Summary
Abbiamo sviluppato strumenti di laboratorio nuovi e protocolli per l'acquisizione di immagini intravitale del timo. La nostra tecnica dovrebbe aiutare nell'identificazione di "nicchie" all'interno del timo in cui lo sviluppo delle cellule T si verifica.
Abstract
Microscopia a due fotoni (TPM) fornisce l'acquisizione di immagini in aree dentro tessuti e organi. In combinazione con lo sviluppo di nuovi strumenti stereotassica e procedure chirurgiche, TPM diventa una potente tecnica per identificare i "nicchie" all'interno di organi e al documento cellulari "comportamenti" di animali vivi. Mentre l'imaging intravitale fornisce informazioni che meglio ricorda il reale comportamento cellulare all'interno dell'organo, è sia più faticoso e tecnicamente impegnativo, in termini di attrezzature necessarie / procedure alternative di acquisizione ex vivo imaging. Così, si descrive una procedura chirurgica e romanzo titolare "stereotassica" organo che ci permette di seguire i movimenti di Foxp3 + all'interno delle cellule del timo.
Foxp3 è il principale regolatore per la generazione di cellule T regolatorie (Tregs). Inoltre, queste cellule possono essere classificati secondo la loro origine: cioè. timo differenziato Tregs sono chiamati "in natura Tregs" (nTregs), o comepposed a livello periferico, convertito Tregs (pTregs). Anche se notevole quantità di ricerche è stato riportato in letteratura riguardanti il fenotipo e la fisiologia di queste cellule T, molto poco si sa circa la loro interazione in vivo con altre cellule. Questa carenza può essere dovuto alla mancanza di tecniche che permettono tali osservazioni. Il protocollo descritto in questo articolo fornisce un rimedio per questa situazione.
Il nostro protocollo prevede l'utilizzo topi nudi che mancano di un timo endogena dal momento che hanno una mutazione puntuale nella sequenza di DNA che compromette la differenziazione di alcune cellule epiteliali, tra cui le cellule epiteliali del timo. Topi nudi sono state gamma-irradiati e ricostituito con zucchine osseo (BM) da Foxp3-KI GFP / GFP topi. Dopo il recupero BM (6 settimane), ogni animale ha ricevuto il trapianto di timo embrionale all'interno della capsula renale. Dopo l'accettazione del timo (6 settimane), gli animali sono stati anestetizzati, il rene che contiene iltimo trapiantato è stato esposto, titolare fisso nel nostro organo, e tenuto in condizioni fisiologiche di imaging in vivo da TPM. Abbiamo utilizzato questo approccio per studiare l'influenza di droghe nella generazione di cellule T regolatorie.
Protocol
1. Animal preparazione
Note importanti: sospensioni cellulari BM e trapianti timica sono state effettuate in condizioni asettiche. Le sospensioni BM sono stati preparati all'interno del cappuccio della nostra camera coltura cellulare, mentre il trapianto di timo è stata eseguita in sala operatoria situata all'interno della nostra struttura animale. Al fine di mantenere e garantire queste condizioni asettiche, non ci era permesso di registrare il nostro video in questi luoghi. Tuttavia, tutti i materiali chirurgici sono stati sterilizzati in autoclave e la panchina chirurgica è stata precedentemente puliti con Virkon (Pharmacal Research Laboratories Inc.) e il 70% di etanolo. Tutte le procedure sono state approvate dalla cura degli animali e uso Comitato Istituzionale (IACUC) ed erano in accordo con la Federazione delle Associazioni degli animali europea Science Laboratory (FELASA) direttive. Il numero ID approvazione è AO10/2010. Tutti gli esperimenti sono stati procedure immagine del terminale e gli animali sono stati sottoposti ad eutanasia immediatamente successivo alla fine di immagineacquisizione.
La procedura dettagliata è la seguente:
- Irradiare (con un γ-irradiatore) 8 settimane topi vecchi Nudo con 900 rad per distruggere i precursori emopoietici endogena all'interno dell'osso zucchine (BM). Dopo l'irradiazione, tornare gli animali nelle loro gabbie fino a preparare le cellule del donatore BM per iniezione endovenosa e ulteriormente ricostituzione BM. Questo trasferimento BM è stata eseguita 1 ora dopo l'irradiazione.
