Neuralrohrschlusses in Maus Whole Embryo Culture

Summary

Eine Methode zur direkten pharmakologischen Manipulation von Maus-Embryonen während der Neurulation, dass mütterliche Stoffwechsel umgeht beschrieben. Die Technik lässt sich an verschiedenen Aspekten der Neurulation durch Variation der Zeitpunkt und pharmakologischen Wirkstoffs zu untersuchen.

Abstract

Genetische Mausmodelle sind ein wichtiges Werkzeug bei der Untersuchung von Säugetieren Neuralrohrschlusses (Gray & Ross, 2009; Ross, 2010). Allerdings ist die Untersuchung von Maus-Embryonen in utero durch unsere Unfähigkeit, direkt pharmakologisch zu manipulieren die Embryonen isoliert von den Auswirkungen der mütterlichen Stoffwechsel auf das Reagenz von Interesse begrenzt. Ob mit einem kleinen Molekül, rekombinantes Protein oder siRNA, daß diese Substanzen, um die Mutter, über die Nahrung oder durch Injektion werden diese instabile Verbindungen zu einer Vielzahl von körperlichen Abwehrkräfte, die verhindern, dass sie hätte vom Erreichen der Embryo Thema. Untersuchungen in den Kulturen der ganzen Embryonen können zur Trennung von der Mutter aus intrinsischen fetalen Auswirkungen auf die Entwicklung.

Hier stellen wir ein Verfahren zur Kultivierung Maus-Embryonen mit hoch angereichertem Medien in einer Rolle Inkubator Apparat, der für den normalen Neuralrohrschlusses nach der Sektion (Crockett, 1990) ermöglicht. Einmal in der Kultur, können Embryonenmanipuliert mit in-vitro-Techniken, die sonst nicht möglich wäre, wenn die Embryonen noch in utero konventionellen werden. Embryo Geschwister können zu verschiedenen Zeitpunkten erhoben werden, um verschiedene Aspekte der Neurulation, auftretende von E7-7.5 (Neuralplatte Bildung, kurz vor dem Beginn der Neurulation) bis E9.5-10-Studie (am Ende der Schädelbasis falten und Neuroporus caudalis Schließung, Kaufman, 1992). In diesem Protokoll, demonstrieren wir unsere Methode zum Präparieren Embryonen Zeitpunkten, die optimal für das Studium der Schädelbasis Neurulation sind. Embryonen werden bei E8.5 (ca. 10-12 somities) zerlegt werden, nach der Einleitung der Neuralrohrschlusses aber vor Embryo Dreh-und Schädelknochen neuronalen fach Verschluss, und in Kultur gehalten, bis E10 (26-28 somities), wenn kranialen Neurulation abgeschlossen sein.

Protocol

1. Herstellung von Nährmedien - alle Reagenzien sind in Tabelle 1 aufgelisteten

1. Thaw männlichen Rattenserum bei 37 ° C.
2. Heat-Inactivate Rattenserum für 30 min bei 55 ° C
3. Centrifuge Rattenserum bei 10K für 5 Minuten bei Raumtemperatur
4. Überstand entfernen und mischen 50:50 mit Phenol-rot DMEM w / High Glucose
5. Sterilisation der Medien mit einem 0,45 um Spritzenfilter
6. Mindestens 1 ml media / Embryos vorbereitet sein sollte

2. Die Isolierung des Uterus von der schwangeren Mutter

1. Unter Verwendung der Verfahren durch die Institutional Animal Care und Verwenden Committee (IACUC) genehmigt wurde, wird die schwangere Mutter erste betäubt und dann durch Genickbruch getötet
2. Sterilisieren des Bauches mit 70% EtOH
3. Pinch einem kleinen Pfad der Haut entlang der Mittellinie, knapp oberhalb der Brustwarzen, mit großen Zangen und den Bauch unter Ihrer Pinzette mit großen Scheren. Achten Sie darauf, keine innere Struktur Schädens
4. Verwenden Sie Ihre Schere seitlich abgeschnitten von der ersten Öffnung gegenüber jeder Seite der Maus, so dass das gesamte Abdomen ist offen
5. Darm und überschüssige Fettpolster oft obskure der Gebärmutter und diese sollten beiseite verschoben werden, so dass der obere Teil der Gebärmutter und der Eierstöcke auf jeder Seite beobachtet werden können
6. Pinch der Spitze der Gebärmutter unter der Eierstöcke und nutzen Sie Ihre Schere in die Gebärmutter aus dem Fett zu trennen, schneiden von einem Ende der Gebärmutter zu den anderen Eierstock
7. Heben Sie die Gebärmutter mit einer Pinzette und in eine Petrischale mit Kochsalzlösung

