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Neuroscience

बनती है और का उपयोग यौगिकों की bioactivity के लिए इलैक्ट्रोफिजियोलॉजी स्क्रीन करने के लिए परख Nanoinjection ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर विशालकाय फाइबर सिस्टम

Published: April 15, 2012 doi: 10.3791/3597
Automatic Translation
1, 2, 1, 2, 1
1Department of Biological Sciences, Florida Atlantic University, 2Department of Chemistry & Biochemistry, Florida Atlantic University

Summary

एक तेजी से

Protocol

1. इलैक्ट्रोफिजियोलॉजी रिग सेट अप

  1. इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी रिग सेट अप के लिए आवश्यक उपकरणों के विस्तार में Augustin एट अल द्वारा वर्णित है. इस जर्नल में 14. Electrophysiological जरूरत apparatuses के एक विस्तृत विवरण के लिए इस अनुच्छेद के लिए उल्लेख कृपया.
  2. एक छठे micromanipulator है, जो nanoinjector धारण जोड़कर पहले वर्णित इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी सेट अप रिग 14 को संशोधित करें. यह दो उत्तेजक इलेक्ट्रोड micromanipulators के बीच में रखा जाना चाहिए चित्रा 2 में दिखाया के रूप में पशु के सिर के लिए आसान पहुँच के लिए.
  3. प्रयोग शुरू करने से पहले सुनिश्चित करने के लिए, कि आप सभी micromanipulators साथ एक रोटेशन के सभी अक्षों पर आरामदायक श्रृंखला है, और है कि सभी के रूप में के रूप में अच्छी तरह से इंजेक्शन micropipette (चरण 2 देखें) इलेक्ट्रोड जानवर तक पहुँच सकते हैं.

2. सेट अप nanoinjection के

  1. सेट अप एक nanoinjection Nanoliter2000 (विश्व precisi की आवश्यकताउपकरण पर, Sarasota, FL, संयुक्त राज्य अमरीका) या सुई लगानेवाला के समान प्रकार है कि, nanoliter मात्रा में नियंत्रित इंजेक्शन की अनुमति देता है.
  2. इंजेक्शन सुई का उपयोग करते हुए कांच 80-100 MΩ का प्रतिरोध करने के लिए उन्हें एक इलेक्ट्रोड डांड़ी के साथ खींच कर सुई लगानेवाला साथ आपूर्ति micropipettes तैयार.
  3. चिकनी इंजेक्शन के लिए यह एक एक 45 डिग्री के कोण पर 11-17 माइक्रोन खोलने (चित्रा 3) के लिए micropipettes उठाव के लिए आवश्यक है.
  4. धीरे धीरे सिंथेटिक तेल हैमिल्टन सिरिंज का उपयोग कर रूप में Nanoliter2000 पुस्तिका द्वारा निर्देश दिए, यह सुनिश्चित करना कि कोई हवाई बुलबुले मौजूद हैं साथ इंजेक्शन micropipette backfill.
  5. ध्यान से nanoinjector पर micropipette सुरक्षित और इसे तैयार करने के लिए अतिरिक्त तेल खाली के रूप में Nanoliter2000 पुस्तिका द्वारा निर्देश यौगिक लोड.
  6. Micromanipulator पर सुई लगानेवाला प्लेस और मिश्रित लोड के रूप में Nanoliter2000 पुस्तिका में निर्देश दिए. यकीन है कि इस दौरान micropipette की नोक तोड़ नहीं हैप्रक्रिया.
  7. सुई लगानेवाला नियंत्रण बॉक्स में इंजेक्शन के रूप में Nanoliter2000 पुस्तिका द्वारा निर्देश nanoliters की इच्छित राशि निर्धारित करें. कृपया ध्यान दें कि कुल राशि इंजेक्शन 100 nl से अधिक नहीं होनी चाहिए. हमने पाया है कि खारा नियंत्रण के समाधान के बड़ी मात्रा में GFS सर्किट के समारोह को प्रभावित कर सकता है.
  8. यह सुई लगानेवाला रिकॉर्डिंग अधिग्रहण के दौरान नियंत्रण बॉक्स से ही इंजेक्शन के अपवाद के साथ, अनप्लग के बाद से बिजली की आपूर्ति nanoinjector की रिकॉर्डिंग, जो पृष्ठभूमि शोर (चित्रा 4) के रूप में दिखाई देता है के साथ हस्तक्षेप करने के लिए महत्वपूर्ण है. हालांकि, बॉक्स नियंत्रण बिजली की आपूर्ति नहीं डिस्कनेक्ट कर के रूप में यह फिर से सेट हो जाएगा.

3. ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर तैयार

  1. चतनाशून्य करना सीओ 2 के साथ या बर्फ पर 2 से 6 दिन पुराने मक्खियों के रूप में पहले 14,15 वर्णित है.
  2. एक बार स्थिर, चिमटी की एक जोड़ी का उपयोग करने के लिए एक छोटी सी प्लेट वाई करने के लिए पशु हस्तांतरणयह अपने पैरों से उठा वें नरम दंत मोम. कृपया ध्यान दें कि एक पुरुष फल मक्खी मिलीग्राम 1.0 के बारे में वजन और एक महिला फल मक्खी 1.2 मिलीग्राम के बारे में वजन का होता है, इस प्रकार यौगिक के लिए शरीर के वजन के अनुपात पुरुष बनाम महिला मक्खियों में अलग है. इसलिए, यह प्रयोगों के लिए केवल एक लिंग का उपयोग करने के लिए सिफारिश की है.
  3. जैसा कि पहले 14,15 वर्णित है, ध्यान से मक्खी पृष्ठीय पक्ष माउंट ऊपर और यह सुनिश्चित करें कि छाती और सिर नरम दंत चिकित्सा शरीर के चारों ओर रखा मोम के साथ स्थिर कर रहे हैं. ध्यान से पंख फैला बाहर ताकि वे छाती (चित्रा 2, सी) के लिए सीधा रखना है. मक्खी संभव के रूप में कम नुकसान के रूप में के साथ रखा जाना चाहिए.

4. बनती Nanoinjection / इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी

  1. उत्तेजक इलेक्ट्रोड की ओर अपने सिर के साथ इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी रिग पर घुड़सवार उड़ रखें.
  2. इसी उत्तेजक जमीन, और रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड के साथ पशु कोचना के रूप में पहले 14,15 (एफ वर्णित2 igure, सी). जब तक अन्यथा वांछित जगह एक DLM और टीटीएम मांसपेशियों में अन्य में रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड. DLM मांसपेशी पूर्वकाल Dorso केन्द्रीय बाल और मक्खी के midline के बीच छाती में स्थित है. टीटीएम मांसपेशियों पंख संलग्नक के पास स्थित है, पीछे और पूर्वकाल 7 मक्खी के ऊपर अर्थ का उपसर्ग डैना - संबंधी बाल के बीच.
  3. औसत दर्जे का सिर के पीछे भाग पर स्थित है, लेकिन करते इंजेक्षन (चित्रा 2, सी) नहीं अभी तक तीन ocelli के केंद्र के साथ परिसर युक्त इंजेक्शन micropipette संरेखित करें.
  4. से पहले परिसर इंजेक्शन टीटीएम और GF GF की आधारभूत रिकॉर्डिंग प्राप्त करने के लिए मस्तिष्क की उत्तेजना के माध्यम से विशालकाय फाइबर प्रणाली (GFS, चित्रा 1) के रास्ते DLM. ऐसा करने के लिए, 10 उत्तेजनाओं के 10 गाड़ियों (40-50 एम वी) 0.03 एमएस की अवधि के लिए 100 हर्ट्ज पर 14,15 गाड़ियों (चित्रा 4) के बीच एक 1 सेकंड की देरी के साथ दिए गए प्रत्येक के साथ विशालकाय फाइबर (GFS) को सक्रिय करें. जंगली प्रकार श मक्खियोंould उत्तेजना की इस दर पर दोनों DLM और टीटीएम रास्ते के लिए एक से एक का पालन करने में सक्षम हो. मक्खी त्यागें अगर टीटीएम रास्ते DLM और GF GF एक 1:1 के अनुपात में 100 हर्ट्ज उत्तेजना का पालन नहीं करते.
  5. 1 हर्ट्ज पर एक दालों (चित्रा 4) के साथ GF की निरंतर उत्तेजना के लिए स्विच.
  6. जल्दी से नियंत्रण बॉक्स में सुई लगानेवाला प्लग. हालांकि पृष्ठभूमि शोर 1 हर्ट्ज उत्तेजना रिकॉर्डिंग के साथ हस्तक्षेप करेगा, यह बंद नहीं करते हैं.
  7. बस cuticule नीचे मक्खी के सिर कैप्सूल में ध्यान से इंजेक्शन micropipette को सम्मिलित करने के लिए, और मक्खी की hemolymph में परिसर के वांछित राशि इंजेक्षन जबकि 1 हर्ट्ज (चित्रा 4) उत्तेजना को बनाए रखने. मक्खी के खुले संचार प्रणाली के कारण, पूरे तंत्रिका तंत्र सेकंड के भीतर मिश्रित करने के लिए अवगत कराया जाएगा. हालांकि एक विशेष इंजेक्शन साइट hemolymph में यौगिकों देने के लिए महत्वपूर्ण नहीं है, हम क्षेत्र ocelli की, जो स्थानीयकरण कर रहे हैं लगता हैघ सिर कैप्सूल की सबसे पृष्ठीय पक्ष, एक सुविधाजनक साइट है कि एक आसान इंजेक्शन है कि परिसर के तेजी से और भी वितरण करने के लिए सुराग के लिए अनुमति देता है पर औसत दर्जे का.
  8. तुरंत इंजेक्शन की साइट से इंजेक्शन micropipette हटाने और नियंत्रण बॉक्स से सुई लगानेवाला हाल चलाना जबकि इंजेक्शन के बाद 1 मिनट (चित्रा 4) के लिए 1 हर्ट्ज GF उत्तेजना जारी है.
  9. GFS पर यौगिकों के आदेश में और अधिक सूक्ष्म प्रभाव प्रकट करने के लिए, गाड़ियों के बीच एक 1 सेकंड की देरी के साथ 10 उत्तेजनाओं के 10 गाड़ियों के साथ विशालकाय फाइबर (GFS) 100 हर्ट्ज पर तनाव. 15 मिनट (चित्रा 4) के लिए इस प्रतिमान हर 5 मिनट के साथ GF रास्ते के समारोह का परीक्षण करने के लिए जारी रखें. हालांकि, छोटे अंतराल या लंबे समय तक निगरानी अवधि भी संभव है.
  10. आदेश में परीक्षण करने के लिए कि यौगिक GFS के neuromuscular जंक्शनों (NMJs) पर एक प्रभाव है, और संभवतः नीचे परिसर के प्रभाव को कम करने के लिए, सक्रिय मोटर न्यूरॉन्स निदेशक के लिए आगे बढ़ेंtly वक्ष उत्तेजना के द्वारा. इस के लिए, आँखों से उत्तेजक इलेक्ट्रोड को हटाने और उन्हें छाती के पूर्वकाल पक्षों पर बदलने के क्रम में 10 उत्तेजनाओं के 10 गाड़ियों के साथ 100 हर्ट्ज पर मोटर न्यूरॉन्स को प्रोत्साहित.

