Overview
이 비디오는 음식 섭취와 억제되지 않은 과일 파리의 선호도를 측정하는 행동 방법인 CApillary FEeder 또는 CAFE, 분석법을 설명합니다. 이 기능을 갖춘 프로토콜은 음식을 전달하고 섭취를 추적하는 데 사용되는 액체 채워진 모세 혈관에서 최소한의 증발로 분석법을 수행하는 방법을 보여줍니다.
Protocol
이 프로토콜은 Diegelmann 외., CApillary FEeder 분석 측정 드로소필라 멜라노가스터에서 음식 섭취량을 측정, J. Vis. Exp. (2017)에서 발췌.
1. 공혈관 페이더 분석기 의 조립 및 수행
- 금식이 필요하지 않은 경우, 실험 파리를 도청하거나 블로우 파이프로 분석으로 옮는다. 증발을 정량화하기 위해 파리없이 세 개의 제어 바이알을 포함해야합니다.
- 조심스럽게 외부 개구부 중 하나를 닫는 파이펫 팁 (2 - 20 μL 부피)을 제거하고 채워진 유리 모세관, 바닥 끝을 먼저 삽입합니다. 피펫 팁을 모세관 옆에 다시 배치하여 모세관을 고정합니다. 여러 식품 솔루션이 테스트되는 경우 이 절차를 그에 따라 반복하십시오.
- 모세관 끝을 모든 바이알 내부에 두어 식품 공급원이 다른 높이(뚜껑에서 3- 4cm)에 위치할 경우 발생할 수 있는 편견을 피하기 위해 동일한 수준으로 배치합니다. 필터 용지 또는 식품 소스의 다른 점도에 실수로 터치하여 모세관이 누출되는 것을 방지하기 위해 필터 용지까지 거리를 유지합니다.
- 마커 펜(마크 시작)을 사용하여 컬러 액체의 상부에레이블을지정합니다. 다른 모세 혈관을 식별할 수 있도록 색상 또는 스트라이프 코드를 사용하여 개별적으로 레이블을 지정합니다.
- 여러 준비된 CAFE 애스터를 격자인 인레이가 있는 플라스틱 박스 안에 놓고상자(도2A)를실험실 조건 하에서 안전한 위치로 옮기거나 온도, 빛 및 습도 제어 기후 챔버(매개 변수: 25°C, 60% 상대 습도, 12h/12h 광-암흑 사이클)을 실험 기간(예: 3시간 또는 일)에배치한다.
- 분석이 며칠 동안 수행되면 바닥 필터 용지가 건조함에 따라 스폰지 붕(100 μL)을 통해 24시간마다 담수를 적용하여 분석 내부의 습도를 일정하게 유지합니다. 30mL ddH2O로 채워진 4개의 별도 바이알(높이 8cm, 직경 3.3cm)을 습도 장치로 사용하고 플라스틱 상자에 CAFE 애스터즈 옆에 놓습니다. 실험 중에 플라스틱 상자에 대한 커버를 사용하여 습도 제어 환경을만듭니다(그림 2A).
참고: 실험실 조건에서 더 넓은 가변성이 발생합니다. 그러나실온(예:교실)에서 CAFE 분석작업을 수행할 수 있습니다. 가습 장치(필터 용지, 젖은 스폰지 붕, 채워진 물 바이알 및 플라스틱 박스커버 가무) 사용으로 증발(도2B)을감소시킬 수 있습니다. - 모세 혈관을 24시간마다 장기 실험을 위해 새로 채워진 것으로 교체하십시오. 각 24 시간 간격 전에 죽은 파리를 기록하고 다음 기간 동안 비행 당 소비를 계산하기 위해 라이브 파리의 수를 사용합니다. 반월 상 연골의 쇠퇴를 측정 한 후 오래된 모세 혈관을 폐기하십시오 (참조 2.1).
참고: 3 h 실험 동안 우리는 거의 죽은 파리를 볼 수 없습니다. 4 일 간의 연구 기간 동안 우리는 일반적으로 1 - 3 죽은 파리를 찾습니다. - 분석의 끝에서 또는 모세 혈관을 교체하기 전에, CAFE 분석이 여전히 똑바로 있는 동안 마커 펜으로 모세혈관의 하부 반월 상연 (마크엔드)을표시합니다. 마크끝이 초기 마크(마크시작)보다낮지 않은 경우 데이터를 삭제합니다. 반월 상 연골을 변경할 수 있기 때문에 뚜껑을 제거하지 마십시오.