3. Beseitigung von Embryonen aus der Gebärmutter

1. Spülen Sie den Uterus mit Kochsalzlösung, um überschüssiges Blut zu entfernen und schneiden Sie die überschüssige Fett von außen
2. Transfer in ein sauberes Geschirrtuch mit Raumtemp. Tyrodes Kochsalzlösung zur Visualisierung verbessern
3. Mit einem Stereomikroskop, trennen Sie die einzelnen Embryo entweder mit einer kleinen Schere oder ggf. feinen (# 5) Pinzette vorsichtig schälen die Gebärmutter auseinander.
<li> Einfügen feinen Pinzette in den Raum zwischen der Gebärmutterwand und der Dezidua und abziehen der Gebärmutterwand, man aufpassen, nicht zu durchbohren den Embryo

4. Entfernung von decidua aus Embryonen

1. Orient der Decidua, so dass die dunkleren Teil (Plazenta) von Ihnen weg vor
2. Machen Sie einen Schnitt mit einer Pinzette an der Trennlinie zwischen den dunklen Teil der Decidua aus dem leichteren Teil, wobei darauf geachtet, nicht zu tief geschnitten
3. Vollständige Trennung der Plazenta von der Spitze der Dottersack, darauf achtend, nicht die ectoplacental Kegel (EPC) zu reißen. An diesem Punkt sollten Sie in der Lage sein, die Reicherts Membran auf der Dottersack sichtbar
4. Fahren Sie mit dem gesamten decidua (heller Bereich) zu achten, nicht zu durchbohren den Dottersack entfernen
5. Gently Prise und entfernen Sie den Reicherts durch Schälen Sie es aus dem EPC. Wenn die EPC ist beschädigt oder getrennt von den Dottersack, wird Embryos nicht normal wiederum von E8.5-E9.5

5. Einrichten des Kultur-System

1. Schneiden Sie das Ende einer Kunststoff Transferpipette mit einer Schere auf die Durchmesser der Öffnung zu erhöhen, so dass sich ein Embryo ohne Beschädigung der Dottersack pipettiert werden können
2. Füllen Sie sauberes Rollerflaschen mit 1 ml Medium pro Embryo. Je nach Art der Rollerflaschen verwendet ein Maximum von 3-6 Embryonen können in jeder Flasche geladen werden.
3. Übertragen Sie die Embryonen mit Ihren Schnitt Pipette an die Medien gefüllt Rollflasche, mit über so wenig wie möglich Tyrodes, um nicht an die Medien zu verdünnen
4. Bringen Sie die Gummi-Stecker (Spund) an die Spitze des Glases Rollflasche
5. Legen Sie die Rollerflaschen in die Walze Kultur Trommel, so dass eine Abdichtung zwischen dem Stecker und der Trommel bildet
6. Wenn alle Flaschen angebracht wurden, und jede leere Slots in der Trommel wurden w versiegeltith Gummistopfen, aktivieren Sie die Walze
7. Öffnen CO ₂ und O _2-Panzer und stellen Sie sie auf ca. 2 psi, so dass das Auslassventil ist die Freigabe einer Blase pro Sekunde. Für E8.5-E10 Embryonen, sollten 20% O ₂ und 5% CO ₂ verwendet werden.
8. Stellen Sie sicher, dass der Inkubator auf 37 ° C eingestellt und decken oder in der Nähe des Inkubators, so dass die Embryonen von Licht abgeschirmt sind.
9. Embryonen sollten regelmäßig überprüft werden, um ihre Entwicklung durch die Zugabe von somities, das Fortschreiten der Drehung, und das Ausmaß der Neuralrohrschlusses bewerten
10. Nach 2-3 Stunden in Kultur, kann pharmakologische Inhibitoren oder andere Behandlungen, die Medien hinzugefügt werden
11. Das Design der Studie sollte auch kontrolliert, wie Fahrzeug-oder inaktiven Analoga Studie Reagenz.