नोट: वीडियो में दिखाया गया इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी निशान शुद्ध डाई के इंजेक्शन के प्रभाव के लिए अनुरूप नहीं है.

5. प्रतिनिधि परिणाम

साई पर एक विरोधी के प्रभाव विशालकाय फाइबर प्रणाली के synapse DLM

Methyllycaconitine साइट्रेट (विधायक) nAChR प्रतिपक्षी कि α7 nAChR उपप्रकारों के लिए विशिष्ट है. साई GF - DLM मार्ग में synapse DLMn के समुचित कार्य के लिए Dα7 nAChR उप प्रकार पर निर्भर करता है, जबकि Dα7 nAChR उप प्रकार की आनुवंशिक हटाने GF - टीटीएम 5,6 मार्ग पर कोई प्रभाव नहीं है. आदेश में और हमारे परख की विशिष्टता और संवेदनशीलता प्रदर्शित करने के लिए हम विभिन्न सांद्रता (0, 0.02, 0.04, 0 पर विधायक इंजेक्शन.पता = लवणीय उपचार के लिए 15); 08, 0.12 एनजी / मिलीग्राम, 46 nl (n = 10 प्रति यौगिक उपचार पशु के सिर में) इंजेक्शन. केवल पुरुष मक्खियों (जंगली प्रकार के जीनोटाइप जंगली 10E) इस्तेमाल किया गया, और परिसर के प्रभाव इंजेक्शन के बाद 15 मिनट की कुल के लिए नजर रखी थी.