- Separare gli animali donatori BM. Tibie e femori degli arti posteriori di un animale sono generalmente sufficienti a ricostituire fino a 3 animali destinatario. Dopo l'eutanasia con la CO 2, rimuovere gli arti posteriori e quindi rimuovere la pelle ei muscoli dalle ossa.
- Tagliare l'estremità chiusa di ogni osso e lavare con PBS (o RPMI) o schiacciarli tutti in un mortaio, con un pestello, con 2 ml di PBS (o RPMI) per rimuovere il BM.
- Disturbare la struttura BM in una cella singola sospensione da ripetizioni di aspirazione USI vigorosang una pipetta P1000. In alternativa, si può anche passare la BM in tutto un ago 21G siringa più volte. Centrifuga (400g, 5 min, RT), risospendere le cellule in PBS, e iniettare per via endovenosa nel vostro nude-irradiati destinatari. Nei nostri esperimenti abbiamo utilizzato BM da Foxp3-KI GFP / topi GFP in cui tutte le cellule T regolatorie (Tregs) esprimono GFP 1.
- L'accettazione del BM donatore si verifica nei primi giorni dopo il trasferimento, in quanto il mancato BM-ricostituito gli animali non possono sopravvivere più di 14 giorni. Tuttavia, si dovrebbe attendere da 4 a 6 settimane per consentire il recupero completo di tutti i comparti BM. Bactrim (Roche) è stato aggiunto all'acqua (2 mg / ml) durante la prima settimana dopo l'irradiazione per diminuire il rischio di infezioni batteriche.
- Timo trapianto embrionale è stato già descritto 2. In breve, coppie di iniziare ad allevare topi isogeniche e verificare la presenza di collegare (la prova del coito) ogni giorno. Separare le femmine collegato e CO 2-li eutanasia il giorno 15 di pregnAncy (osservazione della spina è il giorno 1 di gravidanza). Rimuovere gli embrioni e il timo. Posizionare il timo embrionale in PBS freddo fino al trasferimento.
- Per eseguire il trapianto di timo, anestetizzare BM-destinatario topi nudi con ketamin (120 mg / g di peso del mouse) / xylazina (16 mg / g di peso del mouse) e tenerli su di una piastra elettrica a 37 ° C fino a quando non si inconscio.
- Esporre chirurgicamente il rene per eseguire il trapianto di timo. In primo luogo scrub la pelle con ChloraPrep (CareFusion Inc.) e il 70% di etanolo. Poi, fare un 1 cm taglio sulla pelle del dorso-laterale parte del corpo dell'animale, 2 mm sotto l'ultima costola toracica.
- Tagliare la cavità peritoneale ed estrarre il rene di questa cavità. Fai un piccolo taglio superficiale nella capsula renale con una lama da bisturi. Utilizzando pinze con una punta molto sottile fare una sacca sotto la capsula renale del mouse destinatario e aggiungere fino a 4 lobi del timo in questo sacchetto.
- Mettere il rene b ack al suo posto, sutura la cavità peritoneale con uno o due punti, e quindi chiudere la pelle del mouse utilizzando lo stesso metodo di sutura. In alternativa, suture può essere fatto utilizzando colla chirurgica.
- Iniettare analgesici (Butorfanolo a 5 mg / kg) per via sottocutanea a destra dopo aver terminato l'intervento chirurgico per evitare il dolore degli animali e tenere gli animali in una piastra elettrica fino a quando iniziano a riprendersi dall'anestesia. I topi sono in gabbia individuale per i primi 3 giorni dopo il trapianto per evitare che i compagni gabbia di rimuovere i punti. Rimozione punti di sutura dopo 1 settimana.