6. Auswertung der Entwicklung nach ganzen Embryo Kultur

1. Schalten Sie Gas, Anschlagrolle und Entnahme der Flaschen aus Inkubator
2. Transfer-Embryonen zurück zur Tyrodes oder PBS in einer Petrischale zur Auswertung unter Stereomikroskop
3. Der Dottersack sollte Ballon-like erscheinen, einen Herzschlag sichtbar sein soll und die Herzfrequenz sollte> 120 Schläge pro Minute, und Kreislauf sollte klar sein,
4. Foto Embryonen vor der Dottersack Entfernung ggf.
5. Entfernen Dottersack von Embryos durch ein Loch in der Nähe des EPC und Spiegeln der Dottersack und Amnion über den Kopf und Rumpf des Embryos.
6. Die Nabelschnur kann passgenau auf den Dottersack aus dem Embryo zu trennen, und der Dottersack kann für die Genotypisierung der Embryo gegebenenfalls verwendet werden.
7. Untersuchen Sie den Embryo für Somiten Anzahl und Neuralrohrdefekten, wie offene Schädel-Falten, unvollständigen Verschluss des Gesichts und / oder eine offene kaudale Neuroporus. Embryonen können nach dem Theiler Klassifizierung von mehreren morphogenetischen Veränderungen (inszeniert werden http://www.emouseatlas.org/ emap / home.html ) Wieder eine fotografische Aufnahme desEntwicklung des Embryos ist nützlich.

7. Hinweise

1. Eine hohe Qualität Dissektion ist wichtig, weil jede nick oder Tränen in den Dottersack erfolgreichen Drehen verhindern und hemmen die normale Entwicklung. Der EPC kann auch bei der Entfernung der Reichert-Membran (RM) beschädigt werden, und wenn der EPC ist auch nur teilweise aus dem Dottersack getrennt, Embryonen nicht normal entwickeln. Allerdings kann eine unvollständige Entfernung der RM führen Embryonen zu verkleben und / oder RM-Zellen können in Kultur überwuchern und einengen Dottersack Expansion, die beide eine normale Entwicklung behindern würde.
2. Saubere und scharfe Zange sind das Geheimnis für ein gutes Dissektion, weil stumpf oder verbogen Pinzette das Verfahren erheblich erschweren. Eiweiß-Ablagerungen auf den Instrumenten wird zu Gewebeschäden führen.
3. Saubere, sterile Glasflaschen sind auch wichtig, um Embryonen aus Festhalten an der Seitenwand und nicht beschädigt werden. Vor Beginn des Experiments, sollten Flaschen scr werdenubbed mit Wasser und Seife, spülen in dH ₂ O, und der Mikrowelle mit einer kleinen Menge von Wasser in jeder Flasche, bis das Wasser kocht. Die Flaschen werden dann mit 70% EtOH gespült und an der Luft trocknen lassen.
4. Arbeiten so schnell wie möglich, denn je früher der Embryo in die Kulturmedien übertragen werden können und wärmte wieder auf 37 ° C die bessere Überlebenschancen.
5. Komplette Zerlegung der gesamte Wurf vor der Übertragung keine Embryonen Rollerflaschen, so dass jeder Embryo ist bei Raumtemperatur für die gleiche Menge an Zeit, damit Sie keine Unstimmigkeiten in der embryonalen Entwicklung
6. Pflegen Sie eine sterile Umgebung, um Kontaminationen der Kulturen zu verhindern. Unsere Kultur Experimente haben ohne Antibiotika durchgeführt worden, aber viele Labors add Antibiotika, um ihre Medien ein Bakterienwachstum zu verhindern. Das Medium erscheinen soll so klar am Ende des Experiments, wie es zu Beginn des Experiments war. Wenn Medien geworden bewölkt oder es ist ein sichtbares Präzipitat, gibt es wahrscheinlich eine conKontamination, die Ihre Kultur infiziert hat.
7. Unwirksame Gasaustausch kann auch verzögert Embryonen Entwicklung, so sicher sein, eine zuverlässige Regelung, dass eine kontinuierliche Lieferung zu gewährleisten haben.
8. Embryonen entwickeln ca. 50% langsamer in ex vivo Kultur, daher ist es wichtig, Somiten zählen, um sicherzustellen, dass Sie über die entsprechenden Stufe der Entwicklung für den Abschluss des Experiments erreicht.

