение. Показано среднее значение испарения в течение 4 дней. Влажность контролируется i) применением воды к центральной губке bung (интервал 24 ч); ii) добавление в сетку четырех заполненных водой флаконов; и iii) с использованием пластиковой крышки для всей установки. Испарение значительно ниже, если влажность контролируется для обоих проверенных растворов(P ≤ 0.001; N No 48). Никаких различий в волатильности между содержащим etOH и несодержащих раствором сахарозы не обнаруживается с используемыми устройствами влажности. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Vials (breeding)	Greiner Bio-One	960177	www.greinerbioone.com
Vials (CAFE assay)	Greiner Bio-One	217101	www.greinerbioone.com
Lid-CAFE assay	Workshop	–	–
Plastic box, low wall	Plastime	353	www.plastime.it
Cover for the plastic box	Workshop	–	–
Capillaries	BLAUBRAND	REF 7087 07	www.brand.de
Pipette tips	Greiner Bio-One	771290	www.greinerbioone.com
Filter paper circles	Whatman	10 311 804	www.sigmaaldrich.com
D(+)-Sucrose	AppliChem	57-50-1	www.applichem.com
Ethanol absolute	VWR Chemicals	20,821,330	www.vwr.com
Food color (red, E124)	Backfun	10027	www.backfun.de
Food color (blue, E133)	Backfun	10030	www.backfun.de
Soap solution (CVK 8)	CVH	103220	www.cvh.de
Digital caliper	GARANT	412,616	www.hoffmann-group.com
Vials (breeding)			Height 9.8 cm, diameter 4.8 cm
Vials (CAFE assay)			Height 8 cm, diameter 3.3 cm
Lid-CAFE assay			Produced in university workshop, technical drawing supplied Please click here to download this file.
Plastic box, low wall			A plastic grid inlay was custom-made for 8 x 10 vial positions
Cover for the plastic box			Dimensions (37 x 29 x 18 cm)
Capillaries			DIN ISO 7550 norm, IVD-guideline 98/79 EG, ends polished
Pipette tips			Pipettes for the outer circle are cut according to the lid
Filter paper circles			45 mm diameter works nicely if folded for the vials used
D(+)-Sucrose			Not harmful
Ethanol absolute			Highly flammable liquid and vapor
Food color (red, E124)			Not stated
Food color (blue, E133)			Not stated
Soap solution (CVK 8)			Odor neutral soap
Digital caliper
Standard fly food			(for 20 L)
Agar			160 g
Brewer's Yeast			299.33 g
Cornmeal			1,200 g
Molasses			1.6 L
Propionic acid			57.3 mL
Nipagin 30%			160 mL