Summary
यहाँ, हम एक गैर इनवेसिव दो photon माइक्रोस्कोपी (2P) ल्युकोसैट माउस लुटेरा में घर वापस आना अध्ययन दृष्टिकोण का वर्णन करता है. हम हमारे ऊतक इमेजिंग तैयारी के तकनीकी पहलुओं पर चर्चा की और से एक विशिष्ट प्रयोग प्रारंभिक निष्पादन और डेटा संग्रह करने के लिए सेट के माध्यम से पाठक चलना.
Abstract
दो photon माइक्रोस्कोपी (2P) एक उच्च संकल्प इमेजिंग तकनीक है कि मोटे तौर पर जीव के द्वारा रूपांतरित किया गया है है. 2P माइक्रोस्कोपी के मूल्य है कि यह अमीर spatiotemporal बरकरार ऊतकों के भीतर और रहते हैं चूहों में सेल व्यवहार के बारे में जानकारी प्रदान करता है. ल्युकोसैट भर्ती संक्रमण के खिलाफ मेजबान बचाव और जब अनियंत्रित में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है, सूजन और autoimmune रोग के लिए योगदान कर सकते हैं. Vivo में ल्युकोसैट भर्ती तकनीकी अध्ययन के बाद से कोशिकाओं के तेजी से प्रकाश बिखरने के ऊतकों के भीतर गहरे स्थित वाहिकाओं के भीतर बढ़ रहे हैं चुनौती दे रहा है. तिथि करने के लिए, सबसे intravital इमेजिंग अध्ययन रक्त वाहिकाओं और ऊतकों को बेनकाब करने के लिए शल्य चिकित्सा की तैयारी की आवश्यकता होती है. ऊतक नुकसान और सूजन सर्जरी के द्वारा ही प्रेरित से बचने के लिए, यहाँ, हम एक गैर इनवेसिव इमेजिंग एकल कक्ष दृष्टिकोण है कि माउस लुटेरा और phalanges में ल्युकोसैट तस्करी का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता का वर्णन. हम हमारे 2P इमेजिंग तैयारी के तकनीकी पहलुओं पर चर्चा की और प्रारंभिक से एक ठेठ प्रयोग निष्पादन और डेटा संग्रह करने के लिए सेट के माध्यम से पाठक चलना.
Protocol
1. पशु तैयारी:
इस प्रोटोकॉल वयस्क महिला वयस्क LysM-EGFP चूहों का उपयोग करता है, जिसमें neutrophils और मैक्रोफेज fluorescently एक EGFP की अभिव्यक्ति द्वारा चिह्नित कर रहे हैं.
- रक्त वाहिकाओं लेबल:
Visualize रक्त वाहिकाओं, गैर - लक्षित क्वांटम डॉट्स के 15μl (655nm) पीबीएस के 100 μl में पतला कर रहे हैं और माउस इमेजिंग से पहले 10-30 मिनट में नसों के द्वारा अंतःक्षिप्त. - संज्ञाहरण:
- पशु साँस लेना संज्ञाहरण प्रणाली (नोबल चिकित्सा सेवा, इंक) की प्रेरण कक्ष में माउस रखें.
- 3-4 Isoflurane% और 100% ऑक्सीजन वाहक गैस प्रवाह दर vaporizer सेट ~ 1 एल / मिनट. आकस्मिक संज्ञाहरण अधिक मात्रा को रोकने, बारीकी से पशु की निगरानी तक पीछे पैर की अंगुली चुटकी पलटा खो दिया है.
- संज्ञाहरण 1.5 पर बनाए रखा है ~ 2% Isoflurane और ठीक करने के लिए आवश्यक के रूप में साँस लेने कलाकृतियों को कम से कम इमेजिंग के दौरान देखते. माउस के साँस लेने की दर को ध्यान इमेजिंग सत्र के दौरान निगरानी की है संज्ञाहरण के एक पर्याप्त विमान बीमा.
- Puralube पशु मरहम को सुखाने को रोकने के आंखों के लिए लागू किया जाता है.
- माउस एक विनियमित 36 पर रखा गया है ° सी हीटिंग पैड (Braintree वैज्ञानिक) इंजेक्शन और इमेजिंग के दौरान और हाइपोथर्मिया को रोकने के.