- Topi nudi non hanno cellule T. Pertanto, è possibile valutare l'accettazione timo innesto monitorando la percentuale di CD4 + e CD8 + cellule T nel sangue. Una volta alla settimana, 2 settimane dopo il trapianto di timo, sanguinare gli animali e la macchia di sangue con anti-CD4 e anticorpi monoclonali anti-CD8 (MAbs). Quando i CD4: CD8 rapporto è di circa 2:1, il timo trapiantato è pienamente funzionale (Figura 1).
Preparare tutto il materiale necessario in anticipo e metterle da parte.
- Anestetizzare gli animali con ketamin / xylazina (stessi dosaggi indicati al punto 1.5) e metterli su una piastra elettrica a 37 ° C. Iniettare 100 ml di rodamina B isotiocianato-destrano (20 mg / ml in PBS) per via endovenosa per permettere la visualizzazione futura del flusso sanguigno.
- Esporre il rene trapiantato che contiene il timo secondo il protocollo precedentemente descritto al punto 1.6.
- Per evitare che il rene di tornare nella sua posizione originale, chiudere i lati laterali della incisione cutanea con punti di sutura.
- Posizionare un pezzo di PBS-cotone imbevuto sulla parte superiore dell'organo per mantenerlo umido.
- Mettete il termoforo sulla parte superiore del palco titolare animale (Figura 2A).
- Mettere l'animale in cima alla piastra elettrica nel supporto animale, fino organo (Figura 2B).
- Pizzicare l'organo, in entrambi i lati con una pinza mfacciata di foglio di alluminio sottile (Figura 2C).
- Chiudere il detentore degli animali e posizionare la sonda in alto riscaldatore il più vicino possibile al tessuto (Figura 2D). Questa sonda riscaldatore misura costantemente la temperatura dell'organo e invia queste informazioni al riscaldatore per regolare la corrente elettrica, mantenendolo a 37 ° C.
- Rimuovere il PBS-cotone imbevuto e aggiungere basso punto di fusione di agarosio (2% in PBS) a 30 ° C sulla parte superiore della vostra preparazione.
- Coprire l'intera preparazione con il riscaldatore superiore (Figura 2E). In apertura di questo riscaldamento vi è il coprioggetti isolare l'agarosio dall'obiettivo (Figura 2F). Monitorare l'anestesia del mouse e iniettare una mezza dose di richiamo ogni 40 min. Dopo l'acquisizione delle immagini, l'eutanasia con l'animale di CO 2.
Nota: le immagini della clip foglio di alluminio e il riscaldatore superiore è presentato in Figura 3.
3. A due fotoni di acquisizione immagini
Abbiamo usato un montante "Prairie Ultima XY" microscopio a due fotoni. Il nostro sistema è equipaggiato con un laser Ti: zaffiro, quattro PMT superiore per il controllo simultaneo fino a 4 canali acquisizioni e un obiettivo 20x immersione in acqua.
- Accendere il laser Ti: zaffiro e il sistema intero microscopio.
- Aggiungi specchi dicroici e set di filtri in base alla lunghezza d'onda desiderata. Nel nostro caso abbiamo usato una Olympus-BX2 titolare Chroma contenente un specchio dicroico 565 nm, una 525/50 nm filtro (per Foxp3-GFP segnale), e un 595/50 nm filtro (per Destrano-Rodamina-B del segnale all'interno dei vasi sanguigni ). La gamma di lunghezze d'onda laser utilizzato è stato tra i 880-900 nm.
- Aggiungere il detentore degli animali al microscopio, collegare e accendere tutte le stufe, aggiungere acqua sul diaframma riscaldatore superiore, con attenzione abbassare l'obiettivo in acqua, e concentrarsi su una nave o di alcune GFP-Tregs.
- Con il microscopio x, y, z di controllo esterno, in modo rapido sondaggio il tessuto per individuare una regione di interesse.
- Regolare il guadagno del PMT per ottimizzare la separazione dei colori e minimizzare la quantità di laser necessario a conseguire segnale sufficiente rispetto alla media. Tenta di utilizzare la quantità minima di laser per evitare foto-danneggiamento del tessuto.