चित्रा 5 आधारभूत इंजेक्शन से पहले प्राप्त रिकॉर्डिंग और विधायक और खारा नियंत्रण समाधान के लिए प्रतिक्रिया में इंजेक्शन के बाद प्राप्त उन के बीच अंतर दर्शाया गया है. हमने पाया है कि विधायक का इंजेक्शन GF - DLM मार्ग की अक्षमता GFS के मस्तिष्क में stimulations 100 हर्ट्ज पर एक - एक जबकि GF - टीटीएम मार्ग अप्रभावित पालन में हुई. (चित्रा 5, शीर्ष और मध्यम ट्रेस, खारा [0 एनजी मिलीग्राम / नियंत्रण और हर समय बिंदु पर विधायक के विभिन्न सांद्रता के बीच प्रदर्शन किया जब तक डेटा गैर पैरामीट्रिक [सामान्य और बराबर प्रसरण का परीक्षण] टी परीक्षण, अन्यथा हम का उपयोग करें एक रैंक मान - व्हिटनी योग टेस्ट * पी <0.001). हालांकि, एक आर एक एकDLM के esponse जब मोटर न्यूरॉन्स सीधे प्रेरित थे (चित्रा 5, नीचे का पता लगाने) मनाया गया, प्रदर्शन है कि DLM और टीटीएम के में NMJ समारोह विधायक से प्रभावित नहीं है. विधायक इंजेक्शन के बाद 0.04, 0.08 और 0.12 एनजी / विधायक की मिलीग्राम इंजेक्शन के लिए अपनी अधिकतम प्रभाव 1 मिनट तक पहुँचने के आगे कोई महत्वपूर्ण परिवर्तन के रूप में परीक्षण अवधि के बाद 15 मिनट के दौरान नोट कर रहे थे दिखाई दिया. इसके अलावा, यौगिक 0.08 एनजी / मिलीग्राम पर अधिकतम प्रभाव पहुँच के बाद से मजबूत प्रतिक्रियाओं 0.12 एनजी / मिलीग्राम की उच्च खुराक के साथ नहीं मनाया गया.

चित्रा 1
आकृति 1. विशालकाय फाइबर प्रणाली (GFS) का विशालकाय फाइबर सिस्टम आरेख विशालकाय (GFS, लाल रंग में दिखाया गया) विद्युत synapse (गैप जंक्शनों) के रूप में अच्छी तरह से रासायनिक पर (cholinergic) एक परिधीय Synapsing interneuron के फाइबर (साई, हरे रंग में दिखाया गया). और Tergo Trochanteral स्नायु (TTMn, पीले रंग में दिखाया गया है) न्यूरॉन 5. पुनश्चमैं DLMn कनेक्शन (पृष्ठीय अनुदैर्ध्य बलवान न्यूरॉन, नीले रंग में दिखाया गया) Dα7 nAChR 6 उप प्रकार पर निर्भर करता है. अंत में कूद (टीटीएम, बैंगनी रंग में दिखाया गया है) और उड़ान की मांसपेशियों पर TTMn और DLMn (DLM, बैंगनी रंग में दिखाया गया है) (NMJ) के neuromuscular जंक्शन glutamatergic है.

नोट: साई कनेक्शन के लिए GF दोनों विद्युत और रासायनिक है. हालांकि, shakB म्यूटेंट (जो अंतराल के जंक्शनों की कमी है) में, कोई जवाब नहीं GFS के मस्तिष्क में उत्तेजना पर DLM से दर्ज किया जा सकता है, प्रदर्शन है कि बिजली के कनेक्शन के अभाव में रासायनिक घटक में कार्रवाई की क्षमता पैदा करने के लिए पर्याप्त नहीं है 5,16-18 साई. क्योंकि साई कनेक्शन के लिए GF अंतर जंक्शन निर्भर है, यह आंकड़ा केवल सादगी के कारणों के लिए synapse में गैप जंक्शन से पता चलता है.

चित्रा 2
चित्रा 2.

है micromanipulatorsएट ऊपर.

  1. एक पहले प्रकाशित 14 प्रोटोकॉल के एक संशोधित सेट अप के लिए एक साथ nanoinjections साथ बनती GFS रिकॉर्डिंग के लिए इंजेक्शन micromanipulator फिट करने के लिए प्रयोग किया जाता है. घुड़सवार मक्खी तैयारी experimenter की ओर उड़ान भरने के सिर के साथ उन्मुख है. इंजेक्शन micromanipulator (# 1) experimenter के सामने में टंगस्टन उत्तेजक इलेक्ट्रोड (# 2 # 3) के लिए दो manipulators के बीच रखा गया है. कांच रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड (# 4 और 5) के लिए दो micromanipulators बाएँ और दाएँ पक्ष पर रखा जाता है, क्रमशः. टंगस्टन जमीन इलेक्ट्रोड (# 6) के लिए micromanipulator पीठ में दूर बाईं ओर (यहाँ दिखाया गया है) पर या सही पक्ष पर रखा है.
  2. एक करीबी विभिन्न इलेक्ट्रोड और इंजेक्शन micropipette की व्यवस्था के ऊपर से दृश्य.
  3. एक ठीक से घुड़सवार डी. मेलानोगास्टर इलेक्ट्रोड और इंजेक्शन इंजेक्शन के लिए तैयार micropipette के साथ impaled. सूचना है कि पशु के शरीरअपनी छाती क्षैतिज और अपने पंख के साथ घुड़सवार बाहर फैला है. मोम सुरक्षित रूप से अपने शरीर के चारों ओर लपेटा जाता है बढ़ने से पशु को रोकने. इसके अतिरिक्त, जमीन इलेक्ट्रोड (# 6, पेट में), कांच रिकॉर्डिंग (# 4 और 5, छाती में, अंधेरे की रूपरेखा पर प्रकाश डाला द्वारा), इलेक्ट्रोड और उत्तेजक इलेक्ट्रोड (# 2 और # 3, हर आँख में ) जगह में से impaled कर रहे हैं, के रूप में पहले 14 में वर्णित है. इंजेक्शन micropipette (# 1) ठीक के तीन ocelli (परिक्रमा) के केंद्र के साथ गठबंधन किया है. इंजेक्शन micropipette की प्रविष्टि इस क्षेत्र में रखा जाना चाहिए.