- निर्जलीकरण को रोकने के लिए, माउस पीबीएस हर 1-2 घंटे सुप्रीम कोर्ट के 100 μl दिया है.
- एक सूजन प्रेरणा देते ल्युकोसैट भर्ती प्रेरित:
- सर्जरी चरण और 70% इथेनॉल के साथ लुटेरा झाड़ू पर माउस रखें.
- ~ 90 डिग्री बेवल इंजेक्शन की सुविधा और प्रसव गहराई की शुद्धता में सुधार के निकट एक इंसुलिन सिरिंज की सुई झुको.
- ई. कोलाई के 0.5 μg bioparticles 1μl पीबीएस में पतला के साथ सिरिंज लोड. यह एक microfuge यह आसान छोटी बूंद लोड करने के लिए बनाने के ट्यूब के ढक्कन में किया जा सकता है है.
- घुमावदार संदंश के साथ पैर की अंगुली पकड़ो और सुई धीरे बेवल ऊपर की ओर का सामना करना पड़ रहा जब तक यह त्वचा के ठीक नीचे है के साथ त्वचा के माध्यम से सम्मिलित है.
- धीरे इंजेक्षन और 5 सेकंड के लिए किसी भी वापस फ्लश को रोकने के लिए जगह में पकड़.
2. इमेजिंग चरण सेटअप:
इमेजिंग मंच के केंद्र के माध्यम से एक परिपत्र छेद में कटौती के साथ एक एल्यूमीनियम थाली के होते हैं. एक बड़े कांच कवर प्लेट और एक रबर O-अंगूठी शीर्ष पर सरेस से जोड़ा हुआ है के लिए एक तरल पदार्थ तंग recessed चैम्बर बनाने के लिए रियर पंजा समायोजित के नीचे करने के लिए सरेस से जोड़ा हुआ है. एल्यूमिनियम प्लेट 36 ° दो हीटिंग प्लेट के शीर्ष करने के लिए संलग्न तत्वों के माध्यम से सी गरम है.
- पूर्व गर्म इमेजिंग मंच पर माउस प्लेस और माउस कोर शरीर तापमान 36 डिग्री सेल्सियस वार्मिंग पैड का उपयोग बनाए रखने.
- Superglue की एक पतली फिल्म के साथ इमेजिंग चैम्बर के coverglass पंजा सुरक्षित.
- पंजा धो दो बार गोंद के किसी भी अस्थायी बिट्स को दूर करने के लिए और फिर ताजा पीबीएस (° C 36 पूर्व गर्म) के साथ चैम्बर भरें.
चूहे जानवर व्यवहार्यता शामिल के बिना अप करने के लिए 4 घंटे के लिए imaged किया जा सकता है. पैर धीरे एसीटोन और अनुदैर्ध्य इमेजिंग अध्ययन के लिए पुनर्जीवित चूहों की एक छोटी राशि के साथ जारी किया जा सकता है. हालांकि, इस मामले में, हम <2 घंटे के लिए इमेजिंग अवधि की सिफारिश और सत्र के बीच 24-48 घंटे इंतजार संज्ञाहरण अधिक मात्रा या निर्जलीकरण के जोखिम को कम.
3. इमेजिंग अधिग्रहण
दो photon माइक्रोस्कोप (2P माइक्रोस्कोप) इस प्रोटोकॉल में प्रयोग किया जाता एक कस्टम निर्मित दोहरी लेजर वीडियो दर एक ईमानदार माइक्रोस्कोप मिलकर व्यवस्था है. प्रणाली दो तिवारी के साथ सुसज्जित है: नीलम लेज़रों, चार सिर पर एक साथ 3 और 4 चैनल के अधिग्रहण और एक 20x पानी विसर्जन उद्देश्य (ओलिंप, 20x/0.95 एनए) के लिए द्विपक्षीय क्षार PMTs.
- 890-900nm नीलमणि लेजर (सुसंगत इंक): गिरगिट XR तिवारी ट्यून.
- तीन चैनलों अलग करने के लिए: (नीला <480 एनएम, दूसरी हार्मोनिक पीढ़ी संकेत), (480-560nm, LysM-EGFP सकारात्मक neutrophils) हरे और लाल (> 560 एनएम, क्वांटम डॉट लेबल रक्त वाहिकाओं 480nm और 560nm dichroic दर्पण (SemRoc) का प्रयोग करें ). वैकल्पिक रूप से है, 560nm फिल्टर 570nm ई. भेद फिल्टर के साथ प्रतिस्थापित किया जा सकता 655nm क्वांटम डॉट्स (लाल गहरी दिखाई देगा) से कोलाई bioparticles (576nm bioparticles नारंगी दिखाई देगा).