8. Repräsentative Ergebnisse:

Das Aussehen des Embryos vor und nach-roller Kultur ist in Abbildung 1 dargestellt. Zum Zeitpunkt der Dissektion, sollte Embryonen in einem unversucht Konfiguration (Abb. 1A, D), wo der Schwanz ist hinter dem Kopf faltet werden. Nach 36 Stunden in Kultur, sollten Embryonen abgeschlossen haben, so drehen, dass sie in der C-gebogen, fötalen Position, wo der Schwanz ist vor dem Kopf (Abb. 1B, C, E, F) sind. Pharmakologische Manipulation mit RhoA-Kinase-Inhibitor (Y-27632), ein bekannter Inhibitor der konvergenten Extension währendNeurulation (Ybot-Gonzalez, 2007), führt zu einer Verkürzung der Embryonen über ihre rostral-kaudale Achse (Abb. 1E, F) und hemmt die kraniale neuronalen fach Verschluss. Unsere Daten zeigen, dass steigende Dosen von Y-27632 schrittweise beeinträchtigt kranialen fach Verschluss (Abbildung 2A) und verkürzt die Körperachse (Abb. 2B), im Einklang mit der Rolle des nachgeschalteten RhoA Signalisierung in kranialer Neurulation und konvergente Extension.

Abbildung 1. Aussehen der Kulturen Embryonen und die Manipulation mit den pharmakologischen Inhibitor Y-27632. (A, D) Dissected Embryonen E8.5 vor ganzen Embryo Kultur (B, E) Embryos bei E10 mit dem Dottersack noch intakt, im Anschluss an 36 Stunden von Wälz-Kultur. (C, F) Der Dottersack wurde entfernt, um erfolgreiche Dreh-und Neuralrohrschlusses illustrieren. Embryonen, die mit dem Rho-Kinase-Inhibitor Y-27632 (E, F) behandelt wurden, nicht um eine ordnungsgemäße konvergenten Erweiterung zu unterziehen und verdeutlicheneine verkürzte Körperachse.

Abbildung 2. Wirkung von RhoA-Kinase-Inhibitor auf kraniale Neuralrohrschlusses und Achsen Dehnung. (A) Der Anteil der Embryonen, die in der Lage, erfolgreich in der Nähe ihrer kranialen Falten (% NTC = Prozentsatz Neuralrohrschlusses) waren, ist die Dosis von Y-27632 im Vergleich hinzugefügt Kulturmedien. (B) Der Abstand zwischen den otic Vesikel und Vorderbein deutlich bei steigenden Dosen von Y-27632 (p <.05) reduziert.

Discussion

Die Fähigkeit, mütterlichen, intrauterine Faktoren von denen, die untrennbar mit der Embryo während seiner Entwicklung separaten ist ein wichtiges Instrument für das Studium in allen Phasen der Embryogenese. Hier haben wir die Auswirkungen eines kleinen Moleküls Inhibitor der RhoA-Kinase am kranialen Neurulation ex utero, wodurch die Variable des mütterlichen Stoffwechsel des Medikaments analysiert. Diese pharmakologischen Manipulation hat eine tiefgreifende Wirkung auf kraniale Neurulation und konvergente Extension. Die Empfindlichkeit dieser Verbindung kann zwischen verschiedenen genetischen Mausmutanten verglichen werden. Die hier vorgestellte Methode kann auch zu Studien anderer molekularer Signalwege in der Entwicklung eingesetzt werden, so dass die direkte Manipulation der zellulären Funktion in Embryonen mit einer Vielzahl von Reagenzien.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Stereomicroscope for Dissection	Leica Microsystems	M165
Precision Incubator	BTC Engineering	BTC 001
Rotating Bottle Culture Unit	BTC Engineering	BTC 003
Glass Bottles for Rotating Unit	BTC Engineering	BTC 005
Silicone Rubber Bung	BTC Engineering	BTC 007
Silicone Rubber Cork	BTC Engineering	BTC 008
Gas Bubbler Inlet	BTC Engineering	BTC 012
Gas Bubbler Inlet Trap	BTC Engineering	BTC 013
Gas Bubbler Outlet	BTC Engineering	BTC 014
Gas Cylinder	Tech Air		20% O2, 5% CO2
Gas Regulator	Tech Air
Male Rat Serum	Harlan Laboratories	4520
DMEM w/o phenol red	Invitrogen	31053
10 mL Syringe	BD Biosciences	309604
Syringe Filter	Nalge Nunc international	190-2545
Large Dissecting Scissors (Blunt tip)	VWR international	82027-594
Extra Fine Bonn Scissors	Fine Science Tools	14084-08
Dumot #5 forceps	Fine Science Tools	11252-50
Tyrode’s Saline			As described in Cockroft 1990
10 cm Disposable Petri Dish	BD Biosciences	351029