- Una volta che la regione di interesse si trova, iniziare time-lapse imaging. Nel nostro caso, un tipico 5D (x, y, z, t, e il colore) protocollo di acquisizione consiste nell'acquisizione immagini sequenziali di un micron, profondità 50 del volume del tessuto, suddivisi in 4,0 micron z-gradini, x e y lunghezza di 140 micron ciascuno. Ogni volume è di circa 30 secondi per essere acquisita. Pertanto, il 60 acquisizioni che si esibiranno per 30 minuti di acquisizione delle immagini.
- Trasferire i dati al server istituzionali e utilizzare ImageJ, Imaris, Volocity o software per eseguire il rendering multi-dimensionale e il monitoraggio delle cellule.
4. Rappresentante Risultati
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Figura 1. . Embrionali accettazione timo e la funzione Dopo BM recuperare, timo embrionali sono state trapiantate a BM animali ricostituito, due settimane dopo il trapianto di timo, questi topi sono stati dissanguati una volta alla settimana per monitorare la percentuali dei sottotipi di cellule T con la colorazione anti-CD4 o anti-CD8 MAbs. Abbiamo considerato il timo è stato accettato con successo negli animali con un CD4: CD8 rapporto intorno 1.5-2.0:1 (A). Per confermare la sua funzionalità, abbiamo sacrificato qualche timo-trapiantati animali e confrontato la percentuale delle diverse sottopopolazioni timocita con i topi WT (B). Le percentuali di doppio negativo (DN, CD4 - CD8 - timociti) sottopopolazioni (dalla colorazione con anticorpi anti-CD25 e anti-CD44 MAbs), doppio-positivi (DP; CD4 + CD8 + timociti) e single-positivi (SP) CD4 + o CD8 + timociti erano simili tra questi animali.
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Figura 2. Titolare di assemblaggio degli animali. Dopo profondamente anestetizzati, l'animale viene messo in cima ad una piastra elettrica, precedentemente montato sulla parte superiore del palco titolare animale (A). Il rene trapiantato contenente il timo è rivolto verso l'alto (B). Un morsetto di alluminio pizzichi delicatamente il rene intero (C) per tenerlo in posizione. Fig. 1C inserire mostra in dettaglio il morsetto. La parte superiore del supporto animale sia messo in atto (D). Il PBS-cotone imbevuto viene rimosso dalla parte superiore dell'organo, sostituito da calde basso punto di fusione agarosio, e il riscaldatore superiore è aggiunto (E). Infine, tutta l'assemblea è trasferito al microscopio, qui rappresentato dalla responsabilità oggettiva (F).
Figura 3. Dettagli di parti titolare. Queste immagini mostrano la fascetta foglio di alluminio (A) che fissano il rene (B). Nota anche la regione dove si trova il timo trapiantato. Questo indica approssimativamente la regioneper tagliare la capsula timo e fare la tasca per mettere il timo embrionale. Il coprioggetti riscaldatore superiore (C) è stato fissato con colla al silicone per la sua parte in basso (D).
Movie 1. Intravitale immagini di Foxp3-GFP + timociti all'interno del timo dove erano custoditi i livelli fisiologici di ossigenazione e temperatura (37 ° C) durante tutto il processo. Si noti il flusso di sangue e il movimento di Tregs. Queste velocità può essere misurata e confrontata con i dati pubblicati. Clicca qui per visualizzare il filmato.
Movie 2. Intravitale imaging di Tregs all'interno di un timo, dove sono state acquisite le immagini a 30 ° C. Si noti l'assenza di movimento e la forma rotonda delle celle, nonostante il mantenimento del flusso sanguigno. Clicca qui per visualizzare il filmato.
Discussion
In questo lavoro abbiamo dimostrato le procedure per l'imaging a due fotoni di timociti all'interno di un animale vivo. Abbiamo anche descritto alcuni parametri che si dovrebbe controllare attentamente, come la continuazione del flusso sanguigno e il mantenimento della temperatura dell'organo durante le procedure di imaging. Tuttavia, nonostante gli sforzi attenzione a mantenere l'organo stabile, artefatti da movimento come "organo alla deriva" può verificarsi. Correzione delle immagini posteriore può essere eseguita dallo sviluppo di algoritmi specificamente progettati per questo scopo. Ulteriori analisi di immagine potrebbe anche essere fonte di nuovi protocolli di sviluppo che cerca di minimizzare gli errori.