- ध्यान से पीबीएस में उद्देश्य कम और पैर की अंगुली का एक पोत पर ध्यान केंद्रित.
- वीडियो की दर (30f/sec) में छवि अधिग्रहण गति ऑपरेटिंग और दूसरा हार्मोनिक कोलेजन से निकलती एक ऊतक ऐतिहासिक के रूप में, जल्दी से ऊतक सर्वेक्षण (वीडियो दर अधिग्रहण गति पर) के लिए ब्याज की एक रक्त वाहिका (एक का पता लगाने के संकेत का उपयोग कर के साथ दिखाई lysM EGFP neutrophils के साथ).
- PMTs पर हासिल करने के लिए रंग जुदाई अनुकूलन और पृष्ठभूमि पर पर्याप्त संकेत प्राप्त करने के लिए आवश्यक लेजर की राशि कम से कम (जा समायोजित करेंसावधान छवि नहीं तर!).
- एक बार हितों के क्षेत्र क्षेत्र में स्थित है, समय चूक इमेजिंग शुरू करते हैं. समय चूक इमेजिंग दो अलग टेम्पोरल संकल्प के साथ प्रदर्शन किया जा सकता है है. इमेजिंग सेल रोलिंग और आसंजन के लिए और रक्त वाहिकाओं के भीतर वास्तविक समय में, हम एक एकल z विमान पर 30f/sec अधिग्रहण. सेल और parenchyma में extravasation प्रवास का दस्तावेजीकरण करने के लिए हम समय चूक की 3 डी इमेजिंग प्रदर्शन करते हैं. एक ठेठ अधिग्रहण प्रोटोकॉल प्रत्येक z-कदम के लिए 15 तख्ते औसत और Z कदम 50μm 200-225 की एक मात्रा के लिए 30 सेकंड अंतराल पर 21 अनुक्रमिक 2.5μm प्राप्त शामिल होंगे.
- एक बार डेटा फ़ाइलों प्रयोगशाला सर्वर पर संग्रहीत हैं, Volocity या सॉफ्टवेयर Imaris बहु आयामी प्रतिपादन और सेल 2 ट्रैकिंग, 3 करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है .
4. प्रतिनिधि परिणाम
(30f/sec) न्युट्रोफिल के 1.Real समय कल्पना 200x वाहिकाओं के साथ रोलिंग. समय चूक इमेजिंग neutrophils से पता चलता है, हरे रंग में, लाल रंग में दिखाया गया लिस्टेरिया monocytogenes के साथ संक्रमण के बाद 10mins के बारे में रक्त वाहिकाओं के endothelium साथ रोलिंग. कोलेजन फाइबर संयोजी ऊतक में नीले रंग में दिखाई देते हैं. कृपया यहाँ क्लिक करें वीडियो को देखने.
200x पर 2.Time चूक न्युट्रोफिल भर्ती गतिशीलता की 3 डी इमेजिंग. परिसंचरण और सूजन ऊतकों के माध्यम से प्रवास से ठेठ न्युट्रोफिल भर्ती दिखाया गया है. कृपया यहाँ क्लिक करें वीडियो को देखने.
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Discussion
इस वीडियो प्रोटोकॉल में हम सूजन के जवाब में गैर इनवेसिव ल्युकोसैट भर्ती के 2P इमेजिंग के लिए प्रक्रियाओं को प्रदर्शित करता है.
