Overview
Questo video introduce i concetti alla base dell'imaging del calcio e include un protocollo di esempio per l'imaging time-lapse di worm contenuti in pozzi di agarosio modellati.
Protocol
Questo protocollo è un estratto da Turek et al, Agarose Microchambers for Long-term Calcium Imaging of Caenorhabditis elegans, J. Vis. Exp. (2015).
1. Imaging calcio
- Utilizzare ceppi transgenici che esprimono sensori di calcio geneticamente codificati come HBR16 (goeIs5[pnmr-1::SL1-GCaMP3.35-SL2::unc-54-3'UTR, unc-119(+)]).
- Utilizzare un microscopio composto attrezzato per l'epifluorescenza a campo largo. Collegare l'uscita TTL della fotocamera EMCCD all'ingresso TTL del LED, in modo che ogni volta che la telecamera registra un fotogramma il campione venga illuminato. Utilizzare un tempo di esposizione di circa 5 msec. Utilizzare il guadagno EM nell'intervallo da 50 a 300.
- Specificare un filmato burst in esecuzione per 24 ore con ogni worm che viene immaginato ogni 15 - 30 minuti prima per 20 secondi con DIC, quindi per 20 secondi con una fluorescenza GFP per registrare GCaMP, quindi prendere un'immagine finale del segnale mKate2 viene presa sotto controllo per i livelli di espressione. Utilizzare una frequenza fotogrammi di 2/sec durante ogni burst.
- Per l'ispezione visiva dei dati, utilizzare una mappa a colori falsi per migliorare la visibilità di piccoli cambiamenti nell'intensità della fluorescenza. Tracciare i dati fluorescenti come ΔF/F, con F come valore medio di base della fluorescenza. Una descrizione dettagliata dell'analisi dei dati del calcio può essere trovata in letteratura.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| LED system | CoolLED | pE-2 | |
| Compound microscope | Nikon | TiE | |
| EMCCD camera | Andor | iXon 897 | now sold as iXon Ultra 897 |
| Z-stage for the microscope | Prior | Nano Scan Z | |
| X-Y stage for the microscope | Prior | Proscan III | |
| Red light filter | Chroma | ET660/50m | |
| 35 mm Petri dish | Falcon | Falcon Disposable Petri Dishes, Sterile, Corning |