- 분석에서 모세 혈관을 조심스럽게 제거하고 데이터 수집을 위해 저장합니다. 음식이 파리에 접근 할 수 없기 때문에 모세관 내부의 액체가 데이터를 버리지 않으면 하부 끝에 도달했는지 확인하십시오. 병병당 모든 모세혈관을 그룹으로 수집합니다. 절단되지 않은 파이펫 팁을 모든 개구부에 삽입하여 파리가 탈출하지 못하도록 합니다. 설치를 해체하고 비누 욕조에서 바이알, 뚜껑 및 스폰지 번그를 씻고 실온에서 밤새 건조하여 추가 사용을 하십시오.
참고: 파리는 분석 후 더 분석할 수 있습니다. 눈또는 해부 현미경으로 음식 섭취를 확인합니다. - 적어도 3 개의 다른 일에 동일한 유전자형을 가진 실험을 반복합니다.
2. 데이터 수집 및 분석
- 캘리퍼 또는 눈금자를 사용하여 모세관의 마크시작과 마크끝 사이의 거리를 측정합니다. 데이터를 스프레드시트로 직접 전송하려면 연결된 디지털 캘리퍼(그림 1E)를사용하여 USB(유니버설 시리얼 버스)를 사용합니다. 측정 후 모세 혈관을 폐기하십시오.
- 모세관 크기를 고려하여 음식 섭취량 또는 증발을 계산합니다. 예를 들어 길이가 73mm이고 5μL의 식품 용액이 들어 있는 모세관을 고려하십시오. 반월 상연연의 14.6 mm 감소는 1 μL 용액의 섭취를 반영합니다. 다음 공식을 사용하여 음식 섭취량을 계산합니다.
음식 섭취량(μL) = 측정 거리(mm)/ 14.6mm - 음식 섭취에 대한 증발 효과를 제외하려면 파리없이 3 개의 (최소) 제어 바이알에서 평균 증발을 계산합니다. 파리가 음식 소비를 위해 얻은 값에서 이 평균 값을 뺍니다.
- 다음 수식을 사용하여 플라이당 총 소비량을 결정합니다.
식품 소비 (μL) = (음식 섭취량 [μL] - 증발 손실 [μL])/바이알의 총 파리 수. 장기 실험의 경우 24h 간격이 시작되기 전에 살아있는 파리 수를 사용합니다. - 남성과 여성 파리 사이 와 같은 신체 크기의 차이를 고려하려면 식품 소비를 체중(μL 음식/mg 플라이)으로 정상화하십시오.
- 데이터 분석을 위해 통계 소프트웨어를 사용합니다. 일반적으로 분산된 데이터의 경우 학생의 T-테스트를사용하여 두 플라이 그룹 간의 차이점을 확인하고 ANOVA(분산 분석)를 사용하여 두 개 이상의 그룹에 대해 후Hoc Tukey Cramer 테스트를 사용합니다. 선택 상황에서는 비파라메트릭 한 샘플 사인 테스트를 사용하여 임의선택과차이를 분석합니다.