चित्रा 3
चित्रा 3. Beveled इंजेक्शन micropipette. ठीक beveled micropipette के एक चित्र यहाँ दिखाया गया है. इलेक्ट्रोड खोलने एक 45 डिग्री के कोण पर beveled किया जाना चाहिए और 11 से 17 माइक्रोन के बीच एक खोलने है. एक उचित beveled इंजेक्शन micropipette की न्यूनतम घ के साथ एक चिकनी इंजेक्शन के लिए महत्वपूर्ण हैमक्खी के लिए amage.

चित्रा 4
चित्रा 4. प्रोटोकॉल / nanoinjection इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी की समग्र योजना / nanoinjection इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी प्रोटोकॉल के लिए समग्र योजना का एक प्रतिनिधि चित्र. 100 हर्ट्ज पर विशालकाय (GFS) प्रत्येक 10 (केवल एक गाड़ी यहाँ दिखाया) उत्तेजनाओं की 10 गाड़ियों के साथ फाइबर उत्तेजक द्वारा एक आधारभूत रिकॉर्डिंग प्राप्त करने के द्वारा शुरू करो. इंजेक्शन से पहले, 1 हर्ट्ज stimulations एक दूसरे के अलावा शुरू हो. इंजेक्शन समय (जबकि सुई लगानेवाला में नियंत्रण बॉक्स में खामियों को दूर किया है) के दौरान, आप महत्वपूर्ण पृष्ठभूमि शोर का पालन करेंगे है, तथापि, रिकॉर्डिंग नहीं बंद है. इंजेक्शन के बाद (और सुई लगानेवाला नियंत्रण बॉक्स से unplugged है), के बारे में 1 मिनट के लिए 1 हर्ट्ज उत्तेजना जारी रखने के. अंत में, 100 हर्ट्ज पर 10 उत्तेजनाओं के 10 गाड़ियों के साथ GFS और तनाव के लिए 15 मिनट के लिए इस प्रतिमान हर 5 मिनट के साथ GF रास्ते के समारोह का परीक्षण जारी रखने के लिए आगे बढ़ना. नोट: रिकॉर्डिंग wअरे करने के लिए समग्र योजना बनाने छेड़छाड़ और एक विशिष्ट परिणाम प्राप्त का प्रतिनिधित्व नहीं है. पैमाने पर करने के लिए नहीं, नहीं सभी निशान को दिखाया गया है. बड़ी छवि के लिए यहाँ क्लिक करें .

चित्रा 5
चित्रा 5. GFS में विधायक के प्रभाव.