लुटेरा एलर्जी, संक्रमण, और autoimmune रोग 4-7 जैसे सूजन के अध्ययन के लिए एक क्लासिक शारीरिक साइट है . 2P इमेजिंग रोलिंग और effector समारोह की साइटों के लिए chemotaxis के लिए रक्त वाहिकाओं में आसंजन से ल्युकोसैट तस्करी रास्ते में विशिष्ट चरणों की एक विस्तृत चित्र प्रदान करता है. हमने पाया है कि ल्युकोसैट भर्ती भड़काऊ उत्तेजनाओं के विभिन्न प्रकार के जवाब में बदलता है. उत्तेजना की खुराक सावधानी से चुना जाना चाहिए और हर प्रयास करने के लिए एक शारीरिक अपमान पुनरावृत्ति बनाया. यदि खुराक भी उच्च या एक गैर शारीरिक साइट के लिए दिया है, उत्तेजना मेजबान या प्रयोगात्मक कलाकृतियों के लिए नेतृत्व डूब और असामान्य घटना का उत्पादन हो सकता है. हम पायलट प्रयोगों के लिए एक उपयुक्त नियंत्रण और एक तुला सुई का उपयोग करने के लिए दोनों वितरित की मात्रा और इंजेक्शन की गहराई की शुद्धता को बढ़ाने के साथ बनती titrated उत्तेजनाओं की खुराक की सिफारिश. यह भी धारावाहिक इमेजिंग प्रयोगों के लिए विशेष रूप से महत्वपूर्ण है कि इंजेक्शन के स्थल आसानी से स्थित हो सकता है. यह एक विशिष्ट स्थान है (यानी, दूसरा सही हिंद पंजा के तीसरे पैर के अंगूठे पर अंक) में इंजेक्शन लगाने के द्वारा या त्वचा को गोदने और पास इंजेक्शन द्वारा पूरा किया जा सकता है.
2P इमेजिंग ल्युकोसैट के अवैध व्यापार और vivo में effector समारोह कल्पना करने के लिए एक अनूठा अवसर प्रदान करता है. intravital इमेजिंग के बहुमत ल्युकोसैट भर्ती का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया दृष्टिकोण सर्जरी की आवश्यकता anesthetized चूहों 8-10 में ऊतकों और रक्त वाहिकाओं को बेनकाब. सर्जरी ही सूजन है कि ल्युकोसैट व्यवहार प्रभाव होगा लाती है. हालांकि, 2P इमेजिंग leukocytes गैर invasively और एकल कोशिका देशी 3 डी ऊतक वातावरण के भीतर गहरे संकल्प पर अध्ययन करने के लिए अनुमति देता है. इसके अलावा, इमेजिंग प्रक्रिया के बाद से ही माउस को नुकसान नहीं करता है, यह कैंसर और गठिया के मॉडल के लिए अनुदैर्ध्य अध्ययन प्रदर्शन के लिए एक उत्कृष्ट पसंद है. 2P इमेजिंग की क्षमता प्रदान करने और संकल्प, एक व्यक्ति जानवर विषय के भीतर सभी रोग दीक्षा और प्रगति से एक रोग की प्रक्रिया के अभूतपूर्व दृश्य है. इस दृष्टिकोण सेलुलर और आणविक तंत्र है कि संक्रमण के लिए सेलुलर रोगक्षमता और ये वही प्रतिक्रियाएं, अगर अनुचित तरीके से विनियमित है, सूजन और autoimmune रोग के लिए नेतृत्व कर सकते हैं कि कैसे आबाद में अंतर्दृष्टि प्राप्त करने के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरण है. अंततः, vivo में ल्युकोसैट व्यवहार की एक विस्तृत चित्र भड़काऊ और संक्रामक रोगों के इलाज के लिए नई चिकित्सा विज्ञान के विकास में सहायता हो जाएगा.
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Disclosures
सेंट लुइस में वाशिंगटन विश्वविद्यालय के पशु अध्ययन समिति द्वारा अनुमोदित प्रोटोकॉल के अनुसार सभी प्रयोगों प्रदर्शन किया गया.
Acknowledgments
यह काम एनआईएच R01-३१५५-५३,५०२ अनुदान और वाशिंगटन विश्वविद्यालय फाइजर बायोमेडिकल रिसर्च समझौते के द्वारा समर्थित किया गया था.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Isoflurane, USP | Butler Animal Health Supply | 029405 | |
| 655nm non-targeted quantum dots | Invitrogen | Q21021MP | |
| Tetramathylrhodamine conjugated E. coli BioParticles | Invitrogen | E2862 | |
| Listeria monocytogenes (Lm) | Reference 2 | ||
| Quick gel | Duro | ||
| Puralube Vet Ointment | Pharmaderm Animal Health | ||
| Insulin syringes | BD Biosciences | 08290-3284-38 | |
| PBS | Thermo Fisher Scientific, Inc. | SH30256.02 |
References
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