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Representative Results
그림 1: 드로소필라 멜라노가스터 CApillary FEeder 분석. A) 파리와 함께 먹이 분석. 습한 필터 용지는 바이알 바닥에 물을 제공합니다. 실험 중에 4개의 모세혈관이 제공됩니다(반대 모세혈관의 적색 및 파란색 음식). 모세혈관은 두 번째 파이펫 팁으로 제자리에 고정되며 파이펫 팁을 사용하여 사용하지 않은 위치가 닫힙습니다. 뚜껑 중앙에 폼 플러그를 꽂아 공기 교환을 허용합니다. B) 뚜껑의 자세한 보기. 절단 파이펫 팁 (2 - 20 μL, 빨간색 테두리)은 사용하지 않은 위치의 원적 개구부에 삽입되고, 두 번째 파이펫 팁은 구멍을 닫기 위해 절단 팁에 삽입됩니다. 절단 파이펫 팁은 미세 모세 혈관의 배치를 제어하는 데 사용되며 절단되지 않은 팁은 모세 혈관을 단단히 유지하는 데 사용됩니다. C) D. 멜라노가스터 플라이가 모세관에 공급됩니다. D) 먹이 후, 음식 색깔은 플라이 복부에서 명확하게 볼 수 있습니다. E) 디지털 캘리퍼는 반월 상연의 마크시작과 마크끝 사이의 거리를 측정하는 데 사용됩니다. 데이터는 USB를 통해 Excel 스프레드시트로 직접 전송됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 모세관 피더 분석에서 증발의 영향. A) 여러 CAFE 분석이 격자 인레이가있는 플라스틱 상자 안에 배치됩니다. 실험 중 습도를 제어하기 위해 4개의 물이 채워진 바이알(빨간 림)이 그리드 내부에 배치된다. 증발 컨트롤은 이러한 바이알과 직접 근접하게 배치됩니다. 전체 설정에 대한 덮개가 백그라운드에 표시됩니다. B) 증발을 통한 볼륨 손실 비교. 4일 이상 증발의 평균 값이 표시됩니다. 습도는 (i) 중앙 스폰지 붕 (24 시간 간격)에 물을 적용에 의해 제어됩니다; (ii) 그리드에 4개의 물이 채워진 바이알을 추가; (iii) 전체 설정에 플라스틱 커버를 사용합니다. 테스트된 두 솔루션 모두에 대해 습도가 제어되는 경우 증발이 현저히 낮습니다(***P ≤ 0.001; N = 48). EtOH 함유 및 비함유 자당 솔루션 간의 변동성차이는 사용되는 습도 장치로 감지할 수 없습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Vials (breeding) | Greiner Bio-One | 960177 | www.greinerbioone.com |
| Vials (CAFE assay) | Greiner Bio-One | 217101 | www.greinerbioone.com |
| Lid-CAFE assay | Workshop | – | – |
| Plastic box, low wall | Plastime | 353 | www.plastime.it |
| Cover for the plastic box | Workshop | – | – |
| Capillaries | BLAUBRAND | REF 7087 07 | www.brand.de |
| Pipette tips | Greiner Bio-One | 771290 | www.greinerbioone.com |
| Filter paper circles | Whatman | 10 311 804 | www.sigmaaldrich.com |
| D(+)-Sucrose | AppliChem | 57-50-1 | www.applichem.com |
| Ethanol absolute | VWR Chemicals | 20,821,330 | www.vwr.com |
| Food color (red, E124) | Backfun | 10027 | www.backfun.de |
| Food color (blue, E133) | Backfun | 10030 | www.backfun.de |
| Soap solution (CVK 8) | CVH | 103220 | www.cvh.de |
| Digital caliper | GARANT | 412,616 | www.hoffmann-group.com |
| Vials (breeding) | Height 9.8 cm, diameter 4.8 cm | ||
| Vials (CAFE assay) | Height 8 cm, diameter 3.3 cm | ||
| Lid-CAFE assay | Produced in university workshop, technical drawing supplied Please click here to download this file. |
||
| Plastic box, low wall | A plastic grid inlay was custom-made for 8 x 10 vial positions | ||
| Cover for the plastic box | Dimensions (37 x 29 x 18 cm) | ||
| Capillaries | DIN ISO 7550 norm, IVD-guideline 98/79 EG, ends polished | ||
| Pipette tips | Pipettes for the outer circle are cut according to the lid | ||
| Filter paper circles | 45 mm diameter works nicely if folded for the vials used | ||
| D(+)-Sucrose | Not harmful | ||
| Ethanol absolute | Highly flammable liquid and vapor | ||
| Food color (red, E124) | Not stated | ||
| Food color (blue, E133) | Not stated | ||
| Soap solution (CVK 8) | Odor neutral soap | ||
| Digital caliper | |||
| Standard fly food | (for 20 L) | ||
| Agar | 160 g | ||
| Brewer's Yeast | 299.33 g | ||
| Cornmeal | 1,200 g | ||
| Molasses | 1.6 L | ||
| Propionic acid | 57.3 mL | ||
| Nipagin 30% | 160 mL |