  1. फल मक्खी के GF - DLM मार्ग पर α7 nAChR प्रतिपक्षी Methyllycaconitine (विधायक) अलग सांद्रता (0, 0.02, 0.04, 0.08, साइट्रेट के प्रभाव का एक आलेखी चित्रण 0.12 एनजी / मिलीग्राम n = 10 प्रति यौगिक उपचार. n = लवणीय उपचार के लिए 15). इंजेक्शन के बाद केवल एक मिनट, एक महत्वपूर्ण और तत्काल प्रभाव 0.04 एनजी / विधायक के मिलीग्राम के साथ देखा गया था. एक महत्वपूर्ण प्रभाव भी 0.8ng/mg और GFS की 100Hz उत्तेजना में विधायक की 0.12ng/mg के साथ देखा गया था. खारा नियंत्रण और 0.02 एनजी / विधायक के मिलीग्राम के बीच कोई महत्वपूर्ण अंतर नोट किया गया था. इसके अतिरिक्त, मैं बदल नहींपता 1 मिनट के बाद इंजेक्शन के बाद प्रभाव का परीक्षण किया (15 मिनट) समय के दौरान देखा गया था. खारा (0 एनजी / मिलीग्राम) नियंत्रण और हर समय बिंदु पर विधायक के विभिन्न सांद्रता के बीच एक टी - परीक्षण किया गया था. SEM, * पी <.001 - स्तर मतलब + / के रूप में रिपोर्ट कर रहे हैं.
  2. 100 हर्ट्ज उत्तेजना में DLM प्रतिक्रियाओं का नमूना निशान. शीर्ष निशान GF उत्तेजना पर मस्तिष्क में विधायक इंजेक्शन से पहले मांसपेशी की प्रतिक्रियाओं से पता चलता है. सूचना है कि मांसपेशियों को प्रत्येक 100 हर्ट्ज पर एक के लिए एक प्रोत्साहन के लिए प्रतिक्रिया करने में सक्षम है. मध्य का पता लगाने के बाद विधायक इंजेक्शन (0.12 एनजी / मिलीग्राम) DLM की प्रतिक्रियाओं को प्रदर्शित करता है. सूचना है कि मांसपेशियों प्रत्येक 100 हर्ट्ज पर एक के लिए एक प्रोत्साहन के लिए प्रतिक्रिया करने में सक्षम नहीं है. (तारांकन). नीचे का पता लगाने छाती में मोटर न्यूरॉन्स की प्रत्यक्ष उत्तेजना पर एक ही तैयारी (0.12 एनजी / मिलीग्राम) की DLM की प्रतिक्रियाओं से पता चलता है. क्योंकि DLM से वक्ष उत्तेजना के साथ 100 हर्ट्ज पर एक से एक प्रतिक्रिया, मस्तिष्क stimulations के साथ प्रतिक्रियाओं की विफलता से cholinergic कनेक्शन साई DLMn जिम्मेदार ठहराया जा सकता है.
  3. GF - टीटीएम मार्ग पर अलग सांद्रता विधायक (0, 0.02, 0.04, 0.08, 0.12 एनजी / मिलीग्राम) के साथ प्रभाव का एक ग्राफिक चित्रण. खारा (0 एनजी / मिलीग्राम) और मिश्रित इंजेक्शन के बीच किसी भी समय बिंदु पर कोई महत्वपूर्ण प्रभाव देखा गया. एक टी - परीक्षण खारा (0 एनजी / मिलीग्राम) नियंत्रण और विधायक के विभिन्न सांद्रता के बीच हर समय बिंदु पर प्रदर्शन किया था, * पी <0.001.
  4. 100 हर्ट्ज उत्तेजना में टीटीएम प्रतिक्रियाओं का नमूना निशान. शीर्ष ट्रेस GF सक्रियण पर मस्तिष्क में उत्तेजना के साथ विधायक इंजेक्शन से पहले मांसपेशी की प्रतिक्रियाओं से पता चलता है. सूचना है कि मांसपेशियों के लिए 100 हर्ट्ज पर सभी stimuli करने के लिए प्रतिक्रिया करने में सक्षम है. मध्य ट्रेस विधायक इंजेक्शन के बाद DLM (0.12 एनजी / मिलीग्राम) की प्रतिक्रियाओं से पता चलता है. टीटीएम पेशी से मस्तिष्क में GF की उत्तेजना के लिए एक से रहते हैं. नीचे का पता लगाने छाती में मोटर न्यूरॉन्स (0.12 एनजी / मिलीग्राम) 100 हर्ट्ज उत्तेजना के लिए एक ही तैयारी की टीटीएम की प्रतिक्रियाओं से पता चलता है.

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Discussion

यहाँ प्रस्तुत / nanoinjection इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी bioassay फल मक्खी के तंत्रिका तंत्र में यौगिकों की एक तेजी से जांच के लिए अनुमति देता है. यह vivo में तकनीक है कि परिसर के छोटे मात्रा की आवश्यकता के लिए एक अच्छी तरह से विशेषता neuronal सर्किट में आणविक लक्ष्य की एक किस्म पर एक प्रभाव बटोर में एक उपन्यास है. इस विधि के लिए विभिन्न यौगिकों का bioactivity परीक्षण किया जा सकता अज्ञात विषाक्त पदार्थों से व्यावसायिक रूप से उपलब्ध औषधीय एजेंटों के लिए.