Il timo è l'organo dove si producono tutte le cellule T e, quindi, è l'organo dove immunologi interessati a capire la generazione di γδ, CD4, CD8 o cellule T si concentrerà la loro attenzione. Maggior parte degli studi riguardanti le cellule T sono basate su differenze nei numeri e / o la stabilità di questi cells dopo diverse in vitro / in vivo manipolazioni. Tuttavia, solo dopo la visualizzazione in vivo, abbiamo potuto osservare l'interazione tra le cellule del sistema immunitario coinvolte nel mantenimento dell'omeostasi 3-7. Pertanto, l'osservazione in vivo di timociti è probabilmente una delle informazioni più importanti mancanti per comprendere meglio la biologia delle cellule T. Intravitale TPM fornisce un quadro dettagliato dei movimenti e le interazioni delle cellule T e qui si dimostra come può essere utilizzato per studi dettagliati timocita. Tuttavia, ogni tecnica ha i suoi limiti. Mentre intravitale acquisizione di immagini è il sistema più accurato per riflettere il comportamento delle cellule all'interno del corpo, è anche vero che l'acquisizione di immagini di organi espiantati è meno laborioso ed è stato utilizzato per raccogliere informazioni importanti sul sistema immunitario 8,9. Inoltre, non si può negare metodi di imaging intravitale richiedere un intervento chirurgico per esporre i tessuti e vasi sanguigni in animali anestetizzati,che di per sé potrebbe causare una alterazione della fisiologia dell'organo intero 10. Tuttavia, ci sono in modo non invasivo i metodi che aboliscono gli artefatti causati dalla procedura chirurgica 11 e nuovi metodi sono in fase di sviluppo che meglio preparare in anticipo gli animali da utilizzare 12. Pertanto, le nuove procedure chirurgiche e pedaggi ridurrà al minimo o aggirare le limitazioni reali di acquisizione immagini intravitale e diventano sempre più accessibili alla comunità scientifica.
Abbiamo dimostrato che il metodo che abbiamo descritto è fattibile e riporta tutto in vivo manipolazioni sistemici, la somministrazione di questi farmaci, che abbiamo usato. Quindi, si consiglia l'uso di questo metodo insieme a tecniche di ex vivo già disponibili al fine di integrare e rafforzare ulteriormente gli studi sullo sviluppo timociti.
Disclosures
Non abbiamo nulla da rivelare.
Acknowledgments
Vorremmo ringraziare il Dott. Davide Olivieri per la revisione critica di questo manoscritto, il Dr. Moreno Nuno per l'aiuto logistico per costruire il nostro titolare animali e cuscinetti termici e il Dott. Vijay K. Kuchroo per la donazione tipo di Foxp3-KI GFP / GFP topi. Questo lavoro è supportato da "Fundação para Ciência e Tecnologia" (FCT, Portogallo), concedere # PTDC/EBB-BIO/115514/2009.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Rhodamine B ishothiocyanate-Dextran | Sigma-Aldrich | R9379 | prepare stock at 20 mg/ml | |
| Two-photon microscope | Prairie Technologies Inc. | Prairie Ultima X-Y | ||
| Ti:Sapphire laser | Coherent, Inc. | Chameleon Ultra Family | ||
| 20x/1.00 NA immersion objective | Olympus Inc. | XLUMPLFLN 20XW | ||
| Holder (Filters/Dichroic) | Chroma Technology Corp. | 91018 BX2 (U-MF2) | ||
| 525 nm/50 filter | Chroma Technology Corp. | ET525/50m | ||
| 595 nm/50 filter | Chroma Technology Corp. | ET595/50m | ||
| 565 nm dichroic | Chroma Technology Corp. | 565dcxr | ||
| Imaris software | Bitplane AG Inc. | Imaris | ||
| Volocity | PerkinElmer Inc. | Volocity | ||
| ImageJ | NIH, USA | ImageJ |
References
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