यहाँ हम हमारे परख विधायक, जो फल मक्खी की विशालकाय फाइबर प्रणाली (GFS) (चित्रा 5) पर एक प्रभाव पड़ा का उपयोग करने के समारोह में प्रदर्शन किया. हमने पाया है कि यह चुनिंदा DLM मार्ग GF बाधित नहीं बल्कि टीटीएम मार्ग GF. मोटर न्यूरॉन्स सीधे को सक्रिय कर दिखा दिया कि DLM मार्ग GF में दोष neuromuscular जंक्शन (NMJ) में शिथिलता के कारण नहीं था, लेकिन यह विरोधी effec के साथ संगत था वक्ष उत्तेजना के माध्यम सेविधायक टी Dα7 nAChR उपप्रकारों में साई DLMn गुणसूत्रीयसंयोजन (चित्र 1) में प्रस्तुत करते हैं. हालांकि TTMn कनेक्शन के लिए GF cholinergic होना दिखाया गया था, यह अज्ञात है कि क्या Dα7 nAChR सब यूनिटों इस synapse में मौजूद हैं. इसके अलावा, choline acetyltransferase (चा) जीन या Dα7 nAChR उप प्रकार की आनुवंशिक अनुपस्थिति (Dα7) के जीन एक बिजली 5,6,17,19 जंक्शन के समवर्ती उपस्थिति की वजह से कनेक्शन GF - TTMn के समारोह को बाधित नहीं करता है, 20, मार्ग विधायक से प्रभावित होने की संभावना नहीं बनाता.

मिश्रित इंजेक्शन के बाद, समाधान तुरंत अपनी खुली संचार प्रणाली 21 के कारण पशुओं के पूरे तंत्रिका तंत्र विसर्जित कर दिया जाना चाहिए. अगर ठीक से इंजेक्शन यौगिक आमतौर पर और सेकंड के भीतर छाती और पेट में पहुँचता है, लेकिन एक समरूप फैलाव के एक मिनट के लिए ले जा सकते हैं. हालांकि, अगर यौगिक ठीक hemolymph में इंजेक्शन नहीं है (यानी micropipette डे भी इंजेक्शनep के मस्तिष्क के ऊतकों में जा रहा है) तो पशु भर में धीमी फैलाव मनाया जाता है. जबकि डाई करने के लिए एक उचित इंजेक्शन तकनीक का अभ्यास वीडियो में दिखाया के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है, यह एक के रूप में यह परिसर के गुणों में परिवर्तन और इस तरह इसकी bioactivity के लिए परीक्षण किया जा परिसर के साथ नीले रंग भोजन सह इंजेक्षन नहीं की सिफारिश की है. इसके अतिरिक्त, के बाद से सबसे विलायक के रूप में इस्तेमाल किया समाधान रंग में स्पष्ट (खारा, DMSO के, आदि) कर रहे हैं, यह मुश्किल है कि क्या है या नहीं यौगिक इंजेक्शन सुई से अलग हो गया था. इसलिए, जब एक विशिष्ट यौगिक भंग यह महत्वपूर्ण है करने के लिए सुनिश्चित करें कि यह समाधान में पूरी तरह से चला जाता है, अन्यथा अघुलित कणों इंजेक्शन टिप तेजी से रोकना होगा, तरल पदार्थ का किसी भी इंजेक्शन से रोकने. इसके अलावा, हालांकि परिसर फैलाव hemolymph भर तत्काल हो सकता है, केंद्रीय तंत्रिका तंत्र में लक्ष्य तक पहुँचने, साथ ही इसकी अधिकतम खुराक तक पहुँचने, अब यौगिक के रासायनिक गुणों के आधार पर के रूप में आकार और polarit में, लग सकता हैy, और इसके लिए मक्खी रक्त मस्तिष्क बाधा 22 इस प्रकार तर करने की क्षमता है, यह इंजेक्शन के बाद कई मिनट अज्ञात यौगिकों के संभावित प्रभाव पर नजर रखने के लिए महत्वपूर्ण है क्योंकि विभिन्न यौगिकों, जो समय के साथ कुछ मामलों में वृद्धि हो सकती है शुरुआत प्रभाव के समय में बदलाव हो सकता है . यौगिक है कि पूरी तरह से न्यूरॉन्स के समारोह में ब्लॉक के मजबूत और तत्काल प्रभाव 1 हर्ट्ज पर चालू प्रतिक्रियाओं के साथ पहले से ही देखा जा सकता है, जबकि GFS का उच्च आवृत्तियों (100 हर्ट्ज) में उत्तेजना अधिक सूक्ष्म प्रभाव कम खुराक या के कारण का पता लगाने के लिए प्रयोग किया जाता है एक यौगिक की शक्ति. यदि कोई प्रभाव यौगिक इंजेक्शन के बाद मनाया जाता है यह या तो छोटे दवा की खुराक या तथ्य यह है कि परिसर के विशिष्ट आणविक लक्ष्य GFS में मौजूद नहीं है की वजह से हो सकता है.

इसके अलावा, जब उपन्यास यौगिकों (जैसे conotoxins के रूप में) के लिए एक प्रदर्शन उपकरण के रूप में यहाँ प्रस्तुत bioassay का उपयोग कर यह नोट करना महत्वपूर्ण है कि परख आणविक लक्ष्य में पाया करने के लिए प्रतिबंधित हैमक्खी के GFS. हालांकि परख ही इंजेक्शन परिसर के वास्तविक आणविक लक्ष्य का पता लगाने की अनुमति नहीं देती है, यह GFS भीतर संभावित लक्ष्य के नीचे संकुचन के लिए अनुमति नहीं है. न्यूरॉन्स या मांसपेशियों ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर म्यूटेंट के साथ या आनुवंशिक बातचीत के अध्ययन पर पैच दबाना जैसे अतिरिक्त परीक्षण, इन यौगिकों के विशिष्ट लक्ष्य निर्धारित किया जा सकता है. अंत में, प्रस्तुत रिकॉर्डिंग प्रोटोकॉल GFS का समारोह पर विरोधी प्रभाव का पता लगाने के लिए डिजाइन किया गया था. हालांकि, रिकॉर्डिंग प्रोटोकॉल आसानी से निष्क्रिय परीक्षण अगर GFS जब सर्किट experimenter के द्वारा प्रेरित है मज़बूती से प्रतिक्रिया करने में सक्षम नहीं है बजाय परिसर से प्रेरित प्रतिक्रिया के लिए निगरानी द्वारा जबर्दस्ती का प्रभाव के लिए निगरानी समायोजित हो सकता है.

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Disclosures

ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.

Acknowledgments

हम विशेष Aline Yonezawa में मारी प्रयोगशाला और Godenschwege के प्रयोगशाला, के सदस्यों को स्वीकार करना और टिप्पणी के लिए, इस प्रोटोकॉल के साथ मदद की. इस काम के मस्तिष्क संबंधी विकार के लिए राष्ट्रीय संस्थान और एफएम और टैग करने के लिए स्ट्रोक R21NS06637 अनुदान द्वारा वित्त पोषित किया गया था, अटल बिहारी राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन पुरस्कार 082,925 संख्या, URM द्वारा वित्त पोषित किया गया था: भविष्य के शोधकर्ताओं के लिए एकीकृत जीवविज्ञान.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Recording glass electrodes: borosilicate glass capillaries World Precision Instruments, Inc. 1B100F-4 1.0mm OD, 0.58mm ID
Stimulator Grass Technologies Model S48
Amplifier Getting Instruments, Inc. Model 5A
Data acquisition Software: Digidata Molecular Devices Model 1440A
Data collection software: pCLAMP Molecular Devices Version 10
Stereomicroscope with fiber optic microscope ring illuminator AmScope SM-4T Model HL250-AR
Dissecting scope for mounting AmScope SM-2TZ
Kite Manual Micromanipulator & Tilting Base World Precision Instruments, Inc. Model # M3301 Kite: Model # KITE-M3-L
Drosophila melanogaster Wild 10E genotype (wild type strain) Bloomington Stock center Stock # 3892
Vertical pipette puller David Kopf Instruments Model 700c
Injection glass micropipettes: Borosilicate glass capillaries World Precision Instruments, Inc. Catalogue # 4878 1.14mm OD, 0.5mm ID
Silicon oil Fisher Scientific Catalogue # S159-500
Beveler Sutter Instrument Co. K.T. Brown Type Model # BV-10
Nanoliter2000 World Precision Instruments, Inc. Catalogue # B203XVY
Blue food coloring McCormick & Co. N/A Ingredients: Water, Propylene Glycol, FD&C Blue 1, and 0.1% Propylparaben (preservative).
Methyllycaconitine citrate (MLA) Tocris Bioscience Catalogue # 1029
Plastic wax sticks Hygenic Corporation (Akron Ohio USA)

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References

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तंत्रिका विज्ञान 62 अंक, स्क्रीनिंग, इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी modulatory यौगिकों जैव रसायन
बनती है और का उपयोग यौगिकों की bioactivity के लिए इलैक्ट्रोफिजियोलॉजी स्क्रीन करने के लिए परख Nanoinjection<em> ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर</em> विशालकाय फाइबर सिस्टम
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Mejia, M., Heghinian, M. D., Busch,… More

Mejia, M., Heghinian, M. D., Busch, A., Marí, F., Godenschwege, T. A. Paired Nanoinjection and Electrophysiology Assay to Screen for Bioactivity of Compounds using the Drosophila melanogaster Giant Fiber System. J. Vis. Exp. (62), e3597, doi:10.3791/3597 (2012).

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